Name: Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a introduzir a enzima CiDER em células mamíferas para hidroximetilação de DNA induzível quimicamente e remodelação epigenética. Este método permite controle temporal preciso das modificações do DNA.

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Agradecemos a financeira das sustentações do National Institutes of Health concedem (R01GM112003 para YZ), Fundação Welch (BE-1913 a YZ), a American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE para YZ), a prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (RR140053 a YH, RP170660 para YZ), a associação americana do coração (16IRG27250155 a YH) e o programa de prêmio de pesquisa colaborativa de fundação de John S. Dunn.

1. cultura, transfeccao Plasmideo e indução química da pilha
<ol>
	<li>Cultura de uma linhagem de células aderentes (por exemplo, o embrionário rim humano HEK293T célula) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementada com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 100 U/mL penicilina e estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Transfect células com o plasmídeo de cidra.
	<ol>
		<li>Pelo menos 18 h antes de transfeccao, semente 0.3 x 106 células 2,5 mL de DMEM apropriado por bem em uma placa de 6 e incubam as células a 37 ° C durante a noite para chegar a confluência de 60-80%.</li>
		<li>Pré-aquecer o reagente de transfeccao à temperatura ambiente antes do uso.</li>
		<li>Lugar de 250 µ l de meio livre de soro em um tubo estéril. Nota: Este montante é adaptado para uma placa de 6 com a confluência de 80%. Se necessário, ajuste proporcionalmente as quantidades médias de acordo com os tamanhos de placas ou números de telemóvel.</li>
		<li>Adicionar 2,5 µ g do plasmídeo codificação cidra18 ou o domínio catalítico de TET2 (TET2CD como controle positivo)12,13 entram no meio livre de soro e delicadamente misture por pipetagem.</li>
		<li>Adicionar 7,5 µ l de reagente de Transfeccao para a mistura de DNA diluída e misture suavemente pipetando.</li>
		<li>Incube a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min.</li>
		<li>Mudar de mídia previamente aquecida e adicione a mistura de drop-wise aos poços e agite suavemente a placa de cultura de células para distribuir uniformemente o reagente de transfeccao e mistura de DNA.</li>
		<li>Incubar as células e mistura durante a noite e em seguida, substitua o reagente de transfeccao contendo mídia com 2ml de DMEM completa fresco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indução química
	<ol>
		<li>Diluído a 2 mM do estoque de rapamicina (dissolvido em DMSO) a uma concentração de 20 µM em meio apropriado completo.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l de rapamicina diluída para células transfectadas mantidas em 2 mL de meio para atingir uma concentração final de 200 nM. Nota: Após a incubação por 48 h, as células estão prontas para quantificação da geração de 5hmC ou quaisquer outras aplicações a jusante. Se necessário, a eficiência de indução pode ser monitorizada por tirar células cada 3h para mais 5hmC quantificação conforme descrito abaixo e mostrada na Figura 1.</li>
		<li>Para melhor quantificação da eficiência de indução 5hmC, semente separadas poços para monitorar as células a cada 3 horas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. quantificação da produção de 5hmC induzida por rapamicina por imunocoloração
<ol>
	<li>mancha de 5hmC da imunofluorescência Nota: Adicione quantidades suficientes da solução de fixação, composto por paraformaldeído 4%, 0,2% de tensoativo (tais como o Triton X-100) em PBS com 3 N HCl, para cobrir todas as células na placa. Por exemplo, 500 µ l de solução seria suficiente para um poço em uma placa de 6. Execute todas as etapas, à temperatura ambiente.<ol>
		<li>Para corrigir as células, adicione paraformaldeído 4% em PBS a rapamicina-tratados células durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para o grupo de controle, use células expressando mCherry-cidra sem tratamento de rapamicina. Não agite. Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Use proteção adequada.</li>
		<li>Descarte a solução fixador. Incube células fixas com surfactante de 0,2% em PBS durante 30 min para permeabilize membrana celular.</li>
		<li>Descarte a solução de permeabilização. Adicionar 3 N HCl para as células permeabilized e incube por 15 min desnaturar o DNA.</li>
		<li>Descarte a 100 mM de HCl. Add tampão Tris-HCl (pH 8.0) às células por 10 min para a neutralização do pH.</li>
		<li>Descarte toda a solução. Lavar as células completamente com PBS para 3 - 5 vezes. Remova completamente o PBS. Nota: Adicione quantidades suficientes de PBS para cada etapa de lavagem. Por exemplo, 1 mL de PBS é o suficiente para uma placa de 6.</li>
		<li>Bloquear células adicionando o tampão de bloqueio, composto por 1% de BSA e 0,05% de surfactante (tais como Tween 20) em PBS para 1 h com agitação suave.</li>
		<li>Descarte a solução de bloqueio. Adicione o anticorpo 5hmC diluído (1: 200) para as células e incubar durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Lave as células com PBS, três vezes por 15 min.</li>
