Name: Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a reprogramar células germinativas em neurônios em Caenorhabditis elegans usando RNAi para depletar LIN-53 e choque térmico para induzir CHE-1. Este método permite estudar reprogramação celular in vivo.

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Agradecemos a Alina El-Khalili e Martina Hajduskova para obter assistência técnica. Agradecemos a membros do grupo jocelito para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi patrocinado pela ERC-StG-2014-637530 e ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 e é suportado pelo Max Delbrueck Center para Medicina Molecular na associação Helmholtz.

Todos os métodos descritos aqui com relação ao cuidado animal foram aprovados pela LaGeSo Berlim, Alemanha
1. preparação da solução
<ol>
	<li>Placas de ágar de NGM (1 L)
	<ol>
		<li>Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de mídia peptona (por exemplo, Bacto-peptona) e 20 g de ágar-ágar. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de colesterol (5) mg/mL em estoque de EtOH 95%, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1m K2PO4e 1 mL de anfotericina B (estoque de 2,5 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placas de ágar-NGM RNAi (1 L)
	<ol>
		<li>Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de mídia peptona e 20 g de ágar-ágar. Após autoclavagem adicionar, 1 mL de colesterol (5) mg/mL em estoque de EtOH 95%, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL de anfotericina B (estoque de 2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M IPTG e carbenicilina 1ml (50mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-ágar (1 L)
	<ol>
		<li>Adicionar 10 g de mídia de peptona, extrato de 5 g de fermento, 5 g de NaCl, 20 g de ágar-ágar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Adicionar O H2para 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina 50mg/mL e 2,5 mL de tetraciclina 5mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Meio LB (1 L)
	<ol>
		<li>Adicionar 10 g de mídia de peptona, extrato de 5 g de fermento, 5 g de NaCl e 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Adicionar O H2para 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-tampão (1 L)
	<ol>
		<li>Adicione 3 g de KH2PO46,0 g de Na2HPO4, 5g de NaCl e 50 mg de gelatina. Antes do uso, adicione 1 mL de 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solução de branqueamento (10ml)
	<ol>
		<li>Adicione 1 mL de NaClO e 2 mL de NaOH de N 5. Adicione 10 mL H2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. preparação das placas de RNAi
Nota: C. elegans é normalmente cultivadas em laboratório em placas de Petri de 6cm contendo 7,5 mL de nematódeo crescimento médio ágar (ágar-NGM)10,11. Este protocolo é otimizado para vermes mantidas a 15 ° C. Para preparar pratos com NGM, use técnicas padrão estéril para evitar a contaminação bacteriana e fúngica. O seguinte é o protocolo para preparar pratos NGM suplementados com reagentes para RNAi.
<ol>
	<li>Prepare-se placas de ágar-NGM RNAi 6 cm contendo 1 mM isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 50 carbenicilina µ g/mL. Deixe-os secar por 24 – 48 h à temperatura ambiente no escuro12.
	<ol>
		<li>Mantenha as placas de RNAi a 4 ° C, no escuro. Não use se mais de 14 dias.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selecione o clone de bactérias (Escherichia coli HT115) de RNAi contendo o plasmídeo L4440 com a sequência de DNA do gene de lin-53 do estoque congelado glicerol do disponível biblioteca RNAi13 em placas LB-ágar contendo 50 µ g/mL carbenicilina e 12,5 µ g/mL tetraciclina, usando o padrão de estrias trifásico. Crescem as bactérias em 37 ° C durante a noite12. Este clone permite a produção de IPTG-dependente de lin-53 dsRNA nas bactérias.
	<ol>
		<li>Além disso, crescem as bactérias de RNAi que contêm o plasmídeo L4440 sem qualquer sequência de genes, como o de controle de vetor vazio14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>No dia seguinte, escolher uma única colônia de lin-53 ou placas de vetor vazio LB-ágar usando uma pipeta de 200 µ l de ponta e inocular cada um em um tubo de cultura separada contendo 2 mL de líquido LB médio14 suplementado com 50 carbenicilina µ g/mL. Cultivar culturas durante a noite a 37 ° C até atingirem uma densidade óptica (OD) em 600 nm de 0.6-0.8. Medir o OD usando um espectrofotômetro15. Cuidado: A líquido LB mídia não deve conter tetraciclina em contraste com a placa de ágar LB usada para estrias as bactérias a partir do estoque de glicerol, desde a inclusão de tetraciclina durante a alimentação leva a uma diminuição de eficiência de RNAi 12</li>
	<li>Adicione 500 µ l de cada cultura bacteriana (lin-53 ou vetor vazio) para placas de ágar-NGM RNAi 6cm usando um multipipette. Incube as placas com uma tampa fechada durante a noite à temperatura ambiente no escuro para secar. Durante este tempo, o IPTG nas placas de NGM vai induzir a produção de dsRNA nas bactérias.
	<ol>
		<li>Use pelo menos 3 pratos por cultura bacteriana por experiência. Isto irá fornecer técnicas 3 repetições para cada experimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Loja secas NGM-agar RNAi placas com bactérias a 4 ° C, no escuro por até duas semanas.</li>
</ol>
3. preparação de BAT28 de tensão de c. elegans
<ol>
	<li>Manter a tensão de verme BAT288 contendo os transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] sobre as bactérias OP50 usando placas de ágar-NGM padrão a 15 ° C. Nota: Para protocolo detalhado na cultura de nematoides, consulte10. O rol-6(su1006) é um alelo dominante e comumente usado injeção fenotípica marcador16 que provoca o movimento de rolamento típico. É usado para rastrear no transgene otIs305 hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Manter a tensão de BAT28 a 15 ° C em todos os momentos para evitar ativação precautious do hsp-16.2prom::che-1 transgene. Reduza a exposição a temperaturas superiores a 15 ° C enquanto a tensão o máximo possível de manipulação.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para idade-sincronizar vermes, use a técnica branqueamento17.
	<ol>
		<li>Lave pratos de 6 cm NGM-ágar contendo adultos e ovos de BAT28 usando 900 µ l M9 buffer. Vermes de pelota por centrifugação a 900 x g por 1 min. Retire o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 0,5 – 1 mL de solução de branqueamento e agitar o tubo para aproximadamente 1 min até vermes adultos começam a estourar aberto. Monitor usando um microscópio estereoscópico padrão.</li>
		<li>Vermes de pelota por centrifugação a 900 x g por 1 min. Retire o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o pellet worm 3 vezes adicionando 800 µ l de tampão de M9 e centrifugação a 900 x g.</li>
		<li>Coloque os ovos limpos em NGM-pratos frescos, inoculados com bactérias OP50. Cresce uma população branqueada em bactérias OP50 a 15 ° C, até atingirem o estágio de L4 (cerca de 4 dias). As larvas L4 podem ser reconhecidas por um remendo branco aproximadamente na metade do caminho ao longo do lado ventral do worm18 usando um microscópio estereoscópico padrão. Nota: Para atingir as células germinativas ao fenótipo de conversão neurônio após esgotamento de lin-53, ele precisa estar esgotado na geração parental (P0).</li></ol></li></ol>O placar para o fenótipo de conversão é realizado na geração seguinte (filial geração F1). Para atingir o empobrecem lin-53 já no P0, L4 animais são submetidos a RNAi.
	
