Name: Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a realizar Western blot otimizado para apenas 500 células-tronco hematopoiéticas usando lise direta em tampão Laemmli. Este método reduz o uso de animais e permite detectar proteínas específicas em populações celulares raras.

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Institutos nacionais de saúde conceder R01 CA149976 (distante) com suporte a este trabalho.

Todos os procedimentos devem ser efectuados de acordo com orientações de cuidados e uso animal institucional. O procedimento foi desenvolvido para a análise de murino tronco e progenitoras células hematopoiéticas (linfócitos e HPs), mas pode ser adaptado para a análise de outras populações de células.
1. fluxo Cytometry isolamento de linfócitos murino e HPs
<ol><li>Colher células-murino da medula óssea, como descrito na literatura6. Nota: Nos dados apresentados na Figura 1 e Figura 2, foi colhida da medula óssea de camundongos C57BL/6J.</li>
	<li>Execute o esgotamento da linhagem de células de medula óssea usando um kit de depleção de linhagem de rato, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Incube as células com anticorpos contra os marcadores de superfície celular de interesse como descrito7. As experiências mostradas na Figura 1 e Figura 2, anticorpos para Sca-1, Kit, Flt3 e marcadores de linhagem (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 e Ter119 são usados.</li>
	<li>Classificar a 2.000-20.000 Lin– Sca1+Kit+ Flt3– células (linfócitos) ou Lin–Sca1–células Kit+ (HPs) em tubos de Eppendorf 1,5 mL contendo 0,1 mL de fosfato tampão salino (PBS), com 2% de bovino fetal soro (FBS). Nota: Para os dados mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células foram classificadas usando um citômetro de fluxo com um bocal de 70 µM. O volume máximo de coleção é 1,4 mL.</li>
</ol>2. preparação da amostra
Nota: Este passo é fundamental. Processe a amostra com muito cuidado. Ao remover o sobrenadante, tenha muito cuidado para não perturbar o centrifugado.
<ol><li>Tubos de centrífuga a 1,5 mL contendo células classificadas em um rotor de balde balançando a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min. remover todos, mas aproximadamente 100 µ l do sobrenadante da célula da pelota muito delicadamente, usando uma pipeta e uma ponta da pipeta 20 µ l. Não perturbe a pelota.<ol>
<li>Se a amostra contém menos de 5.000 células, e o volume total da amostra classificada é inferior a 0,2 mL, transferi as células primeiro para ligação baixa 0,2 mL da polimerase antes da centrifugação.</li>
		<li>Se a amostra contém menos de 5.000 células e o volume é mais do que 0,2 mL, girar as células para baixo com uma centrifugação a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min e remover todos, mas 200 µ l do sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas os restantes 200 µ l do sobrenadante, em seguida, transferir as células para os tubos PCR de 0,2 mL e spin para baixo novamente. Remover todas as mas de 20-30 µ l da pelota após a segunda rodada e re-suspender as células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ressuspender as células em esquerda sobrenadante no tubo. Se necessário, adicionar adicionais PBS em 2% FBS/PBS (você também pode usar 2% albumina de soro bovino (BSA) / PBS, ou PBS sozinho) para obter uma concentração de 5 x104 a 5 x 105 células/mL. Nota: Use a célula conta coletados por citometria para estimar o volume usado para suspender as células.</li>
	<li>Use 2 a 5 µ l de células re-suspensas para determinar uma concentração exata de célula usando um contador de célula automatizada (seguindo as instruções do fabricante) ou um hemocytometer9.</li>
	<li>Transferi um volume de re-suspensão células contendo o número desejado de células para novos tubos de 1,5 mL. Para o experimento na Figura 1, 500, 1.000 ou 2.000 linfócitos ou HPs foram transferidos. O número desejado de células varia de acordo com a força do sinal obtido por Western blot e é determinado empiricamente. Realize a transferência usando um 20 µ l ou 100 ponta da pipeta Eppendorf µ l.</li>