		<li>Adicionar um fluoróforo diluído (FITC)-conjugado anticorpo secundário (1: 200) para as células e incubar durante 1 h.</li>
		<li>Lave as células com PBS três vezes extensivamente para remover anticorpos residuais.</li>
		<li>Adicionar 250 ng/mL de 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para manchar o núcleo 5 min. remover a coloração da solução.</li>
		<li>Monte o prato de cultura slide ou vidro baixo com células immunostained para a imagem latente confocal. Um resultado representativo foi mostrado na figura 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Citometria de fluxo Nota: Use uma placa de fundo redondo de 96 poços para o seguinte procedimento de coloração. Geralmente, 150 µ l de reagentes é suficiente para cada poço.<ol>
		<li>Ressuspender as células transfectadas e induzida a rapamicina no buffer de FACS (PBS com 1% de BSA, 2 mM EDTA). Para o grupo de controle, use cidra-expressando células sem tratamento de rapamicina.</li>
		<li>Corrigir e permeabilize as células conforme descrito no passo 2.1.</li>
		<li>Adicione 2 N HCl para as células para desnaturar o DNA por 10 min.</li>
		<li>Descartar o HCl. neutralizar e bloquear as células conforme descrito no passo 2.1.</li>
		<li>Adicionar um anticorpo anti-5hmC diluído (1: 200) para as células e incube por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Lave as células com buffer de FACS três vezes. Buffer de FACS remova completamente.</li>
		<li>Adicionar um fluoróforo diluído (FITC)-conjugado anticorpo secundário (1: 400) por fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS) e incube por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as células com buffer de FACS três vezes.</li>
		<li>As amostras estão prontas para análise de FACS. Um resultado representativo foi mostrado na Figura 1-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-blot ensaio para quantificar 5hmC e 5-metilcitosina (5mC) eleva-se
<ol>
	<li>Isole o DNA genômico de células transfectadas induzida por rapamicina usando um kit de extração de DNA comercial. Para o grupo de controle, use células transfectadas de cidra sem tratamento de rapamicina.</li>
	<li>Aqueça o forno a vácuo para 80 ° C e pré-embebição membrana de nitrocelulose em bidestilada H2O e, depois, em 6 x tampão citrato de sódio-solução salina (SSC) por 10 min.</li>
	<li>Carrega 60 µ l de quantidades iguais de DNA (total 2 µ g/ml tampão TE) em uma chapa de PCR de 96 poços. Adicione 30 µ l de tampão TE (Tris-HCl de 10 mM, 1 mM EDTA, pH 8.0) nos poços do resto.</li>
	<li>Fazer diluições em série dupla verticalmente na placa de 96 poços através da transferência de 30 µ l de solução na linha 1 para a mesma posição da coluna na linha 2. Misture novamente e 30 µ l de solução de transferência aos poços na linha subsequente até atingir o limite.</li></ol>Remova os últimos 30 µ l.
	<li>Adicionar 20 µ l de 1m NaOH e 10 mM de EDTA para cada poço, selar a placa e aquecer a mistura durante 10 minutos a 95 ° C para desnaturar completamente do duplex de DNA.</li>
	<li>Imediatamente arrefecer as amostras no gelo e adicionar 50 µ l de acetato de amônio 2m gelada (pH 7.0) e incubar no gelo por 10 min. Nota: Passos 3.7-3.10 envolve o uso de vácuo.</li>
	<li>Montar o aparelho de borrão ponto com membrana previamente embebido e remover residual buffer usando vácuo total.</li>
	<li>Lave a membrana adicionando-se 200 µ l de tampão TE a cada poço do aparato de dot blot. Ligue o aspirador para remover o tampão TE.</li>
	<li>Carrega o DNA desnaturado (preparado nas etapas anteriores 3.1-3.6) a cada poço do aparato de dot blot. Ligue o aspirador para remover a solução.</li>
	<li>Lave a membrana adicionando-se 200 µ l de 2 x SSC e remover soluções residuais completamente usando o vácuo.</li>
	<li>Desmontar o aparelho de borrão do ponto, retire a membrana e lavar a membrana inteira com 20 mL de 2 x SSC.</li>
	<li>Secar ao ar livre da membrana por 20 min.</li>
	<li>Asse a membrana a 80 ° C sob vácuo por 2 h.</li>
	<li>Adicionar a solução de bloqueio (5% leite desnatado em TBST) para a membrana e incube por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte a solução de bloqueio. Adicionar um 5hmC diluído (1:5, 000) ou 5mC (1:1, 000) anticorpos à membrana e incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave a membrana com TBST três vezes para 10 min para remover anticorpos residuais. TBST remova completamente.</li>
	<li>Adicionar um anticorpo secundário conjugado HRP (01:10, 000 de anti-coelho HRP(5hmC) ou 1:3,000 para anti-mouse HRP(5mC)) para a membrana e incube por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a membrana com TBST três vezes por 10 min.</li>
	<li>Adicione ECL mancha o substrato para a membrana para visualização de sinais de 5hmC usando um detector de quimioluminescência ocidental. Um resultado representativo foi mostrado na Figura 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui nós ilustraram o uso de uma enzima de split-TET2 projetado para conseguir o controle temporal de DNA hydroxymethylation. Após a descoberta da família de TET de dioxigenase 5-methycytosine, muitos estudos foram realizados para decifrar as funções biológicas das proteínas de TET e seu principal produto catalítico 5hmC1,2,3, 4,5,<sup class="xref"...