	
	<li>Manualmente transferi 50 L4 palco vermes por replicar usando um fio de platina para uma placa NGM que não contêm qualquer bactéria e deixe vermes afastar qualquer bactéria OP50 transferidas. Vamos vermes na chapa durante cerca de 5 minutos. Bactérias de uso das placas RNAi NGM-ágar previamente inoculado com bactérias de RNAi lin-53 (ou controle de vetor vazio) para transferir para as respectivas placas de RNAi.
	<ol>
		<li>Evite transferir bactérias OP50 para as placas de RNAi reais. Trabalho rápido para minimizar o tempo de exposição da estirpe de temperaturas superiores a 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incube vermes em placas de ágar-NGM RNAi a 15 ° C por aproximadamente 7 dias até F1 progênie dos vermes atinge L3-L4 palco. Eles podem ser claramente separados dos animais P0 desde que eles são maiores e mais espessas do que a progênie F1.
	<ol>
		<li>Verifique visualmente sob um estereomicroscópio padrão se vermes de progênie F1 mostram o fenótipo salientes de vulva (pvul), como mostrado na Figura 1. RNAi contra lin-53 tem efeitos pleiotrópicos e faz com que o fenótipo de pvul que pode ser usado para avaliar se o RNAi contra lin-53 tem sido bem sucedida. Nota: RNAi contra lin-53 também pode causar letalidade de embriões de F1. Este efeito aumenta se as placas estão expostas a graus mais elevados do que 15 ° C antes de animais chegaram a L3-L4 fase. Os embriões mortos podem ser reconhecidos por desenvolvimento preso e falta de incubação.</li>
		<li>Incube as placas no escuro desde IPTG é sensível à luz.</li>
	</ol>
	</li>

