Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans
1 de janeiro de 2018
Este protocolo descreve como estudar processos celulares durante a conversão de destino célula em Caenorhabditis elegans in vivo. Usar animais transgénicos, permitindo que o calor-choque orientada por promotor superexpressão do factor de transcrição destino indutor de neurônio-1 e mediada por RNAi depleção da cromatina-regulação fator LIN-53 células germinativas para reprogramação do neurônio pode ser observado na vivo.
O objetivo geral deste procedimento é induzir a conversão de células germinativas em neurônios em C. elegans. Este método pode ajudar a investigar a implicação de processos biológicos, como vias de sinalização ou epigenética na regulação da reprogramação do destino celular. A principal vantagem do método descrito neste vídeo é que, em animais vivos, as células germinativas podem ser desafiadas pela superexpressão de um fator de transcrição indutor do destino.
Paralelamente, uma triagem genética, como uma triagem de RNAi, pode ser realizada para identificar novos fatores que estão implicados na regulação da reprogramação celular. As implicações dessa técnica se estendem à terapia regenerativa. Porque este método in vivo pode ser usado para estudar a reprogramação celular sob diferentes condições ambientais e de desenvolvimento.
A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de reprogramação são difíceis de aprender. Porque o fenótipo de conversão de célula germinativa em neurônio, após a depleção da lin-53, só acontece em condições cuidadosamente controladas. Para as placas de RNAi, carregue as placas de seis centímetros com ágar NGM contendo IPTG e carbenicilina.
Deixe secar por 24 a 48 horas em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, transfira-os para quatro graus Celsius por até 14 dias. Em seguida, placas seletivas contendo carbenicilina e tetraciclina com clones de bactérias RNAi com plasmídeo L4440 carregando o gene lin-53.
Use um padrão de listras trifásicas e certifique-se de colocar um controle vetorial vazio. Em seguida, aumente as placas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, escolha pelo menos três colônias individuais e inocule cada uma delas em um tubo de cultura separado com dois mililitros de LB, suplementado com carbenicilina, mas não tetraciclina.
Planeje ter três culturas saudáveis por condição. Em seguida, cultive as culturas durante a noite a 37 graus Celsius até atingirem uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,6 a 0,8. Em seguida, adicione 500 microlitros de cada cultura bacteriana a uma placa de ágar RNAi NGM de seis centímetros.
Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente no escuro. Este protocolo é otimizado para vermes da cepa BAT28 mantidos a 15 graus Celsius, nos quais os transgenes são mais estáveis. Detalhes sobre a genética da cepa são fornecidos no texto.
A sincronização de idade dos vermes é crítica. Use a técnica de clareamento. Lave placas de ágar NGM de seis centímetros contendo adultos e ovos usando 800 microlitros de M9. Em seguida, pelete os vermes por centrifugação e remova o sobrenadante.
Em seguida, adicione 1/2 a um mililitro de solução clareadora às minhocas. E enquanto observa os vermes sob um estereoscópio, agite o tubo até que os vermes adultos comecem a se abrir e, em seguida, colete os ovos. Agora, separe os resíduos dos ovos.
Primeiro centrifugue o tubo e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet de lenços com 800 microlitros de M9 três vezes. Certifique-se de usar centrifugação para acumular os tecidos entre as lavagens.
Agora, transfira os ovos limpos para placas NGM frescas semeadas com bactérias OP50. Verifique brevemente o isolamento bem-sucedido dos embriões e sua transferência para as placas NGM. Cresça os animais a 15 graus Celsius.
Para alcançar a conversão de células germinativas em neurônios após a depleção de lin-53, a depleção precisa começar na geração parental. Para esgotar o lin-53, sujeite os animais L4 ao RNAi. Transfira manualmente 50 vermes L4 por repetição para uma placa NGM RNAi sem bactérias.
Use um fio de platina. Os vermes L4 podem ser reconhecidos por uma mancha branca aproximadamente na metade de seus lados ventrais. Agora, incube os vermes a 15 graus Celsius no escuro por cerca de sete dias.
O IPTG é sensível à luz. Quando a progênie F1 atingir os estágios L3 e L4, separe-os dos animais parentais maiores e mais grossos. Neste ponto, rastreie o F1 para o fenótipo da vulva saliente, o que indica que o RNAi contra lin-53 foi bem-sucedido.
A atividade do RNAi também pode resultar em letalidade, que aumenta acima de 15 graus Celsius. Para ativar o che-1 e induzir a conversão de célula germinativa em neurônio na progênie F1, choque térmico nos vermes por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Use uma incubadora ventilada, pois permite um choque térmico mais eficiente.
Após o choque térmico, incube as placas a 25 graus Celsius durante a noite no escuro. É importante evitar a indução de superexpressão de che-1 por choque térmico antes que os animais atinjam o estágio L3 médio. Isso pode levar à expressão da proteína che-1 em tecidos não direcionados.
No dia seguinte, configure uma fonte de luz de fluorescência e um filtro GFP para examinar os animais quanto à fluorescência derivada de transgenes na área do meio do corpo. Para avaliar a penetrância do fenótipo, encontre a proporção de animais que emitem um sinal fluorescente. Normalmente, cerca de 30% mostrará um sinal GFP discreto.
Em comparação, em animais portadores do RNAi vetor vazio, mesmo um sinal difuso na linha germinativa não é visto em mais de 5% da população. Animais F1 que exibem o fenótipo vulva saliente ilustram a aplicação bem-sucedida do RNAi lin-53. Nesses animais, a conversão de células germinativas em células semelhantes a neurônios ASE após a indução de choque térmico de che-1 é comum.
