Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

O objetivo deste protocolo de western blotting é realizar western blotting em um pequeno número de células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco hematopoiéticas, como a presença ou abundância de proteínas específicas ou a ativação de vias de sinalização. A principal vantagem desta técnica é que ela requer menos de 20.000 células, portanto, menos animais são necessários para analisar populações raras de células primárias.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos tentando encontrar maneiras de reduzir o número de camundongos que precisávamos usar para análises de células-tronco hematopoiéticas. Demonstrando o procedimento estará Xiongwei Cai, um pós-doutorado do meu laboratório. Use um rotor de caçamba oscilante para centrifugar tubos de 1,5 mililitro contendo células-tronco hematopoiéticas e progenitoras classificadas a 500 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Quando a centrifugação terminar, descarte todos, exceto 100 microlitros de sobrenadante, sem perturbar o pellet celular. Se houver menos de 5.000 células e o volume da amostra classificada for inferior a 0,2 mililitros, primeiro transfira as células para tubos de PCR de 0,2 mililitro de baixa ligação antes da centrifugação. No entanto, se houver menos de 5.000 células, mas o volume da amostra classificada for superior a 0,2 mililitro, centrifugue as células a 500 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, descarte todos, exceto 200 microlitros de sobrenadante. Em seguida, suspenda novamente o pellet e os 200 microlitros restantes de sobrenadante. Em seguida, transfira a suspensão celular para tubos de PCR de 0,2 mililitro e, novamente, centrifugue.

Em seguida, suspenda novamente o pellet em 20 a 30 microlitros de sobrenadante e descarte o restante. Se necessário, adicione solução salina tamponada com fosfato em soro bovino fetal a 2% ou albumina de soro bovino a 2% nas células ressuspensas. Em seguida, use um contador de células automatizado para determinar a concentração celular usando de dois a cinco microlitros de células ressuspensas.

Em seguida, use uma ponta de pipeta de 20 ou 100 microlitros para transferir um volume de 500, 1.000 e 2.000 células-tronco hematopoiéticas e progenitoras para novos tubos de 1,5 mililitro. Use um rotor de caçamba oscilante para centrifugar as células a quatro graus Celsius a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Em seguida, siga as instruções do fabricante para dissolver a fosfatase e o inibidor de proteassoma e o DMSO para preparar uma solução estoque de 100 vezes.

Em seguida, dilua o tampão de amostra Laemmli de quatro vezes com volumes equivalentes de água destilada para fazer um tampão de amostra Laemmli de duas vezes. Em seguida, adicione quantidades apropriadas da solução estoque de 100 vezes de fosfatase e inibidor de proteassoma para ajustar a concentração final para inibidores de duas vezes e tampão de amostra Laemmli de duas vezes. Ajuste o volume do sobrenadante residual no tubo de modo que a adição de volumes iguais de tampão Laemmli duplo junto com a fosfatase e o inibidor de proteassoma atinja uma concentração final de 500 células por microlitro e tampão Laemmli de uma dobra.

E então suspenda novamente para formar o lisado. Antes de carregar o gel, aqueça os lisados de amostra a 95 graus Celsius em um bloco de calor por cinco minutos. Usando protocolos padrão, eletroforese de um a 40 microlitros de lisado equivalente a 500 a 20.000 células através da página SDS a 100 volts.

Depois de tratar a membrana de polivinilideno com metanol por segundos, lave a membrana com água destilada brevemente. Em seguida, transfira a proteína do gel para a membrana de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do aparelho de transferência. Após a transferência, bloqueie a membrana com dois mililitros de albumina de soro bovino a 2% e solução salina tamponada com fosfato com 0,1% Tween durante a noite a quatro graus Celsius de acordo com os protocolos padrão.

Depois de bloquear a membrana, incube-a com anticorpos diluídos durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave a membrana três vezes com solução salina tamponada com fosfato com 0,1% Tween 20 por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Em seguida, incube a membrana com dois mililitros de tampão de quimioluminescência aprimorado por um minuto à temperatura ambiente.

Detecte os sinais usando um sistema de imagem. Para comparar os sinais de beta actina, os lisados foram preparados a partir de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras da urina e submetidos à análise de parcela ocidental. Fica claro desde o amino blot que há uma diminuição no sinal de beta actina dos lisados preparados de 2.000 a 500 progenitores hematopoiéticos e células-tronco carregadas em poços de 1,5 milímetro em um gel de página de 12% SDS.

Além disso, comparar os sinais de beta actina obtidos de diferentes tamanhos de poços fundidos no gel. Os lisados foram carregados em poços de 1,5 e três milímetros no gel e, em seguida, submetidos à análise de western blot. O blot mostra que o sinal de beta actina obtido do lisado preparado a partir de 500 progenitores hematopoiéticos carregados em um poço de 1,5 milímetro é muito mais forte do que quando carregado em um poço de três milímetros.

Em seguida, para comparar os sinais para o fator de iniciação eucariótica 4G, actina e fosforilação da proteína ribossômica S6 em resposta à estimulação do fator de células-tronco de citocinas, os lisados obtidos foram analisados por amino blot. O blot mostra a presença de intensidades de sinal mais fortes para todas as três proteínas nos regeneradores hematopoiéticos com estimulação do fator de células-tronco de citocinas. Em comparação com o controle in vitro, também está claro que há uma intensidade de sinal crescente para todas as três proteínas de diferentes volumes de células-tronco hematopoiéticas.

Uma vez dominado, isso tecnicamente pode ser feito em 48 horas. Se for abordado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de contar com precisão as células e direcionar as células de lisado com um tampão de carregamento.

Após esse desenvolvimento, é tecnicamente peletizado para os pesquisadores no campo da pesquisa com células-tronco explorarem as vias de sinalização em um pequeno número de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer plotagem ocidental com um pequeno número de peças de endereço. Tenha cuidado com as regiões que você está usando para a página SDS.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.