4. indução de reprogramação de células germinativas
<ol>
	<li>Incubar as placas de RNAi examinadas contendo lin-53 e esvaziar vetor F1 tratados com RNAi progênie por 30 min a 37 ° C, no escuro para ativar-1. Use uma incubadora ventilada desde que permite um calor-choque mais eficiente.</li>
	<li>São permitidos animais de calor-choc recuperar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro e então incubar as placas a 25 ° C durante a noite, no escuro.</li>
	<li>Usando um estereomicroscópio padrão acoplado a uma fonte de luz de fluorescência, examinar os animais sob o filtro GFP para gcy-5prom::gfp-derivado sinais na área dos vermes de corpo médio, como mostrado na Figura 2. Conjunto de microscópio para sinais GFP: excitação máxima em 488 nm com emissão máxima de 509 nm.</li>
	<li>Avalie o grau de células germinativas para conversão do neurônio por animais de montagem com sinais de boas práticas agrícolas na área de meio corpo no ágar contendo almofada microscopia slides19.
	<ol>
		<li>Conte o número de animais mostrando as células germinativas para conversão de neurônio vs os animais escuros para avaliar a penetrância de fenótipo. Normalmente, ao redor 30% dos animais mostram sinais discretos de GFP no germline ao esgotamento de lin-53 , Considerando que não mais de 5% dos animais mostram sinais GFP difusos no germline ao vetor vazio RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li>
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</ol>

Os autores declararam que não há interesses concorrentes existem.

Enquanto o protocolo descrito usando os transgênicos c. elegans Coe BAT28 e RNAi contra lin-53 é simples, várias etapas são críticas em ordem para garantir o resultado esperado de células germinativas para reprogramação do neurônio. É importante que a tensão BAT28 é mantida a 15 ° C, em todos os momentos antes dos experimentos. Durante a manipulação e manutenção da tensão, o tempo em temperaturas acima de 15 ° C precisa ser minimizada tanto quanto possível. Condições de calor-choque adequada são importantes pois insuficiente indução de -1 superexpressão não resultará em células germinativas para conversão de neurônio ASE. Isto pode ser detectado medindo-se a penetrância fenótipo conforme descrito no protocolo. Calor-choque extensa pode levar a letalidade dos animais. Por exemplo, placas que foram colocadas perto de paredes internas ou no chão de uma incubadora de ar estática inferior frequentemente experimentam extensa de tratamento térmico. Portanto, é recomendável usar uma incubadora de calor ventilado. Além disso, timing da indução calor-choque é crítico desde sobre-expressão do -1 durante estágios larvas mais cedo então L3 pode levar a indução de gravidez ectópica gcy-5prom::gfp em regiões diferentes do corpo, tais como a vulva (Figura 3) 9. Além disso, calor-choque extensa pode ser detectada pela penetrância de fenótipo em animais de RNAi vetor vazio, que não deve estender a 5% e aumento de autofluorescência de outros tecidos, ou seja, o intestino.
Esporadicamente, RNAi bactérias podem perder sua atividade para produzir eficientemente dsRNA do gene do alvo. Infelizmente, isto não pode ser detectado antes do experimento de RNAi. Em tais casos uma raia fresca do glicerol deve ser cultivada como descrito na secção 2 do protocolo. Se houver ainda não causado por RNAi pleiotrópicos fenótipo visível, tais como o fenótipo pvul causada pelo sucesso RNAi contra lin-53, então um plasmídeo isolamento do DNA da bactéria respectivos deve ser executado e fresco HT115 bactérias precisam ser transformadas com o plasmídeo L4400 que contém a sequência de lin-53 .
Importante, a tensão de BAT28 tem um o fenótipo de rolo causado pela injeção marcador pRF4, que foi utilizada durante a transgênese dos animais com o hsp-16.2prom::che-1 construção de DNA. Ocasionalmente, os animais perdem o fenótipo de rolamento, que pode indicar o silenciamento do hsp-16.2prom::che-1 transgene. Para manter corretamente a tensão BAT28, escolher 10 animais de rolo para um prato fresco e propagar selecionando para rolar os animais.
A aplicação do protocolo é limitada para o procedimento de RNAi F1, que significa que os animais cujos pais (geração de P0) não tem sido expostos a lin-53 RNAi não mostrará células germinativas para conversão de neurônio devido resgate materno4. Um procedimento alternativo para converter as células germinativas em neurônios tem sido descrito por Ciosk e colegas15 usando RNAi knock-down de gld-1 e 3-mex sem sobre-expressão de um fator de transcrição. No entanto, os neurônios obtidos não pertencem a um tipo específico de neurônios e células germinativas também converter em células de músculo, como após mediada por RNAi depleção de gld-1 e mex-315. Anteriormente, foi demonstrado o RNAi contra lin-53 permitiu a conversão de células germinativas, em células gabaérgica neurônio após sobre-expressão do factor de transcrição de homoedomain de Pitx-tipo UNC-3016 em vez de-14 . Para direções futuras, transcrição de destino de indução diferente fatores podem ser testados se lin-53 depleção de células germinativas pode ser convertida em outros tipos de células do que neurônios específicos. Neste contexto, a superexpressão do factor de transcrição bHLH miogênico HLH-1, homólogo dos mamíferos MyoD17, induz a conversão de células germinativas de músculos sobre lin-53 RNAi5. A reprogramação estabelecida de células germinativas para um tipo específico de células somáticas sobre lin-53 RNAi e sobre-expressão de um fator de transcrição indutora de destino apropriado pode ser usada para um número de diferentes telas de genéticas. Essas telas supressor ou potenciador podem ajudar dissecando regulamentares vias que desempenham um papel durante a conversão de destino da célula.