Um exame mais atento revela projeções semelhantes a neurônios que são típicas de neurônios de células germinativas. Por outro lado, os controles vetoriais vazios mostraram expressão mínima de GFP, que era, no máximo, difusa. As células germinativas nesses animais não tinham características semelhantes a neurônios.
Quando os animais eram muito jovens no momento da indução da superexpressão de che-1, eles frequentemente exibiam expressão transgênica ectópica em outras regiões do corpo, como a vulva em desenvolvimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como planejar e realizar cuidadosamente os experimentos usando vermes vivos para reprogramar células germinativas em neurônios. O método descrito aqui neste vídeo permitirá que você investigue agora a implicação de vários fatores diferentes na regulação da reprogramação celular.
Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em 10 dias. Ao tentar o experimento, é importante preparar cuidadosamente os animais antes da indução da reprogramação e manter a cepa BAT28 a 15 graus. Seguindo este procedimento, outros métodos como RNAi duplo podem ser realizados para abordar questões adicionais como: Quais são os mecanismos subjacentes que desempenham um papel durante as conversões de destino celular?
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para estudar processos celulares durante a conversão de células germinativas em neurônios em Caenorhabditis elegans in vivo. Ao utilizar animais transgênicos, os pesquisadores podem observar os efeitos da superexpressão do fator de transcrição CHE-1, indutor do destino neuronal, e do esgotamento do fator regulador da cromatina LIN-53 por meio de interferência de RNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- Compreender a reprogramação do destino celular é essencial para obter insights sobre a biologia do desenvolvimento.
- Modelos transgênicos permitem a observação em tempo real de processos celulares.
- Sabe-se que LIN-53 desempenha um papel na regulação da cromatina e na identidade celular.
- CHE-1 é um fator de transcrição que pode induzir o destino neuronal.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos subjacentes à conversão de células germinativas em neurônios.
- Explorar o papel das vias de sinalização e dos fatores epigenéticos na reprogramação celular.
- Desenvolver um método que possa ser aplicado à pesquisa em terapia regenerativa.
Métodos Utilizados
- C. elegans transgênicos expressando CHE-1 sob um promotor de choque térmico.
- Interferência de RNA para esgotar LIN-53 em células germinativas.
- Sincronização etária de vermes utilizando uma técnica de branqueamento.
- Tratamento com choque térmico para induzir a expressão de CHE-1 em estágios de desenvolvimento específicos.
Resultados Principais
- A conversão bem-sucedida de células germinativas em células semelhantes a neurônios foi observada após o esgotamento de LIN-53.
- Aproximadamente 30% da prole F1 exibiu sinal fluorescente, indicando expressão bem-sucedida do transgene.
- Os grupos-controle com RNAi do vetor vazio mostraram fluorescência mínima, confirmando a especificidade do método.
- A análise fenotípica revelou projeções semelhantes a neurônios nas células convertidas.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para estudar o reprogramamento celular in vivo.
- Os achados contribuem para a compreensão da regulação da identidade celular e de aplicações terapêuticas potenciais.
- O domínio desta técnica pode facilitar pesquisas adicionais sobre fatores de reprogramamento celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A reprogramação de células germinativas em neurônios em C. elegans permite a investigação direta dos mecanismos de identidade celular e da regulação epigenética em um sistema vivo. Essa abordagem favorece a validação confiável de alvos e a redução de riscos mecanicistas em vias envolvidas nas decisões de destino celular. O método está estrategicamente posicionado para equipes de descoberta precoce que buscam desvendar redes regulatórias que protegem a identidade celular e orientam estratégias regenerativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a validação funcional de reguladores da cromatina e fatores de transcrição na reprogramação do destino celular.
- Apoia a triagem genética para identificar novos moduladores da manutenção da identidade celular.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao isolar o impacto de perturbações gênicas específicas nos resultados da reprogramação.
- Oferece um contexto em animal vivo para esclarecimento de vias e teste de hipóteses.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um sistema robusto in vivo para telas genéticas baseadas em RNAi direcionadas a fatores de reprogramação.
- Fornece leituras quantitativas baseadas em fluorescência para padronização e reprodutibilidade do ensaio.
- Permite avaliação escalonável da função gênica em múltiplas condições e estágios de desenvolvimento.
- Prepara sistemas biológicos validados para telas downstream de compostos ou modificadores genéticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a questões relevantes para doenças relacionadas à plasticidade celular e potencial regenerativo.
- Proporciona continuidade do estágio de descoberta de achados genéticos ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de alvos implicados na regulação do destino celular.
- Oferece insights preditivos sobre a viabilidade de estratégias terapêuticas baseadas em reprogramação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, permitindo telas genéticas orientadas por hipóteses e a validação funcional de fatores de reprogramação.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipótese nula para função gênica na conversão de destino celular.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas reprodutíveis de fluorescência para comparação entre condições.
- Análises: Fornece dados estatísticos de penetrância para orientar decisões de avançar ou não avançar.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos quando alinhadas a vias relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para interrogatórios genéticos e epigenéticos iterativos em diversos alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de destino celular.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de reprogramação in vivo para reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões precoces de avançar/não avançar e melhora a eficiência do capital ao reduzir riscos em hipóteses biológicas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e vias para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genética de C. elegans, RNAi e manipulação de linhagens transgênicas.
- Requer acesso a microscopia de fluorescência e equipamentos para choque térmico controlado.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de estadiamento dos animais e de indução.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização e validação do protocolo.
- A penetrância e especificidade do fenótipo são sensíveis ao tempo de desenvolvimento e às condições ambientais.
