Cinemática ocular medida na Vitro estimulação dos nervos cranianos na tartaruga

Este protocolo descreve como usar uma em vitro isolado Tartaruga cabeça preparação para medir a cinemática dos seus movimentos do olho. Após a remoção do cérebro do crânio, nervos cranianos podem ser estimulados com correntes para quantificar as rotações do olho e alterações no tamanho da pupila.

O objetivo geral deste protocolo eletrofisiológico é fornecer a capacidade de medir a cinemática dos movimentos oculares da tartaruga deslizante de orelhas vermelhas usando uma preparação de cabeça isolada in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo ocular-motor, como a evolução da visão nas tartarugas. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer treinamento de animais para rastrear alvos e usa um gimbal para calibrar seus movimentos oculares.

Demonstrando essa técnica está Steven Nesbit, um estudante de graduação em meu laboratório. Comece com a cabeça da tartaruga em um prato de dissecação. Tenha uma solução de toque de tartaruga suficiente à mão para irrigar o tecido.

Mantenha o tecido a quatro graus Celsius, colocando gelo ao redor da parte externa do prato. Coloque uma sonda de dissecção romba pela boca para facilitar o manuseio da cabeça. Em seguida, enquanto trabalha sob um microscópio de dissecação, corte a articulação que conecta o osso dentário ao crânio com o bisturi.

Em seguida, use rongeurs para puxar a mandíbula inferior para longe do crânio. Em seguida, retire a pele e os músculos de suas inserções nas regiões dorsal e lateral do crânio. Depois de identificar a coluna vertebral na extremidade do cavum do crânio, dobre a coluna vertebral ventralmente para expor a medula espinhal e use uma microtesoura para cortar a medula espinhal.

Use rongeurs para remover a coluna vertebral e outros tecidos do crânio, puxando caudalmente. Em seguida, faça dois cortes superficiais no crânio dorsal, começando no forame magno e retire cuidadosamente o crânio dorsal. Use uma micro tesoura para remover as meninges e expor o resto do cérebro.

Remova meninges suficientes para permitir a identificação dos bulbos olfatórios na cavidade craniana anterior. Continue a irrigar o cérebro com solução de anel de tartaruga, conforme necessário. Em seguida, usou uma pinça curva para puxar suavemente o cérebro caudalmente e produzir uma leve tensão nos nervos cranianos.

Corte e remova cuidadosamente os bulbos olfatórios e o cérebro com uma pinça curva. Em seguida, use uma microtesoura para empurrar suavemente o mesencéfalo em direção à linha média e expor os nervos cranianos. O nervo craniano três pode ser visto na frente do nervo craniano quatro.

O diâmetro do nervo quatro é ligeiramente menor que o nervo três. Em seguida, corte o percurso esquerdo e direito do nervo óptico, ou nervo craniano dois. Corte os nervos três e quatro onde eles se ligam ao mesencéfalo.

Repita isso do outro lado. Incline o tronco encefálico para um lado e observe o nervo craniano seis, o nervo abducente, emergindo da superfície ventral perto da junção da ponte e da medula. Corte o nervo craniano seis no lado esquerdo e direito.

Remova as partes restantes do tronco cerebral da cabeça com uma pinça fina e uma microtesoura. Quando o crânio estiver vazio, examine o assoalho da cavidade craniana e identifique os nervos três, quatro e seis. Por fim, remova as pálpebras superiores e inferiores com pinças finas e microtesouras.

Coloque a cabeça da tartaruga no mandril do cardan. Em seguida, use um pequeno nível de bolha para verificar se a superfície dorsal da cabeça está paralela ao horizonte. Posicione um dos olhos no centro das rotações horizontal e vertical do gimbal.

Incline uma câmera infravermelha 45 graus acima da linha de visão do olho. O LED infravermelho deve estar na posição das 11 horas, ao olhar para a lente da câmera, para centralizar o LED ao longo do acesso óptico do olho. Ajuste a distância da câmera do olho para que a visão da câmera seja preenchida ao máximo pelo globo ocular.

Certifique-se de que os cantos do olho estejam nas bordas da visualização horizontal. Foque a câmera para obter uma imagem nítida do olho. Em seguida, use os três graus de ajuste linear fornecidos com o gimbal para posicionar o olho no centro da câmera view.