Célula de destino reprogramação pela expressão ectópica de TF como o miogênico TF MyoD, que, quando overexpressed, fibroblastos convertidos diretamente em células musculares1, tem sido um foco de pesquisa há décadas. No entanto, células diferenciadas são muitas vezes refratárias para este processo, devido a mecanismos que salvaguardar a sua identidade celular. Células germinativas mostrar um grau de proteção similar e existem mecanismos subjacentes que muitas vezes agem como uma barreira para impedir a conversão de células germinativas em outros tipos de células a sobre-expressão de um destino de indução TF. Normalmente, o Regulamento epigenético como modificações do histone e estrutura da cromatina impõe um impedimento para a conversão da célula destino2,3. Temos anteriormente aplicada a genética reversa usando RNAi knock-downs em c. elegans e identificou fatores que salvaguardar identidades celulares e, assim, neutralizar a reprogramação das células germinativas em neurônios4. Especificamente, o polycomb 2 complexo repressivas (PRC2) e o acompanhante de histona altamente conservadas LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 em humanos) impedem a conversão direta de células germinativas em tipos específicos de células somáticas como neurônios de sabor glutamatérgico em c. elegans 4 , 5. para identificar essas células germinativas reprogramação fatores barreira, usamos animais transgénicos, carregando o calor-choque inducible Zn-dedo CHE TF-1. -1 é normalmente expressa em dois neurônios cabeça de c. elegans, onde especifica que o destino dos neurônios de sabor glutamatérgico denominado ASE6. O destino de neurônio ASE pode ser visualizado pela expressão do ASE específico fluorescente repórter gcy-5prom::gfp. GCY-5 é um chemoreceptor apenas expressado em ASE certo neurônio7. Após o esgotamento de lin-53 por RNAi e indução de ampla expressão ectópica de-1 por calor-choque, as células germinativas pode ser convertidas em neurônios na vivo4,5. Importante, sincronismo de RNAi tratamento é crucial como único adultos vermes (geração de P0) expostos a lin-53 RNAi dão origem a animais de progênie F1 com uma linha germinativa que é permissiva para reprogramação em neurônios4.
As células germinativas descritas acima para o procedimento de conversão neurônio em c. elegans pode ser usada para estudar uma variedade de questões biológicas como a implicação de sinalização de caminhos na célula destino reprogramação. Por exemplo, usamos a célula germinal 1-induzida reprogramação em neurônios de ASE em cima de RNAi contra lin-53 para estudar a implicação do entalhe sinalização via processo de reprogramação8de células germinativas. Através da realização de RNAi duplo para co empobrecem lin-53 e o histona demetilase-codificação gene utx-1 , mostramos que o entalhe sinalização via neutraliza o silenciamento de genes mediada por PRC2, ativando a expressão de UTX-1 no germline8 . Esta constatação demonstra que a conversão de células germinativas de neurônios descrito neste protocolo poderia ser usada para estudar um processo biológico complexo como reprogramação celular em um organismo intacto e no contexto de diferentes do desenvolvimento e ambiente condições. Além disso, ele fornece a perspectiva para desafiar as células germinativas expressando excesso diferente destino indutor do TFs para estudar o seu papel na restrição da plasticidade celular9, ou para avaliar o seu potencial para induzir a reprogramação das células germinativas para vivo emos tipos de outras células.
Enquanto culturas de tecidos de mamíferos também permitem estudar os diferentes aspectos da célula destino reprogramação, crescidas em cultura de células têm limitado a capacidade de imitar as condições de via sinalização comparadas a um organismo intacto. Portanto, c. elegans é um modelo versátil para exame dos papéis de vários processos biológicos, tais como o entalhe de sinalização durante a reprogramação na vivo. Além disso, é um poderoso modelo para telas genéticas que é relativamente fácil de manter e modificar geneticamente para baixos custos.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td> para Incubadora <td>de Choque Térmico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>para manutenção de cepas de vermes a 15 °; C ou 25 &graus; C</td></tr><tr><td>Microscópios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>M205 FA</td> Microscópio <td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>(Imagem) + câmera</td><td>Axio Imager 2</td> Microscópio <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>(Imagem) + câmera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lisogênio: lavUV5 promotor -T7 polimerase) (T7 polimerase induzível por IPTG) (RNAse III menos).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Cepa de E. coli auxotrófica de uracila</td></tr><tr><td>Cepas de vermes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>derivada de OH9846 por 4x mais retrocruzamento com</td></tr> <tr><td>clones de N2RNAi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>vetor vazio: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picareta de minhoca&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Feito por você mesmo usando uma pipeta Pasteur e um fio de platina</td></tr></tbody></table>