Metilação do DNA, principalmente refere-se a adição de um grupo metil na posição do carbono 5 da citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), é catalisada por DNA metil-transferases (DNMTs). 5mC atua como uma marca importante epigenética no genoma de mamíferos que geralmente sinaliza para repressão transcriptional, inativação do cromossomo x e transposon silenciar1. A reversão da metilação do DNA é mediada pela família de proteínas de dez-elven translocação (TET). Enzimas de TET pertencem ao ferro (II) e 2-do oxoglutarate dioxygenases dependente que catalisam a oxidação sucessiva de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxycytosine (5caC). Oxidação mediada por TET 5mC impõe uma camada adicional de controle epigenético do genoma dos mamíferos. A descoberta do TET provocou intenso interesse no campo epigenético para desvendar as funções biológicas das proteínas TET e 5hmC seu produto principal catalítico. 5hmC não é apenas um intermediário durante o TET-mediado ativo DNA desmetilação2,3,4, mas também atua como um estábulo epigenética marca5,6,7,8 . Apesar de hydroxymethylation de DNA é altamente correlacionada com a expressão de gene e aberrante mudanças no DNA hydroxymethylation estão associadas a algumas doenças humanas9,10,11, as relações causais entre as modificações epigenéticas no DNA e os fenótipos frequentemente permanecem um desafio a ser estabelecida, que pode ser parcialmente atribuída à falta de uma ferramenta confiável com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em definido pelo temporal e espacial resolução.
Aqui nós relatamos o uso de um produto químico-inducible Epigenoma remodelar ferramenta (cidra) para superar o obstáculo que enfrentam os estudos de relações causais entre transcrição hydroxymethylation e gene de DNA. O design é baseado no pressuposto de que o domínio catalítico de TET2 (TET2CD) pode ser dividido em dois fragmentos inativos quando expressa em células de mamíferos e sua função enzimática pode ser restaurada por uma abordagem de dimerização quimicamente inducible ( Figura 1A). Para estabelecer um sistema de separação-TET2CD, nós selecionamos seis locais em TET2CD, composto por uma região rica em Cys e uma dobra dupla-hélice β-hélice (DSBH), com base em uma estrutura de cristal relatado do ADN TET2-complexo que carece de uma região de baixa complexidade12. Um sintético gene que codifica a proteína dimerização rapamicina-inducible módulo FK506 12 (FKBP12) e domínio de ligação FKBP rapamicina (FRB) de mamíferos alvo de14,rapamicina15, juntamente com um peptídeo Self chicotado T2A polipeptídeo sequência16,17, individualmente foi inserido em sites selecionados dividido dentro de TET2CD. A seleção de TET2 como nosso alvo engenharia baseia-se as seguintes considerações. Mutações somáticas, primeiras no TET2 com concomitante redução de hydroxymethylation de DNA são frequentemente observadas em doenças humanas incluindo distúrbios mieloides e câncer10, que fornece informações úteis em locais sensíveis deve ser evitada para inserção. Em segundo lugar, uma grande fração do domínio catalítico TET2, particularmente a região de baixa complexidade, é dispensável para a função enzimática12, permitindo assim que um split-TET2 minimizado para modificações epigenéticas inducible do ofício. Após a triagem de mais de 15 construções, uma construção que exibiu maior restauração rapamicina-inducible da sua actividade enzimática no sistema dos mamíferos foi escolhida e designada como cidra18. Neste documento descrevemos o uso de mCherry-tag cidra para alcançar hydroxymethylation de DNA inducible e epigenéticas remodelação com rapamicina e apresentar três métodos para validar a produção 5hmC mediada por cidra em um sistema celular modelo HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Reagente de transfecção de lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, solução a 16%</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, Bovino</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) anticorpo (pAb)</td><td>Motivo Ativo</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário de IgG de Cabra Anti-Coelho (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Forno a vácuo econômico, 0,6 pés cúbicos. (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Bio-Dot</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-metilcitosina (5mC) Anticorpo, clone 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG,</td><td>Tecnologia de Sinalização de Células</td> de Anticorpo Ligado a HRP <td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG, Tecnologia de</td><td>sinalização de célula</td> de anticorpo ligado a HRP <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

