Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Aqui, apresentamos um passivo de protocolo para seções de pâncreas humano imagem em três dimensões (3D) usando otimizado métodos de compensação. Este manuscrito demonstra estes procedimentos para compensação de óptica passiva seguido por imunofluorescência múltiplas coloração para identificar os elementos-chave das redes neurais sensoriais e autonômicas, que inervam ilhotas humanas.

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar um método otimizado e passivo de limpeza óptica adequado para uso com tecido pancreático humano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, relacionadas ao diabetes, fornecendo detalhes sobre a inervação das ilhotas. A principal vantagem dessa técnica é que o método de clareamento garante a transparência do tecido pancreático humano para uso em imagens confocais de alta resolução.

Para começar, fixe uma amostra de pâncreas colocando-a em paraformaldeído a 4% recém-preparada e incube a amostra a quatro graus Celsius por 48 horas. Em seguida, resfrie um frasco colocando-o em um balde com gelo. Em seguida, coloque o balde em cima de uma placa de agitação magnética.

Certifique-se de que o frasco esteja plano e adicione uma barra de agitação magnética. Despeje 147,8 mililitros de água destilada e deionizada gelada no frasco. Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS 0,1 molar, 20 mililitros de uma solução gelada de acrilamida a 40%, 12,2 mililitros de uma solução de paraformaldeído a 16% e 250 miligramas de iniciador VA-044.

Misture toda a solução de hidrogel por pelo menos 10 minutos. Em seguida, coloque um tubo cônico de 15 mililitros no gelo ao lado do frasco contendo a solução de hidrogel. Pipetar 14 mililitros de solução de monómero para o tubo.

e adicione um pedaço da amostra de tecido fixo e seccionado. Em seguida, tampe o tubo. Incubar a amostra na solução de monômero por 3 dias a quatro graus Celsius, protegida da luz.

Após a incubação, coloque a amostra no gelo. Em seguida, conecte a tubulação a um tanque de nitrogênio através de uma torneira. Enquanto mantém a amostra no gelo, use cuidadosamente uma agulha hipodérmica de calibre 18 para perfurar a tampa de um tubo cônico contendo a amostra de um lado.

Insira a agulha no tubo até que esteja sob a superfície da solução de monômero líquido. Em seguida, use outra agulha hipodérmica de calibre 18 para perfurar o lado oposto da tampa, mas não permita que ela fique submersa na solução, para que possa atuar como um respiradouro. Conecte a tubulação do tanque de nitrogênio à agulha hipodérmica submersa sob o hidrogel e ligue lentamente o nitrogênio, até que esteja borbulhando constantemente através do líquido.

Uma vez desoxigenado, remova rapidamente as duas agulhas e cubra a tampa com um filme de parafina, para evitar qualquer troca adicional de gases entre o tubo e o ambiente. Por fim, coloque a amostra em uma incubadora a 37 graus Celsius, por três horas, para polimerizar o hidrogel. Após a polimerização, despeje o hidrogel restante.

Em seguida, lave a amostra em 3 a 5 trocas de PBS 0,01 molar por 15 minutos em cada etapa de lavagem. Depois de lavado, transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 40 mililitros ou tampão de limpeza. Incube a amostra no tampão de limpeza a 37 graus Celsius e mude a amostra para um novo tampão de limpeza a cada dois dias.

Para verificar a limpeza adequada, segure a amostra contra uma luz e certifique-se de que a amostra permita a passagem de luz, mas retenha alguma coloração bronzeada nas regiões exócrinas. Uma amostra superlimpa parecerá desgastada nas bordas e a textura será muito macia quando coletada com uma pinça. É comum que uma amostra seja limpa de forma desigual.

Troque o tampão de limpeza por 40 mililitros de PBS molar de 0,01 e coloque as amostras em um agitador a 60 RPMs por um dia em temperatura ambiente. Realize quatro a cinco trocas de buffer e deixe a lavagem final continuar durante a noite. Em seguida, prepare o tampão de coloração PACT em um tubo de fundo plano de 2 mililitros e adicione 2% de soro normal a 1 mililitro do tampão PACT básico.

Em seguida, adicione aproximadamente cinco vezes a quantidade padrão de anticorpo primário ao tampão de coloração. Usando uma espátula, remova a amostra do tampão de lavagem e passe o excesso de tampão em uma toalha de papel. Coloque a amostra no tubo com a solução primária de anticorpos e incube-a na solução por dois a quatro dias em temperatura ambiente, em um agitador, a 60 RPM.

Após a incubação, remova a solução de anticorpos e adicione PBS 0,01 molar. Lave bem as amostras no shaker a 60 RPM, mudando para um tampão fresco quatro a cinco vezes e deixando a lavagem final no shaker durante a noite. Em seguida, adicione o anticorpo secundário de 1 a 200 no tampão de coloração PACT com soro adicionado a 2%.

Use uma espátula para remover a amostra do tampão de lavagem e aplique o excesso de tampão em uma toalha de papel. Em seguida, coloque a amostra no tubo com a solução de anticorpos secundários. Proteger a amostra da luz enquanto incuba a amostra à temperatura ambiente num agitador a 60 RPM durante dois dias.

Após a incubação, remova a solução de anticorpos e substitua-a por PBS 0,01 molar. Lave bem as amostras no shaker a 60 RPM, mudando para um tampão fresco quatro a cinco vezes e deixando a lavagem final no shaker durante a noite. Para começar, prepare o tampão de solução correspondente ao índice de refração pesando primeiro 11 gramas de meio gradiente de densidade não iônica e transferindo-o cuidadosamente para um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, adicione 5 mililitros de tampão fosfato molar 0,02 usando uma espátula para liberar o ar do meio gradiente de densidade não iônico em pó. Se necessário, aumente o volume para 10 mililitros, usando mais tampão fosfato molar 0,02, misture com uma espátula e raspe o excesso da espátula para dentro do tubo. Incube o tampão a 37 graus Celsius até que se dissolva completamente, invertendo e misturando suavemente periodicamente.

Transfira as amostras para o tampão da solução de correspondência do índice de refração e incube-as na bancada protegida da luz por dois a quatro dias antes da imagem. Pouco antes de obter imagens, coloque uma pequena quantidade da solução de correspondência do índice de refração em uma lâmina de lamínula inferior de oito poços. Em seguida, adicione a amostra ao poço e tampe a lâmina.

No pâncreas humano, as ilhotas podem ser delineadas por insulina, glucagon e Grana Three secretado para células beta, células alfa ou todas as células endócrinas, respectivamente. As células de Schwann parecem brancas e as células endócrinas são mostradas coradas por insulina ou glucagon. Os nervos, correndo ao lado dos vasos sanguíneos na periferia das ilhotas, destacam-se como linhas brancas e se estendem para as ilhotas.

Aqui, o contato entre as células de Schwann e as células endócrinas pode ser visto claramente. Aqui, uma amostra preparada usando os métodos mostrados neste vídeo foi corada para peptídeo intestinal vasoativo e fotografada usando um microscópio de folha de luz. As fibras nervosas são claramente vistas em alta resolução e são mostradas envolvendo um ducto em primeiro plano e um gânglio ao fundo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar regiões acinares do pâncreas livres de dutos e vasos principais.