Name: Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar queratinócitos humanos primários de pele adulta para estudar biologia cutânea in vitro. Este método permite investigar diferenciação celular e doenças inflamatórias da pele em ambiente controlado.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O autor deseja agradecer a Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller para seu suporte técnico

A coleta de amostras de pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica requer aprovação do Comitê de ética das instituições de acolhimento. Este protocolo foi aprovado pelo Regional éticas Comitê da região Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). O método descrito aqui é derivado de estudos semelhantes por Maciaq et al . 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento de queratinócitos da pele humana
<ol>
	<li>Começar por fazer as seguintes soluções: 50 mL de solução de glicose de tripsina e 0,1% de 0,25% em DPBS. Mix e filtro esterilizem (0,2 µm) a solução. Prepare-se 10 mL de RPMI-1640 + 2% solução FBS, 50 mL de DPBS e queratinócito meio livre de soro (KSFM). Adicione 250 µ l de gentamicina e KSFM suplementos para 500 mL de KSFM. Pré-aquecer as soluções a 37 ° C antes do uso.</li>
	<li>Colete a pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica. As amostras de pele usadas são aproximadamente 10 cm x 15 cm, mas podem variar de tamanho. Manter a calma de pele sob transporte transportando amostras de pele em uma caixa de isopor contendo um elemento de refrigeração. Se necessário, a amostra de pele pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Remova a gordura da abaixo da seção de pele usando pinças, bisturis e tesoura esterilizada.</li>
	<li>Fivela para fora a seção de pele (aproximadamente 10 x 15 cm) em uma cobertura estéril em cima de uma placa usando agulhas. Primeiro, limpe a pele com uma gaze esterilizada seca. Em seguida, limpe a pele usando uma gaze esterilizada com etanol a 70%.</li>
	<li>Utilizando uma plaina de pé, corte da camada superior (epiderme) da seção de pele e colocá-lo em uma placa de Petri de 9 cm. Então, imediatamente Adicione 25 mL da solução de DPBS/tripsina/glicose (preparada na etapa 1.1) para a placa de Petri. Incubar durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Usando uma pipeta retire a placa de Petri a solução de tripsina/DPBS/glicose e adicionar 10 mL de RPMI-1640 + 2% FBS para inactivar a tripsina.</li>
	<li>Usando duas pinças, agora solte as células epidérmicas no meio de delicadamente raspando e agitação epidérmico e dérmico compartimento das secções de pele.</li>
	<li>Filtrar a suspensão de células epidérmicas por um filtro de metal (tamanho do furo de 1 mm) e recolher em um tubo de 50 mL. Adicione as restantes secções de pele para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de RPMI-1640 sem FBS e vórtice para 10 filtro s. a suspensão através do metal do filtro em um tubo de 50 mL contendo a suspensão de células epidérmicas. Adicione DPBS para um volume total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 450 x g, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o celular epidérmica em cerca de 10 mL de 37 ° C KSFM dependendo do tamanho do centrifugado. Conte as células usando o azul Trypan método sob microscópio de coloração. O número de células obtidas a partir de uma seção de pele de 10 x 15 cm é aproximadamente 50-100 x 106 células. Cada frasco de cultura2 75cm, transferência de 8 x 106 células juntamente com 12 mL de 37 ° C KSFM. Agite os frascos de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células.</li>