uma enzima de split-tet2 projetado para hydroxymethylation de dna químico-inducible e remodelação epigenéticas

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Metilação do DNA é uma modificação epigenética estável e hereditária no genoma dos mamíferos e está envolvida na regulação da expressão gênica para controlar funções celulares. A reversão da metilação do DNA, ou demetilação do ADN, é mediada por dez-onze translocação (TET) da proteína da família dos dioxygenases. Embora tem sido amplamente relatado que aberrante a metilação do DNA e a desmetilação estão associadas com câncer e defeitos do desenvolvimento, como estas mudanças epigenéticas contribuem directamente para a subsequente alteração na progressão de doença ou de expressão do gene Ainda não está claro, em grande parte devido à falta de ferramentas confiáveis com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em resolução espacial e temporal definido. Para superar este obstáculo, nós projetamos uma enzima split-TET2 para permitir o controle temporal de oxidação 5-metilcitosina (5mC) e subsequentes a remodelação dos Estados epigenéticos em células de mamíferos simplesmente adicionando produtos químicos. Aqui, descrevemos os métodos para a introdução de uma ferramenta de remodelação químico-inducible Epigenoma (cidra), com base em uma divisão de engenharia-TET2 enzima, em células de mamíferos e quantificar a produção química inducible do 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) com immunostaining, citometria de fluxo ou um ensaio de dot-blot. Esta ferramenta de remodelação Epigenoma químico-inducible encontrará ampla utilização em sistemas celulares a interrogar sem alterar o código genético, bem como na investigação das relações epigenotype−phenotype em diferentes sistemas biológicos.