Detecte a pupila do duto definindo o limite e o contraste adequadamente usando o programa fornecido com o sistema de rastreamento ocular baseado em vídeo. Usando o mouse, clique no menu Vídeo e, em Modo, selecione Alta precisão para capturar imagens a uma taxa de amostragem de 30 hertz, dando resolução de 640 pixels por 480 linhas. Além disso, em Vídeo, abra Tipo de pupila e selecione Pupila escura e Elipse, elipse girada, para o método de segmentação de pupila.

Na janela EyeCamera, clique no ícone de ajuste da área de pesquisa da pupila. Use o mouse para arrastar um retângulo que limita uma área ao redor da pupila, evitando áreas escuras que possam ser confundidas com a pupila. Em seguida, na janela Controles, confirme se as caixas de AutoImagem e Rastreamento de Limite de Bloqueio Positivo estão marcadas.

Clique em AutoThreshold para otimizar a densidade da digitalização, que será exibida como pontos verdes sobre a pupila escura. Calibre a exibição de vídeo do programa de rastreamento ocular baseado em vídeo para as rotações do gimbal e calibre a rotação de torção conforme descrito no texto. Coloque uma régua no mesmo plano focal da pupila e registre a largura da visão completa da câmera.

Para posicionar os eletrodos, primeiro insira um eletrodo de referência de pino no tecido conjuntivo ou muscular remanescente na cabeça. Combine o tamanho do nervo a ser estimulado com uma ponta de vidro capilar polido a fogo e coloque a ponta de vidro no eletrodo de sucção. Encha o eletrodo de sucção com solução de campainha e ajuste o volume dentro da seringa para cerca de metade de sua capacidade.

Certifique-se de que os nervos cranianos estejam claramente visíveis. Em seguida, enquanto olha através de um escopo de dissecção montado na lança, use o micromanipulador para mover cuidadosamente a ponta de vidro do eletrodo para uma posição acima da extremidade cortada do nervo selecionado e abaixo da superfície da solução de campainha que preenche o crânio. Puxe o êmbolo da seringa para trás.

O vácuo atrairá o nervo para o final da ponta capilar. Conecte o eletrodo de sucção ao dispositivo de isolamento de corrente usando um cabo. Conecte o cabo do eletrodo de referência do pino à conexão de aterramento do dispositivo de isolamento.

Use os mostradores e interruptores no estimulador e no dispositivo de isolamento para inserir os parâmetros de estimulação. Use uma faixa de correntes de um a 100 mircoamps, com frequência de 10 a 400 hertz. Use pulsos de um ou dois milissegundos em trens com duração de 100, 500, 1000 milissegundos.

Para visualizar o tempo das aplicações atuais e sua influência nos movimentos oculares, clique no menu PenPlots. Selecione X Posição do olhar, Y Posição do olhar, Torção e Largura da pupila para mostrar os gráficos de dados brutos em tempo real x e y posições dos olhos, torção e largura da pupila. Além disso, selecione Segundos e Marcadores no menu PenPlots para mostrar o gráfico de tempo com marcas de escala, que aparecem em intervalos de um segundo.

Para ajudar a acompanhar o tipo de correntes aplicadas, clique no menu do Windows e selecione DataPad. A janela KeyPad, DataMarker aparecerá. Clique na letra ou número para identificar os parâmetros das estimulações atuais que estão sendo entregues ao nervo e analise os dados conforme descrito no texto do protocolo.

Este traço mostra o diâmetro médio da pupila de seis estímulos em uma preparação, as linhas tracejadas mostram o desvio padrão. A forma de onda retangular no eixo x denota o início e o deslocamento de um trem de 100 hertz de pulsos de milissegundo, com uma amplitude de 50 micro amperes. Este esboço mostra a orientação da linha da íris no olho antes da estimulação.

Esta imagem mostra um quadro estático de um ensaio representativo antes da estimulação. Esta imagem mostra o olho durante a estimulação. Aqui, o olho é visto após a estimulação.

Ao tentar este procedimento, é importante levar o seu tempo durante a dissecção para combinar o tamanho do eletrodo de sucção com cada nervo craniano e colocar a cabeça adequadamente no gimbal. Após esses procedimentos, outros métodos, como testar diferentes temperaturas ou aplicar agentes farmacológicos, incluindo analgésicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como esses fatores influenciam os movimentos oculares e a capacidade de sobrevivência do tecido nervoso.