	<li>Incube os queratinócitos em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO2. Mude o meio após 2 dias e três vezes por semana. Células de passagem quando a cultura é 70-80% de confluencia, que leva cerca de 2 semanas, dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos.</li>
</ol>
2. passagem de queratinócitos
<ol>
	<li>Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso de 4,5 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura 75 cm2 .</li>
	<li>Remova as células médio e adicione frasco de cultura 4,5 mL/75 cm2 pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.</li>
	<li>Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 6 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura 75 cm2 e transferir a suspensão de eritrócitos para tubos de 50 mL.</li>
	<li>Lave os frascos de cultura com 3 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar as células por 10 min a 450 x g, à temperatura ambiente.
	<ol>
		<li>Ressuspender as células peletizadas em 10 mL de KSFM (37 ° C). Contar as células e transferir 3 x 106 células para um frasco de cultura 150 cm2 junto com 20 mL de KSFM (37 ° C). Agite suavemente o frasco de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células. Congele as células, quando a cultura é confluente de 80-90%, o que leva cerca de 4 a 6 dias dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos (ver secção 3, congelando o protocolo abaixo). Expanda os queratinócitos para gerar estoques congelados apropriados.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. congelamento dos queratinócitos
<ol>
	<li>Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso 9 mL da solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura de2 a 150 cm.</li>
	<li>Remova as células médio e adicione frasco de cultura 9ml/150 cm2 pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.</li>
	<li>Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 12 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura de2 a 150 cm e aspire a suspensão de células para tubos de 50 mL.</li>
	<li>Lave os frascos de cultura com 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar os tubos por 10 min a 450 x g a 4 ° C. Prepare o celular gelada congelamento médio (KSFM + 10% de DMSO).</li>
	<li>Ressuspender as células em KSFM + 10% de DMSO, contar as células e congelar as células em uma densidade de 6 x 106 células/mL, usando de métodos de criopreservação de congelamento lento padrão12.</li>
	<li>Armazene os queratinócitos em nitrogênio líquido (fase vapor) até que esteja pronto para usar.</li>
</ol>
4. descongelar e cultivo queratinócitos congelados
<ol>
	<li>Descongele rapidamente os frascos apropriados congelados em banho maria a 37 ° C. Use etanol a 70% para limpar o exterior do cryovial. Transferir o número adequado de células (aproximadamente 15.000 células/cm2) para um balão de cultura e adicione imediatamente meio de cultura previamente aquecido (KSFM) para o frasco de cultura. Qualquer tamanho de frascos de cultura pode ser usado dependendo da instalação do experimento.</li>
	<li>Use 5 mL de meio de cultura para um frasco de cultura 25 cm2 .</li></ol>O número de células adicionado que o frasco de cultura pode variar, porque o crescimento das células varia de um doador para o doador. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO2.
	<li>Alterar o meio depois de 2 dias e três vezes semanalmente usando fresco KSFM previamente aquecido. Nota: Nossos dados demonstraram que, em média, 95% das células isoladas pelo protocolo descrito aqui são positivas para o queratinócito-marcador cytokeratine-1413.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. O autor não tem nenhum conflito de interesses.