Conversão de 5mC-para-5hmC inducible química pode ser validado pelo immunostaining em nível de célula única, análise de citometria de fluxo em populações de células transfectadas de (mCherry-positivo) ou um ensaio de dot-blot mais quantitativo, conforme ilustrado na Figura 1. O domínio catalítico de TET2, ou TET2CD, foram utilizados ao longo do estudo como um controle positivo. Consulte referências 18-20 para maiores detalhes sobre o mapeamento de todo o geno...

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

O objetivo geral desta série de experimentos é introduzir uma enzima TET2 dividida projetada chamada CiDER em células de mamíferos para modificação induzível do DNA, como hidroximetilação, bem como remodelação epigenética. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como A principal vantagem desta técnica é que a enzima TET2 dividida projetada permite o controle temporal da oxidação da 5-metilcitosina e subsequente remodelação de estados epigenéticos em células de mamíferos com aditivos químicos. Para iniciar este procedimento, cultive uma linhagem celular aderente em DMEM suplementada com 10% de FBS inativado pelo calor, bem como 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina.Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2. Transfectar as células com o plasmídeo CiDER conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, substitua o meio contendo reagente de transfecção por DMEM completo fresco. Para induzir quimicamente as células, adicione 20 microlitros de rapamicina diluída às células transfectadas mantidas em dois mililitros de meio para atingir uma concentração final de 200 nanomolares. Para realizar a citometria de fluxo, ressuspenda as células transfectadas e induzidas por rapamicina no tampão FACS.Para o grupo controle, use células que expressam CiDER sem tratamento com rapamicina. Fixe e permeabilize as células conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione dois ácidos clorídricos normais às células para desnaturar o DNA por 10 minutos.Depois de neutralizar e bloquear as células conforme descrito no protocolo de texto, adicione o anticorpo anti-5hmC diluído às células. Incube as células por uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as células com tampão FACS três vezes.Remova o buffer FACS completamente. Adicione um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo diluído para análise FACS e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células com tampão FACS três vezes.Após a lavagem, as amostras estão prontas para análise FACS. Isole o DNA genômico de células transfectadas e induzidas por rapamicina usando um kit comercial de extração de DNA. Para o grupo controle, use células transfectadas CiDER sem tratamento com rapamicina.Aqueça o forno a vácuo a 80 graus Celsius. Pré-mergulhe a membrana de nitrocelulose em água bidestilada e, em seguida, em tampão SSC 6X por 10 minutos. Em seguida, carregue 60 microlitros de quantidades iguais de DNA em uma placa de PCR de 96 poços.Adicione 30 microlitros de tampão TE aos poços restantes. Faça diluições seriais duplas verticalmente na placa de 96 poços, transferindo 30 microlitros de solução na linha um para a mesma posição da coluna na linha dois. Misture novamente e transfira 30 microlitros de solução para os poços na linha subsequente até atingir o limite.Em seguida, remova os últimos 30 microlitros do poço. Em seguida, adicione 20 microlitros de hidróxido de sódio molar e EDTA 10 milimolar a cada poço. Sele a placa e aqueça a mistura por 10 minutos a 95 graus Celsius para desnaturar completamente o DNA duplex.Resfrie imediatamente as amostras no gelo. Adicione 50 microlitros de acetato de amônio de dois molares gelados a cada poço e incube no gelo por 10 minutos. Enquanto isso, monte o aparelho de dot-blot com a membrana pré-embebida.Remova o tampão residual usando um vácuo completo. Lave a membrana adicionando 200 microlitros de tampão TE a cada poço do aparelho de dot-blot. Ligue o aspirador para remover o buffer TE.Em seguida, carregue o DNA desnaturado em cada poço do aparelho de dot-blot. Ligue o aspirador para remover a solução. Lave a membrana adicionando 200 microlitros de 2X SSC e remova completamente as soluções residuais usando um vácuo.Desmonte o aparelho de mancha de pontos. Em seguida, retire a membrana e enxágue toda a membrana com 20 mililitros de 2X SSC. Seque a membrana ao ar por 20 minutos.Para secar ainda mais a membrana, asse-a a 80 graus sob vácuo por duas horas. Adicione a solução de bloqueio à membrana e incube por uma hora em temperatura ambiente. Depois de descartar a solução de bloqueio, adicione os anticorpos 5-hmC ou 5-mC diluídos à membrana e incube durante a noite a quatro graus Celsius.Lave a membrana com TBST três vezes por 10 minutos para remover os anticorpos residuais. Depois de remover completamente o TBST, adicione um anticorpo secundário conjugado HRP à membrana. Incube a membrana por uma hora em temperatura ambiente.Lave a membrana com TBST três vezes por 10 minutos. Finalmente, adicione substrato de western blotting ECL à membrana para visualização de sinais 5-hmC usando um detector de quimioluminescência. Um resultado de quantificação representativo da produção de 5-hmC mediada por CiDER por citometria de fluxo é mostrado aqui.Apenas as células que expressam CiDER em condições tratadas com rapamicina mostram aumento significativo dos níveis de 5-hmC. Um resultado representativo da mudança global do nível de 5-hmC em toda a população celular pelo ensaio de dot-blot é mostrado aqui. O controle de carga é visualizado pela coloração com azul de etileno das quantidades totais de DNA de entrada.Os resultados demonstram que o tratamento com rapamicina induz a produção robusta de 5-hmC em células HEK293T que expressam CiDER com atividade de fundo insignificante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética explorarem a função celular sem alterar o código genético e investigarem as relações epigenótipo e fenótipo em vários sistemas biológicos.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