	<li>Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 4 ° C, 500 x g, durante 5 min.</li>
	<li>Para gerar 100 x Soluções conservadas em estoque, dissolva inibidores do Proteassoma e fosfatase em DMSO, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Prepare o amortecedor da amostra 2 x Laemmli diluindo o amortecedor da amostra 4 x Laemmli fornecido pelo fabricante com uma quantidade equivalente de água destilada. Adicione uma quantidade apropriada do stock de inibidores do Proteassoma e fosfatase para obter uma concentração final de 2 inibidores de x em tampão de amostra x Laemmli 2 100 x. Nota: O amortecedor da amostra x Laemmli 2 pode ser feita com antecedência, mas os inibidores do Proteassoma e fosfatase devem ser adicionados imediatamente antes de adicionar o 2 x Laemmli tampão de amostra (mais inibidores) para o centrifugado para lisar as células, conforme descrito na etapa seguinte.</li>
	<li>Cuidadosamente retire uma porção do líquido sobrenadante do centrifugado e o sobrenadante remanescente no tubo com o centrifugado, adicione igual volume de tampão de amostra x Laemmli 2, além de inibidores do Proteassoma e fosfatase a obter uma concentração final de 500 células / µ l em 1 amortecedor da amostra x Laemmli. Nota: por exemplo, se você transferir 2.000 células em um volume total de 20 µ l para um tubo na etapa 2.5, após centrifugação das células (passo 2.6), você deve remover 18 µ l do sobrenadante da pelota e a 2 µ l do sobrenadante que resta adicionar um volume igual (2 µ l) de 2 x Laemmli amortecedor da amostra para obter uma concentração final de 500 células / µ l em 1 amortecedor da amostra x Laemmli.</li>
	<li>Resuspenda o pellet para gerar o lisado logo que possível. Neste ponto, as amostras podem ser imediatamente electrophoresed através do gel de SDS-PAGE, ou pode ser snap congelado no líquido N2 e armazenado a-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>3. eletroforese
<ol><li>Aqueça os lysates em um bloco de calor a 95 ° C ou em água fervendo por 5 min.</li>
	<li>Electrophorese 1-40 µ l dos lysates (contendo 500 até 20.000 equivalentes de célula) através do gel de SDS-PAGE em 100V usando protocolos padrão10. Nota: O volume de lisado carregado no gel é determinado pelo número de células necessárias para gerar o sinal desejável e dependerá da abundância da proteína de interesse e a qualidade do anticorpo. Os dados na Figura 1 foram obtidos com 2.000, 1.000 e 500 equivalentes de célula de lisado. A largura do poço deve ser na faixa de 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm, os dentes podem ser cortada de um pente comercialmente disponível com dentes mais amplas, com uma tesoura.</li>
</ol>4. transferência e bloquear
Nota: Realize um Western blot seguindo protocolos padrão11. As etapas são brevemente descritas aqui:
<ol><li>Pré-tratamento de uma membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno com metanol para 10 s, em seguida, lave a membrana brevemente com água destilada.</li>
	<li>Transferi a proteína do gel SDS-PAGE para a membrana, seguindo as instruções do manual fornecido pelo fabricante do aparelho de transferência.</li>
	<li>Após transferência, bloquear a membrana com 2 mL de 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBST (PBS com 0.1% Tween) durante a noite a 4 ° C, seguindo protocolos padrão11.</li>
</ol>5. anticorpo rotulagem
<ol><li>Incube a membrana com anticorpos num agitador durante a noite a 4 ° C, que usando diluições de anticorpo recomendadas pelo vendedor. Nota: A tabela de materiais, os anticorpos, que nós validados para linfócitos e HPs e as diluições de anticorpos correspondentes, são mostrados. Execute o anticorpo rotulagem usando procedimentos padrão8.</li>
</ol>6. detecção
<ol><li>Lave a membrana 3 vezes, 5 min para cada lavagem em PBST à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube a membrana com 2 mL de tampão de quimioluminescência reforçada por 1 min à temperatura ambiente. Detecta os sinais usando um sistema de imagem seguindo instruções, do fabricante ou filme autoradiografia e processador da película.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.