Aqui, descrevemos como isolar facilmente queratinócitos humanos primários da pele adulta e como a cultura deles em vitro. Este modelo pode ter uma aplicação ampla para a investigação da biologia das células epidérmicas e pode ser útil para pesquisadores interessados no estudo de doenças cutâneas.
Algumas das vantagens do protocolo descrito aqui é que, em contraste com os queratinócitos isolados do prepúcio neonatal obtido de recém-nascido machos submetidos à circuncisão, queratinócito...

A pele é o maior órgão do corpo humano e serve como uma barreira protetora contra o ambiente externo. A pele é composta de duas camadas principais: a derme e epiderme, onde a epiderme constitui a camada mais externa da pele. O tipo mais abundante de células na epiderme é os queratinócitos que compreende mais de 95% da célula em massa1,2. Os queratinócitos são mantidos em vários estágios de diferenciação na epiderme e são organizados em camadas basais, espinhosos, granulares e cornificadas que correspondem às fases específicas de diferenciação3. A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, produzindo assim uma barreira intacta ao mundo exterior.
Os queratinócitos também representam a primeira linha de defesa contra patógenos na pele e, portanto, desempenham um papel importante na resposta imune inata4,5. Exposição dos queratinócitos a estímulos externos leva à ativação das vias de sinalização intracelulares e, posteriormente, a produção de um número de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Estas proteínas derivadas de queratinócitos participarem na resposta inflamatória, recrutamento e ativação de células imunes como específico T células6,7, neutrófilos e células dendríticas. Assim, porque os queratinócitos desempenham um papel crucial em inúmeros processos biológicos, a lógica por trás da técnica apresentada aqui foi gerar um modelo in vitro para estudar a biologia da pele. Culturas de queratinócitos primários obtidas de prepúcio neonatal são frequentemente utilizadas para estudar pele biologia8,9. No entanto, com a técnica descrita aqui, queratinócitos de ambos os sexos são obtidos resultando em uma maior diversidade biológica das células.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e a geração de queratinócitos humanos primários da pele de adulto, incluindo manutenção e congelamento de queratinócitos. O objetivo geral deste método é gerar queratinócitos humanos primários que podem ser usados como um modelo para estudar Biologia cutânea in vitro.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034 Meio de</td><td>cultura celular</td></tr><tr><td>Suplementos KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Suplementos para KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS sem Cálcio e Magnésio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimetil sulfóxido</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Aditivo de meio de cultura de células Filtro</td></tr> de <tr><td>esterilização</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,2 &micro; m</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Usado para tripsinizar células</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Usado para inativar tripsina</td></tr><tr><td>Fórceps</td> <td>-</td><td></td> <td>Fórceps de qualquer empresa podem ser usados</td></tr><tr><td>Tesouras</td> <td>-</td><td></td> <td>Tesouras de qualquer empresa podem ser usadas</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Bisturis de qualquer empresa podem ser usados</td></tr><tr><td>70% de etanol</td> <td>-</td><td></td><td>--</td></tr> <tr><td>Almofadas de gaze</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Almofadas de gaze de qualquer fornecedor podem ser usadas</td></tr><tr><td>Plaina de pé</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Plaina de pé de qualquer fornecedor pode ser usada</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Placas de Petri de qualquer fornecedor podem ser usadas</td></tr><tr><td>Filtro de metal</td> <td>-</td><td></td> <td>Filtro de metal interno de 1 mm de tamanho de furo</td></tr> de <tr><td>75 cm<>2 Frascos de cultura</td><td>NUNC</td> <td>156499-150</td><td></td></tr> <tr><td>cm2</td><td>TTP</td><td>90151-0,05</td><td></td></tr><tr><td>% Solução de tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Usado para tripsinizar células ao passar</td></tr></tbody></table>

geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, mantendo assim uma barreira mecânica ao mundo exterior. Além disso, os queratinócitos desempenham um papel essencial na iniciação, manutenção e regulamento de epidérmicos respostas imunes por ser parte do sistema imunológico inato, respondendo a estímulos antigênicos de forma rápida e não específica. Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de queratinócitos humanos primários da pele de adulto e demonstrar que estas células respondem à diferenciação terminal induzida por cálcio, como medido por um aumento da expressão da involucrin de marcador de diferenciação. Além disso, mostramos que os queratinócitos isolados são responsivos à IL-1 β-induzida por ativação de vias de sinalização intracelulares, medida pela ativação da via MAPK p38. Tomados em conjunto, descrevemos um método para isolamento e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele adulta. Porque os queratinócitos são o tipo de célula predominante na epiderme, este método é útil para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea in vitro.

Diferenciação Terminal induzida por cálcio Queratinócitos humanos passam por diferenciação terminal após tratamento com cálcio14,15,16. Queratinócitos humanos primários foram isolados e cultivados conforme descrito no protocolo acima. Quando aproximadamente 50-60% de confluencia, as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou veículo e fotos das células foram tiradas no dia 0, 1 e 2. <strong class="xfig"...