aplicação de rnai e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Estudar os processos biológicos de célula durante a conversão as identidades dos tipos de célula específica fornece insights importantes sobre mecanismo que mantêm e proteger a identidade celular. A conversão de células germinativas em neurônios específicos no nemátode Caenorhabditis elegans (c. elegans) é uma ferramenta poderosa para executar telas genéticas para dissecar vias regulamentares que salvaguardar as identidades celulares estabelecidas. Reprogramação de células germinativas para um tipo específico de neurônios, denominado ASE requer animais transgénicos que permitem ampla sobre-expressão da transcrição Zn-dedo fator (TF)-1. -1 endógena é expresso exclusivamente em dois neurônios cabeça e é necessária para especificar o destino de neurônios glutamatérgico ASE, que pode ser facilmente visualizado pelo repórter gcy-5prom::gfp . Um gene trans contendo a calor-choque orientada por promotor -1 gene expressão construção permite ampla expressão mis de-1 no animal todo tratamento de choque do calor. A combinação de RNAi contra o fator de cromatina-regulação LIN-53 e sobre-expressão induzida por calor-choque -1 leva a reprogramação das células germinativas, em células neurônio ASE. Descrevemos aqui o procedimento específico de RNAi e condições adequadas para o tratamento de choque do calor de animais transgénicos para induzir com sucesso células germinativas para conversão do neurônio.

