Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

O objetivo geral desta série de experimentos é introduzir uma enzima TET2 dividida projetada chamada CiDER em células de mamíferos para modificação induzível do DNA, como hidroximetilação, bem como remodelação epigenética. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como A principal vantagem desta técnica é que a enzima TET2 dividida projetada permite o controle temporal da oxidação da 5-metilcitosina e subsequente remodelação de estados epigenéticos em células de mamíferos com aditivos químicos. Para iniciar este procedimento, cultive uma linhagem celular aderente em DMEM suplementada com 10% de FBS inativado pelo calor, bem como 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina.

Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2. Transfectar as células com o plasmídeo CiDER conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, substitua o meio contendo reagente de transfecção por DMEM completo fresco. Para induzir quimicamente as células, adicione 20 microlitros de rapamicina diluída às células transfectadas mantidas em dois mililitros de meio para atingir uma concentração final de 200 nanomolares. Para realizar a citometria de fluxo, ressuspenda as células transfectadas e induzidas por rapamicina no tampão FACS.

Para o grupo controle, use células que expressam CiDER sem tratamento com rapamicina. Fixe e permeabilize as células conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione dois ácidos clorídricos normais às células para desnaturar o DNA por 10 minutos.

Depois de neutralizar e bloquear as células conforme descrito no protocolo de texto, adicione o anticorpo anti-5hmC diluído às células. Incube as células por uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as células com tampão FACS três vezes.

Remova o buffer FACS completamente. Adicione um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo diluído para análise FACS e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células com tampão FACS três vezes.

Após a lavagem, as amostras estão prontas para análise FACS. Isole o DNA genômico de células transfectadas e induzidas por rapamicina usando um kit comercial de extração de DNA. Para o grupo controle, use células transfectadas CiDER sem tratamento com rapamicina.

Aqueça o forno a vácuo a 80 graus Celsius. Pré-mergulhe a membrana de nitrocelulose em água bidestilada e, em seguida, em tampão SSC 6X por 10 minutos. Em seguida, carregue 60 microlitros de quantidades iguais de DNA em uma placa de PCR de 96 poços.

Adicione 30 microlitros de tampão TE aos poços restantes. Faça diluições seriais duplas verticalmente na placa de 96 poços, transferindo 30 microlitros de solução na linha um para a mesma posição da coluna na linha dois. Misture novamente e transfira 30 microlitros de solução para os poços na linha subsequente até atingir o limite.

Em seguida, remova os últimos 30 microlitros do poço. Em seguida, adicione 20 microlitros de hidróxido de sódio molar e EDTA 10 milimolar a cada poço. Sele a placa e aqueça a mistura por 10 minutos a 95 graus Celsius para desnaturar completamente o DNA duplex.

Resfrie imediatamente as amostras no gelo. Adicione 50 microlitros de acetato de amônio de dois molares gelados a cada poço e incube no gelo por 10 minutos. Enquanto isso, monte o aparelho de dot-blot com a membrana pré-embebida.

Remova o tampão residual usando um vácuo completo. Lave a membrana adicionando 200 microlitros de tampão TE a cada poço do aparelho de dot-blot. Ligue o aspirador para remover o buffer TE.

Em seguida, carregue o DNA desnaturado em cada poço do aparelho de dot-blot. Ligue o aspirador para remover a solução. Lave a membrana adicionando 200 microlitros de 2X SSC e remova completamente as soluções residuais usando um vácuo.

Desmonte o aparelho de mancha de pontos. Em seguida, retire a membrana e enxágue toda a membrana com 20 mililitros de 2X SSC. Seque a membrana ao ar por 20 minutos.

Para secar ainda mais a membrana, asse-a a 80 graus sob vácuo por duas horas. Adicione a solução de bloqueio à membrana e incube por uma hora em temperatura ambiente. Depois de descartar a solução de bloqueio, adicione os anticorpos 5-hmC ou 5-mC diluídos à membrana e incube durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave a membrana com TBST três vezes por 10 minutos para remover os anticorpos residuais. Depois de remover completamente o TBST, adicione um anticorpo secundário conjugado HRP à membrana. Incube a membrana por uma hora em temperatura ambiente.

Lave a membrana com TBST três vezes por 10 minutos. Finalmente, adicione substrato de western blotting ECL à membrana para visualização de sinais 5-hmC usando um detector de quimioluminescência. Um resultado de quantificação representativo da produção de 5-hmC mediada por CiDER por citometria de fluxo é mostrado aqui.

Apenas as células que expressam CiDER em condições tratadas com rapamicina mostram aumento significativo dos níveis de 5-hmC. Um resultado representativo da mudança global do nível de 5-hmC em toda a população celular pelo ensaio de dot-blot é mostrado aqui. O controle de carga é visualizado pela coloração com azul de etileno das quantidades totais de DNA de entrada.

Os resultados demonstram que o tratamento com rapamicina induz a produção robusta de 5-hmC em células HEK293T que expressam CiDER com atividade de fundo insignificante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética explorarem a função celular sem alterar o código genético e investigarem as relações epigenótipo e fenótipo em vários sistemas biológicos.