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar queratinócitos humanos primários que podem ser usados como modelo para estudar a biologia cutânea in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular epidérmica, como a forma como a diferenciação de queratinócitos humanos é regulada ou como um modelo para estudar doenças inflamatórias da pele. As principais vantagens desta técnica são que os queratinócitos humanos primários podem ser convencionalmente isolados da pele adulta de homens e mulheres e podem incluir pele de pessoas de qualquer idade com mais de 18 anos.Demonstrando o procedimento estará Annette Blak Rasmussen, uma técnica do meu laboratório. Para começar, prepare uma solução de 50 mililitros de 0,25% de tripsina e 0,1% de glicose em DPBS. Em seguida, misture e filtre e esterilize a solução.Prepare 10 mililitros de RPMI 1640 mais 2% FBS, 50 mililitros de DPBS e meio livre de soro de queratinócitos, ou KSFM. Adicione suplementos de KSFM e 250 microlitros de gentamicina a 500 mililitros de KSFM. Em seguida, pré-aqueça as soluções a 37 graus Celsius antes de usar.Colete amostras de pele de 10 centímetros por 15 centímetros de voluntários adultos saudáveis submetidos a cirurgia plástica. Mantenha a pele fresca transportando-as em uma caixa de isopor contendo um elemento de resfriamento. Se necessário, armazene a amostra de pele a quatro graus Celsius durante a noite.Usando tesouras esterilizadas, bisturis e pinças, remova a gordura de baixo da seção da pele. Em seguida, usando agulhas, prenda a seção de pele em uma capa estéril em cima de um prato. Com uma gaze seca e esterilizada, limpe a pele.Em seguida, siga com 70% de etanol em uma gaze esterilizada. Em seguida, usando uma plaina de pé, corte a camada epidérmica superior da seção da pele e transfira-a para uma placa de Petri de nove centímetros. Em seguida, adicione imediatamente 25 mililitros da solução de glicose de tripsina DPBS previamente preparada à placa de Petri.Incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Usando uma pipeta, remova a solução de glicose de tripsina DPBS da placa de Petri e adicione 10 mililitros de RPMI 1640 mais 2% de FBS para inativar a tripsina. Agora, com duas pinças, libere as células epidérmicas no meio raspando e agitando suavemente o compartimento epidérmico e dérmico das seções da pele.Filtrar a suspensão de células epidérmicas através de um filtro metálico e recolher o filtrado para um tubo de 50 mililitros. Adicione as seções de pele restantes a um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de RPMI 1640 sem FBS e vórtice por 10 segundos. Filtrar esta suspensão através do filtro metálico para um tubo de 50 mililitros contendo a suspensão de células epidérmicas.Em seguida, adicione DPBS a um volume total de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão da célula a 450 vezes G e à temperatura ambiente, durante 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e, dependendo do tamanho do pellet celular, ressuspenda o pellet de células epidérmicas em aproximadamente 10 mililitros de 37 graus Celsius KSFM.Usando o método de coloração com azul de tripano, conte as células ao microscópio. Em seguida, para cada frasco de cultura de 75 centímetros quadrados, transfira oito vezes 10 para as sextas células, juntamente com 12 mililitros de 37 graus Celsius KSFM. Agitar suavemente os frascos de cultura para assegurar uma distribuição uniforme das células.Incubar os queratinócitos em uma incubadora a 37 graus Celsius com 100% de umidade e 5% de CO2. Trocar o meio após dois dias e depois três vezes por semana. Quando as células atingirem 70-80% de confluência, mantenha a quantidade apropriada de solução de EDTA de tripsina a 0,05% a 37 graus Celsius em uma incubadora.Remova o meio das células e adicione 4,5 mililitros por frasco de cultura de 75 centímetros quadrados de solução pré-aquecida de EDTA a 0,05% de tripsina às células. Depois de colocar o frasco de cultura na incubadora a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos, verifique ao microscópio se as células começaram a se soltar. Quando aproximadamente 50% das células estiverem soltas, bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes.Em seguida, para inativar a tripsina, adicione seis mililitros de RPMI 1640 a 37 graus Celsius mais 2%FBS ao frasco de cultura de 75 centímetros quadrados e transfira a suspensão celular para tubos de 50 mililitros. Lave os frascos de cultura com três mililitros de RPMI 1640 mais 2% FBS e adicione o meio aos tubos de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue as células por 10 minutos a 450 vezes G e temperatura ambiente.Use 10 mililitros de KSFM a 37 graus Celsius para ressuspender as células peletizadas. Em seguida, conte e transfira três vezes 10 para as sextas células para um frasco de cultura de 150 centímetros quadrados, juntamente com 20 mililitros de KSFM a 37 graus Celsius. Agitar suavemente o balão de cultura para assegurar uma distribuição uniforme das células, antes de as devolver à incubadora.Quando a cultura estiver 80-90% confluente, após tripsinizar e transferir as células para tubos de 50 mililitros, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, enxágue os frascos de cultura com seis mililitros de RPMI 1640 mais 2% FBS e adicione-o aos tubos de 50 mililitros. Centrifugue os tubos por 10 minutos a 450 vezes G e quatro graus Celsius. Em seguida, prepare o meio de congelamento de células geladas.Ressuspenda o pellet celular em KSFM mais 10% DMSO. Em seguida, depois de contar as células, congele-as a uma densidade de seis vezes 10 elevado a sextas células por mililitro, usando métodos padrão de criopreservação de congelamento lento. Armazene os queratinócitos em nitrogênio líquido até que estejam prontos para uso.Como visto aqui, os queratinócitos humanos foram isolados e cultivados, como demonstrado neste vídeo e depois estimulados com cálcio. Essas imagens mostram as alterações morfológicas devido à adição de cálcio nos dias um e dois, em comparação com as células tratadas controladas. Além das alterações morfológicas, a adição de cálcio também resultou em um aumento na transcrição de mRNA para o marcador de diferenciação Involucrin, 5,5 vezes após 24 horas e 3,5 vezes após 48 horas.Neste experimento, os queratinócitos cultivados foram estimulados com IL-1 beta por vários períodos de tempo. Como visto por Western blotting, em cinco minutos, a estimulação com IL-1 beta levou a uma rápida fosforilação de ativação da p38 MAP quinase, pois a estimulação com IL-1 beta não teve efeito sobre os níveis de proteína total da p38 MAP quinase. Após uma hora, a fosforilação da MAP quinase p38 induzida pela IL-1 beta retornou aos níveis basais.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular epidérmica humana explorarem o papel dos queratinócitos nas respostas imunes inatas, bem como no desenvolvimento da pele. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar queratinócitos primários da pele humana adulta, que pode ser usada como modelo para estudar a biologia cutânea in vitro.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Este vídeo descreve o isolamento de queratinócitos - as células mais proeminentes da camada epidérmica da pele humana, empregando uma combinação de digestão enzimática e métodos de ruptura mecânica. Este método ajuda no crescimento preferencial de queratinócitos em relação a outros tipos de células da pele usando um meio de crescimento seletivo.

Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para a produção de retrovírus recombinante de queratinócitos humanos primários geneticamente modificados. Este método pode ser usado para manipular a expressão gênica em queratinócitos.

Modificação Genética de Queratinócitos Humanos Primários: Um Método para Manipular Geneticamente Queratinócitos Usando Retrovírus Recombinantes

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo abrangente e detalhado sobre como gerar pele organotípica humana geneticamente modificada a partir de queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Este protocolo descreve um método simples para cultivar epiderme humana reconstituída tridimensional de forma reprodutível e robusta. Além disso, caracteriza a relação estrutura-função do modelo de barreira epidérmica. Também são apresentadas as respostas biológicas da epiderme humana reconstituída sobre estímulos proinflamatórios.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura dos queratinócitos orais derivados do paladar do rato adulto. Um método de avaliação utilizando imunostaining também é relatado.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

Este protocolo descreve a cultura de queratinócitos recém-obtidos (passagem 0) para uso em imagens de células vivas.

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Aprenda a isolar e cultivar queratinócitos humanos primários de pele adulta para estudar biologia cutânea in vitro. Este método permite investigar diferenciação celular e doenças inflamatórias da pele em ambiente controlado.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Explorar mais vídeos