Aqui, apresentamos um protocolo para uma purificação eficiente passo a passo do ativo humano sem marcas de formatação a translocação de 10-11-2 (TET2) 5-metilcitosina dioxigenase usando cromatografia de permuta iónica e seu ensaio usando uma massa em tandem-cromatografia líquida espectrometria (LC-MS/MS)-com base em abordagem.

Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Aqui, apresentamos um protocolo para reduzir as modificações de DNA em bacteriófagos usando a enzima NgTET, permitindo a mutagênese CRISPR-Cas eficiente e sem cicatrizes. Este método facilita a engenharia genética de fagos para aplicações em biotecnologia e terapia fágica.

Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET

Este protocolo descreve um sistema não integrativo e episômico baseado em CRISPR/dCas9 para edição epigenética direcionada em células K562, combinando efetores dCas9-DNMT3A e dCas9-HDAC1 com sgRNAs específicos para induzir metilação de DNA específica do locus com precisão e efeitos fora do alvo reduzidos.

Engenharia Epigenética de Células K562: Estratégia Episómica de Vetor Duplo para Metilação de DNA Direcionada Estável usando Proteínas de Fusão dCas9-DNMT3A e -HDAC1

Aprenda a introduzir a enzima CiDER em células mamíferas para hidroximetilação de DNA induzível quimicamente e remodelação epigenética. Este método permite controle temporal preciso das modificações do DNA.

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

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