Mancha ocidental é uma técnica comum para detecção de proteínas específicas e a ativação das vias de sinalização em tecidos ou células. Através da introdução de pequenos ajustes para um procedimento comumente utilizado, fomos capazes de detectar rotineiramente 15 diferentes proteínas (Tabela de materiais) em 15.000 linfócitos e em alguns casos em até 500 linfócitos. The Most passos críticos no presente protocolo são: 1) com precisão contando as células, 2) minimizando o número de transferências entre os ...

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células auto renovadora que podem dar origem a todas as linhagens de sangue. Eles são relativamente raras células na medula óssea, tornando difícil a análises bioquímicas. Abordagens adequadas para a análise de células raras, tais como citometria de fluxo, foram extremamente úteis para quantificar a quantidade relativa de marcadores de superfície celular e proteínas intracelulares. No entanto, a análise de proteínas intracelulares exige o uso de procedimentos de permeabilização celular para permitir o acesso do anticorpo, e nem todos os resumos de superfície de célula sobrevivem nestes procedimentos1,2. Além disso, os anticorpos que discriminem entre proteínas diferentes isoformas ou clivagem produtos muitas vezes não estão disponíveis para citometria de fluxo, e, portanto, os investigadores ainda dependem de borrões ocidentais para determinados tipos de análises.
Análise ocidental do borrão de lisados celulares é um procedimento de rotina na maioria dos laboratórios. Células podem ser purificadas em condições nativas que preservam os epítopos de moléculas de superfície celular, e posteriormente, lisados celulares podem ser preparados e analisados. No entanto, a análise de proteínas em rara célula primária populações por Western blot pode exigir a eutanásia de um grande número de animais para obter células suficientes. Ao fazer pequenos ajustes para vários passos, um protocolo de mancha ocidental convencional foi capaz de detectar proteínas em um número relativamente pequeno de linfócitos (500-15.000, dependendo da proteína de interesse). Os ajustes incluem contando com precisão as células, manipular cuidadosamente o centrifugado, reduzindo as transferências de células entre os tubos para minimizar a perda de células, e lise um número definido de células com uma carga concentrada de buffer contendo Proteassoma e inibidores da fosfatase. Muitos relatórios publicados incluem borrões ocidentais obtidos com 20.000 ou mais linfócitos3,4,5,6,7; Este simples procedimento reduzirá o número de células e animais experimentais necessários para produzir dados equivalentes por entre 4 e 40 vezes. O protocolo visa normalizar os resultados em uma base por célula, ao invés de um controle interno. Isto permite a detecção de globais reduções nos níveis de proteína que podem ser ignorados se dados são normalizados para um controle interno. A importância da normalização em uma base por célula foi descrita para a análise de dados de expressão do gene8, e o mesmo princípio aplica-se a quantificação de proteínas por Western blot. Este protocolo otimizado deve ser útil para qualquer um que precisar analisar um número pequeno de células.

<table><tbody><tr><td>dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrilamida Bis solução</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>mini-protean 3 pentes</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sistema de Transferência</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>transferência</td></tr><tr><td>PowerPac HC Fonte de Alimentação</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>eletroforese</td></tr><tr><td>Sistema de imagem</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>detecção de sinal</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>preparação de amostra</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>eletroforese</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>preparação de amostra</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Transfer Kit, para 40 borrões</td><td>Bio-Rad</td><td>transferência 1704272</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Coquetel</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>preparação de amostras</td></tr><tr><td>Inibidor de fosfatase Cocktailrs</td><td>Gold Biotechnology</td><td>GB-450-1</td><td>preparação de amostras</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Sinalização celular</td><td>2469</td><td>WB anticorpo, validado em 1000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): Fig2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Sinalização celular</td><td>4858</td><td>WB anticorpo, validado em 1000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): Fig2</td></tr><tr><td>actina (HRP conjugado)</td> <td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB anticorpo, validado em 500 células concentração de anticorpos: 1:5000 referência (figura): Fig1, Fig2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>WB, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Cell Signaling</td><td>4877</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células Concentração de anticorpos: 1:1000 Referência (figura): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células Concentração de anticorpos: 1:1000 Referência (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>Sinalização celular</td> <td>mTOR</td><td>2983</td><td>WB, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência(figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:1000 referência (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>actina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB anticorpo, validado em 15000 células concentração de anticorpos: 1:3000 referência (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>kit de depleção de linhagem (camundongo)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>purificação de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras</td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>purificação de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>estimulação de fosforilação</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>classificação de células</td></tr><tr><td>anti-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>classificação de células</td></tr><tr><td>anti-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>classificação de células</td></tr><tr><td>anti-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>classificação de células</td></tr><tr><td>anti-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>classificação de células</td></tr><tr><td>anti-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>classificação de células</td></tr><tr><td>Placas espaçadoras com 1,0 mm integrado Espaçadores</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td> soro <td>bloqueador de membrana</td></tr><tr><td></td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>suplemento médio</td></tr><tr><td>contador de células</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td> hemocitômetro <td>de contagem de células</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td><td>flim de contagem de células</td></tr><tr><td></td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>detecção de sinal</td></tr><tr><td>processador de filme médico</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>detecção de sinal</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto Substrato de Sensibilidade Máxima</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>detecção de sinal</td></tr><tr><td>Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>amostra escada</td></tr> de <tr><td>proteína BLUEstain</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td></td></tr><tr><td>classificador de células</td><td>de</td> eletroforese BD <td>FACSAria II</td><td>preparação de amostras</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>eletroforese</td></tr></tbody></table>