Como mostrado na Figura 1, F1 animais que apresentam o fenótipo pvul ilustram a aplicação bem sucedida de lin-53 RNAi. Estes animais são propensos a permitir a conversão de suas células germinativas, em células de neurônio como ASE após a indução de calor-choque de sobre-expressão -1 , conforme ilustrado na Figura 2. Em contraste com os vermes que cresceram no controle vazios vector RNAi lin-53 RNAi tratamento irá produzir animais que exibem GFP-sinais de gravidez ectópica na área de meio do corpo depois de choque do calor e incubação de 25 ° C durante a noite como descrito anteriormente4, 8. exame sob um microscópio de epifluorescência destes vermes revela que as células mostrando sinais GFP também exibem neurônio-como projeções (Figura 2B, setas brancas) que são típicas de células neuronais. Se RNAi contra lin-53 não foi bem sucedida ou calor-choque condições eram inadequadas sinais GFP serão semelhante aos de controle RNAi animais tratados (Figura 2). Importante, evite induzir sobre-expressão do -1 por indução de calor, antes que os animais atinjam meado fase L3. Animais que foram muito jovens no momento da indução de superexpressão de -1 podem exibir expressão ectópica gcy-5prom::gfp em outras regiões do corpo, como a vulva em desenvolvimento, como mostrado na Figura 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figura 1: Pvul fenótipo causado por RNAi contra lin-53. (Topo) Imagens DIC de vermes de progênie L4/jovem adulto fase F1 derivado controle ou lin-53 mães de RNAi Tratado. Escala de barras = 20 µm. (fundo) os animais tratados com lin-53 RNAi exibir o fenótipo saliente da vulva (pvul) (cabeça de seta preta). O fenótipo pvul confirma que a RNAi contra lin-53 foi bem sucedida. Escala de barras = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figura 2: Worms com reprogramadas com sucesso células germinativas em neurônios. (A) animais de estirpe BAT28 crescidos sobre o vetor vazio não mostram sinais GFP no germline após a indução de calor-choque de superexpressão de -1 . Linha branca tracejada descreve worm. Escala de barras = 20 µm. (B) em contraste com os animais de estirpe BAT28 crescidos sobre o controle de vetor vazio RNAi animais cultivados na lin-53 RNAi exibir sinais de gcy-5prom::gfp na área de meio corpo. Fotos da seção de corpo médio, com sinais GFP tiradas na ampliação de X 63 revelaram células GFP-positivo, mostrando as saliências (cabeça de seta branca). Esta característica morfológica indica que as células germinativas passou por conversão em células neurônio ASE. Asteriscos brancos marcam autofluorescência derivado de intestino. Todas as imagens foram adquiridas utilizando um microscópio de epifluorescência com 20 X ampliação e ampliação de X 63. Linha branca tracejada descreve vermes. Escala de barras = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figura 3: Worm de fase precoce com GFP ectópica. Animais de estirpe BAT28 crescidos sobre a bactéria de RNAi vetor vazio que estava calor-choque induzido por -1 superexpressão em estágios larvais iniciais como L2 mostram sinais de boas práticas agrícolas na área de meio corpo (brancos asteriscos). Estes sinais não são devido a reprogramação de células germinativas. Linha branca tracejada descreve worm. Escala de barras = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve como estudar processos celulares durante a conversão de destino célula em Caenorhabditis elegans in vivo. Usar animais transgénicos, permitindo que o calor-choque orientada por promotor superexpressão do factor de transcrição destino indutor de neurônio-1 e mediada por RNAi depleção da cromatina-regulação fator LIN-53 células germinativas para reprogramação do neurônio pode ser observado na vivo.

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir a conversão de células germinativas em neurônios em C. elegans. Este método pode ajudar a investigar a implicação de processos biológicos, como vias de sinalização ou epigenética na regulação da reprogramação do destino celular. A principal vantagem do método descrito neste vídeo é que, em animais vivos, as células germinativas podem ser desafiadas pela superexpressão de um fator de transcrição indutor do destino.Paralelamente, uma triagem genética, como uma triagem de RNAi, pode ser realizada para identificar novos fatores que estão implicados na regulação da reprogramação celular. As implicações dessa técnica se estendem à terapia regenerativa. Porque este método in vivo pode ser usado para estudar a reprogramação celular sob diferentes condições ambientais e de desenvolvimento.A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de reprogramação são difíceis de aprender. Porque o fenótipo de conversão de célula germinativa em neurônio, após a depleção da lin-53, só acontece em condições cuidadosamente controladas. Para as placas de RNAi, carregue as placas de seis centímetros com ágar NGM contendo IPTG e carbenicilina.Deixe secar por 24 a 48 horas em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, transfira-os para quatro graus Celsius por até 14 dias. Em seguida, placas seletivas contendo carbenicilina e tetraciclina com clones de bactérias RNAi com plasmídeo L4440 carregando o gene lin-53.Use um padrão de listras trifásicas e certifique-se de colocar um controle vetorial vazio. Em seguida, aumente as placas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, escolha pelo menos três colônias individuais e inocule cada uma delas em um tubo de cultura separado com dois mililitros de LB, suplementado com carbenicilina, mas não tetraciclina.Planeje ter três culturas saudáveis por condição. Em seguida, cultive as culturas durante a noite a 37 graus Celsius até atingirem uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,6 a 0,8. Em seguida, adicione 500 microlitros de cada cultura bacteriana a uma placa de ágar RNAi NGM de seis centímetros.Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente no escuro. Este protocolo é otimizado para vermes da cepa BAT28 mantidos a 15 graus Celsius, nos quais os transgenes são mais estáveis. Detalhes sobre a genética da cepa são fornecidos no texto.A sincronização de idade dos vermes é crítica. Use a técnica de clareamento. Lave placas de ágar NGM de seis centímetros contendo adultos e ovos usando 800 microlitros de M9. Em seguida, pelete os vermes por centrifugação e remova o sobrenadante.Em seguida, adicione 1/2 a um mililitro de solução clareadora às minhocas. E enquanto observa os vermes sob um estereoscópio, agite o tubo até que os vermes adultos comecem a se abrir e, em seguida, colete os ovos. Agora, separe os resíduos dos ovos.Primeiro centrifugue o tubo e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet de lenços com 800 microlitros de M9 três vezes. Certifique-se de usar centrifugação para acumular os tecidos entre as lavagens.Agora, transfira os ovos limpos para placas NGM frescas semeadas com bactérias OP50. Verifique brevemente o isolamento bem-sucedido dos embriões e sua transferência para as placas NGM. Cresça os animais a 15 graus Celsius.Para alcançar a conversão de células germinativas em neurônios após a depleção de lin-53, a depleção precisa começar na geração parental. Para esgotar o lin-53, sujeite os animais L4 ao RNAi. Transfira manualmente 50 vermes L4 por repetição para uma placa NGM RNAi sem bactérias.Use um fio de platina. Os vermes L4 podem ser reconhecidos por uma mancha branca aproximadamente na metade de seus lados ventrais. Agora, incube os vermes a 15 graus Celsius no escuro por cerca de sete dias.O IPTG é sensível à luz. Quando a progênie F1 atingir os estágios L3 e L4, separe-os dos animais parentais maiores e mais grossos. Neste ponto, rastreie o F1 para o fenótipo da vulva saliente, o que indica que o RNAi contra lin-53 foi bem-sucedido.A atividade do RNAi também pode resultar em letalidade, que aumenta acima de 15 graus Celsius. Para ativar o che-1 e induzir a conversão de célula germinativa em neurônio na progênie F1, choque térmico nos vermes por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Use uma incubadora ventilada, pois permite um choque térmico mais eficiente.Após o choque térmico, incube as placas a 25 graus Celsius durante a noite no escuro. É importante evitar a indução de superexpressão de che-1 por choque térmico antes que os animais atinjam o estágio L3 médio. Isso pode levar à expressão da proteína che-1 em tecidos não direcionados.No dia seguinte, configure uma fonte de luz de fluorescência e um filtro GFP para examinar os animais quanto à fluorescência derivada de transgenes na área do meio do corpo. Para avaliar a penetrância do fenótipo, encontre a proporção de animais que emitem um sinal fluorescente. Normalmente, cerca de 30% mostrará um sinal GFP discreto.Em comparação, em animais portadores do RNAi vetor vazio, mesmo um sinal difuso na linha germinativa não é visto em mais de 5% da população. Animais F1 que exibem o fenótipo vulva saliente ilustram a aplicação bem-sucedida do RNAi lin-53. Nesses animais, a conversão de células germinativas em células semelhantes a neurônios ASE após a indução de choque térmico de che-1 é comum.Um exame mais atento revela projeções semelhantes a neurônios que são típicas de neurônios de células germinativas. Por outro lado, os controles vetoriais vazios mostraram expressão mínima de GFP, que era, no máximo, difusa. As células germinativas nesses animais não tinham características semelhantes a neurônios.Quando os animais eram muito jovens no momento da indução da superexpressão de che-1, eles frequentemente exibiam expressão transgênica ectópica em outras regiões do corpo, como a vulva em desenvolvimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como planejar e realizar cuidadosamente os experimentos usando vermes vivos para reprogramar células germinativas em neurônios. O método descrito aqui neste vídeo permitirá que você investigue agora a implicação de vários fatores diferentes na regulação da reprogramação celular.Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em 10 dias. Ao tentar o experimento, é importante preparar cuidadosamente os animais antes da indução da reprogramação e manter a cepa BAT28 a 15 graus. Seguindo este procedimento, outros métodos como RNAi duplo podem ser realizados para abordar questões adicionais como: Quais são os mecanismos subjacentes que desempenham um papel durante as conversões de destino celular?

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Research

JoVE Journal

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Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

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