um western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células raras, com a medula óssea de rato contendo apenas ~ 25.000 fenotípica longo prazo repopulados a linfócitos. Um protocolo de mancha ocidental foi otimizado e adequado para a análise de um número pequeno de linfócitos (células de 500-15.000). Fenotípicos linfócitos foram purificados, contados com precisão e lysed diretamente no buffer de Laemmli sample. Lisado contendo igual número de células foram analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), e o Borrão foi elaborado e processado seguindo mancha protocolos de padrão ocidental. Usando este protocolo, 2.000-5.000 linfócitos podem ser rotineiramente analisados, e em alguns casos os dados podem ser obtidos de até 500 células, em comparação com as células de 20.000 a 40.000 relatadas na maioria das publicações. Este protocolo deve ser geralmente aplicável a outras células hematopoiéticas e permite a análise de rotina de um número pequeno de células usando os procedimentos padrão do laboratório.

Resultados representativos de 500-2.000 purificada linfócitos e HPs são mostrados na Figura 1 e Figura 2. O sinal de β-actina na Figura 1 pode ser detectado de apenas 500 linfócitos e HPs purificado da medula óssea de um rato. Observe que os lysates de carregamento em poços de 1,5 mm produzido um sinal mais forte de 500 HPs de carregamento em poços de 3,0 mm. A Figura 2 ...

Um padrão ocidental que mancha o protocolo foi otimizado para analisar apenas 500 tronco hematopoiético ou células progenitoras. Otimização envolve cuidado, manipulação da amostra celular, limitando as transferências entre os tubos e lise diretamente as células no buffer de Laemmli sample.

Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

O objetivo deste protocolo de western blotting é realizar western blotting em um pequeno número de células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco hematopoiéticas, como a presença ou abundância de proteínas específicas ou a ativação de vias de sinalização. A principal vantagem desta técnica é que ela requer menos de 20.000 células, portanto, menos animais são necessários para analisar populações raras de células primárias.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos tentando encontrar maneiras de reduzir o número de camundongos que precisávamos usar para análises de células-tronco hematopoiéticas. Demonstrando o procedimento estará Xiongwei Cai, um pós-doutorado do meu laboratório. Use um rotor de caçamba oscilante para centrifugar tubos de 1,5 mililitro contendo células-tronco hematopoiéticas e progenitoras classificadas a 500 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.Quando a centrifugação terminar, descarte todos, exceto 100 microlitros de sobrenadante, sem perturbar o pellet celular. Se houver menos de 5.000 células e o volume da amostra classificada for inferior a 0,2 mililitros, primeiro transfira as células para tubos de PCR de 0,2 mililitro de baixa ligação antes da centrifugação. No entanto, se houver menos de 5.000 células, mas o volume da amostra classificada for superior a 0,2 mililitro, centrifugue as células a 500 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, descarte todos, exceto 200 microlitros de sobrenadante. Em seguida, suspenda novamente o pellet e os 200 microlitros restantes de sobrenadante. Em seguida, transfira a suspensão celular para tubos de PCR de 0,2 mililitro e, novamente, centrifugue.Em seguida, suspenda novamente o pellet em 20 a 30 microlitros de sobrenadante e descarte o restante. Se necessário, adicione solução salina tamponada com fosfato em soro bovino fetal a 2% ou albumina de soro bovino a 2% nas células ressuspensas. Em seguida, use um contador de células automatizado para determinar a concentração celular usando de dois a cinco microlitros de células ressuspensas.Em seguida, use uma ponta de pipeta de 20 ou 100 microlitros para transferir um volume de 500, 1.000 e 2.000 células-tronco hematopoiéticas e progenitoras para novos tubos de 1,5 mililitro. Use um rotor de caçamba oscilante para centrifugar as células a quatro graus Celsius a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Em seguida, siga as instruções do fabricante para dissolver a fosfatase e o inibidor de proteassoma e o DMSO para preparar uma solução estoque de 100 vezes.Em seguida, dilua o tampão de amostra Laemmli de quatro vezes com volumes equivalentes de água destilada para fazer um tampão de amostra Laemmli de duas vezes. Em seguida, adicione quantidades apropriadas da solução estoque de 100 vezes de fosfatase e inibidor de proteassoma para ajustar a concentração final para inibidores de duas vezes e tampão de amostra Laemmli de duas vezes. Ajuste o volume do sobrenadante residual no tubo de modo que a adição de volumes iguais de tampão Laemmli duplo junto com a fosfatase e o inibidor de proteassoma atinja uma concentração final de 500 células por microlitro e tampão Laemmli de uma dobra.E então suspenda novamente para formar o lisado. Antes de carregar o gel, aqueça os lisados de amostra a 95 graus Celsius em um bloco de calor por cinco minutos. Usando protocolos padrão, eletroforese de um a 40 microlitros de lisado equivalente a 500 a 20.000 células através da página SDS a 100 volts.Depois de tratar a membrana de polivinilideno com metanol por segundos, lave a membrana com água destilada brevemente. Em seguida, transfira a proteína do gel para a membrana de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do aparelho de transferência. Após a transferência, bloqueie a membrana com dois mililitros de albumina de soro bovino a 2% e solução salina tamponada com fosfato com 0,1% Tween durante a noite a quatro graus Celsius de acordo com os protocolos padrão.Depois de bloquear a membrana, incube-a com anticorpos diluídos durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave a membrana três vezes com solução salina tamponada com fosfato com 0,1% Tween 20 por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Em seguida, incube a membrana com dois mililitros de tampão de quimioluminescência aprimorado por um minuto à temperatura ambiente.Detecte os sinais usando um sistema de imagem. Para comparar os sinais de beta actina, os lisados foram preparados a partir de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras da urina e submetidos à análise de parcela ocidental. Fica claro desde o amino blot que há uma diminuição no sinal de beta actina dos lisados preparados de 2.000 a 500 progenitores hematopoiéticos e células-tronco carregadas em poços de 1,5 milímetro em um gel de página de 12% SDS.Além disso, comparar os sinais de beta actina obtidos de diferentes tamanhos de poços fundidos no gel. Os lisados foram carregados em poços de 1,5 e três milímetros no gel e, em seguida, submetidos à análise de western blot. O blot mostra que o sinal de beta actina obtido do lisado preparado a partir de 500 progenitores hematopoiéticos carregados em um poço de 1,5 milímetro é muito mais forte do que quando carregado em um poço de três milímetros.Em seguida, para comparar os sinais para o fator de iniciação eucariótica 4G, actina e fosforilação da proteína ribossômica S6 em resposta à estimulação do fator de células-tronco de citocinas, os lisados obtidos foram analisados por amino blot. O blot mostra a presença de intensidades de sinal mais fortes para todas as três proteínas nos regeneradores hematopoiéticos com estimulação do fator de células-tronco de citocinas. Em comparação com o controle in vitro, também está claro que há uma intensidade de sinal crescente para todas as três proteínas de diferentes volumes de células-tronco hematopoiéticas.Uma vez dominado, isso tecnicamente pode ser feito em 48 horas. Se for abordado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de contar com precisão as células e direcionar as células de lisado com um tampão de carregamento.Após esse desenvolvimento, é tecnicamente peletizado para os pesquisadores no campo da pesquisa com células-tronco explorarem as vias de sinalização em um pequeno número de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer plotagem ocidental com um pequeno número de peças de endereço. Tenha cuidado com as regiões que você está usando para a página SDS.Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar camundongos do sistema imunológico humano (HIS). As células-tronco hematopoiéticas CD34+ (HSCs) são isoladas de células do revestimento leucocitário do sangue do cordão umbilical humano usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos. As HSCs CD34+ são expandidas em meio de crescimento enriquecido com citocinas e criopreservadas. Finalmente, os HSCs descongelados são injetados em um filhote de camundongo imunodeficiente para estabelecer o modelo...

Isolando células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical para gerar camundongos do sistema imunológico humano

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

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