Deteção Molecular no local de Phytopathogens solo-carregadas usando um sistema portátil de PCR em tempo real
23 de fevereiro de 2018
Detecção rápida e exata de patógenos no local, especialmente de solo-carregadas patógenos vegetais, é crucial para prevenir mais produção de inóculo e proliferação de doenças de plantas no campo. O método desenvolvido aqui, usando um sistema de detecção de PCR em tempo real portátil permite o diagnóstico no local em condições de campo.
Olá, meu nome é Joseph DeShields, estou no Departamento de Patologia Vegetal da Washington State University e hoje mostrarei um protocolo de detecção no local para detectar doenças transmitidas pelo solo no solo. O diagnóstico no local de doenças de plantas no campo é fundamental para o gerenciamento eficaz de doenças e pode, em última análise, reduzir a disseminação secundária de patógenos no campo. Os patógenos transmitidos pelo solo são particularmente difíceis de diagnosticar devido aos ambientes grandes e complexos do solo e isso pode dificultar a compreensão das doenças transmitidas pelo solo. A reação em cadeia da polimerase, também conhecida como PCR, é atualmente a abordagem sensível e precisa mais amplamente aceita para detectar patógenos de plantas no campo. O protocolo a seguir demonstra um método sensível e no local para detectar patógenos transmitidos pelo solo composto por uma extração de DNA baseada em esferas magnéticas, PCR, que pode ser feita usando um instrumento de PCR portátil, e análise de dados, que pode ser feita remotamente, usando um laptop. Extração de DNA baseada em esferas magnéticas. O kit de extração de DNA e RNA foi preparado e usado de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações. Todos os reagentes foram armazenados em temperatura ambiente e a Proteinase K preparada foi armazenada a 20
Visão Geral
Este artigo apresenta um sistema portátil de detecção de PCR em tempo real para o diagnóstico in loco de patógenos vegetais transmitidos pelo solo. A detecção rápida é essencial para o manejo eficaz de doenças e para a prevenção da disseminação de doenças em plantas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fitopatologia
- Microbiologia do Solo
- Diagnóstico de Campo
Contexto
- Patógenos do solo são difíceis de diagnosticar devido aos ambientes edáficos complexos.
- O diagnóstico in loco é essencial para o manejo eficaz de doenças de plantas.
- A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método amplamente aceito para detecção de patógenos.
- Sistemas portáteis de PCR permitem diagnósticos baseados em campo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método sensível e preciso para detectar patógenos do solo.
- Demonstrar o uso de um sistema portátil de PCR para diagnóstico in loco.
- Reduzir a disseminação secundária de patógenos em ambientes agrícolas.
Métodos Utilizados
- Extração de DNA baseada em microesferas magnéticas.
- PCR em tempo real para detecção de patógenos.
- Uso de um instrumento portátil de PCR para análise de campo.
- Análise remota de dados utilizando um computador portátil.
Resultados Principais
- O método desenvolvido permite a detecção rápida de patógenos do solo.
- As condições de campo podem ser eficazmente gerenciadas usando este sistema portátil.
- O diagnóstico no local pode prevenir a produção adicional de inóculo.
- O protocolo é adaptável a diversos ambientes do solo.
Conclusões
- O sistema PCR portátil melhora a capacidade de diagnosticar patógenos do solo no campo.
- A detecção rápida e precisa é essencial para um manejo eficaz de doenças.
- Este método pode contribuir significativamente para reduzir a disseminação de doenças em plantas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção rápida in loco de patógenos do solo permite intervenção oportuna em processos de biotecnologia agrícola, reduzindo perdas de culturas e apoiando estratégias preditivas de manejo de doenças. Diagnósticos moleculares portáteis conectam a coleta de amostras de campo à validação laboratorial, acelerando a tomada de decisões no desenvolvimento inicial de agroquímicos e biopesticidas. Essa abordagem melhora a validação de alvos em estudos de interação planta-patógeno ao fornecer dados quantificáveis e reprodutíveis sobre a carga de patógenos diretamente de matrizes ambientais complexas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a validação funcional de fatores de virulência de patógenos por meio da detecção quantitativa de cópias de DNA no solo.
- Valor Operacional: Apoia a verificação de hipóteses em fluxos de trabalho de validação de alvos ao fornecer quantificação reprodutível de patógenos a partir de amostras coletadas em campo.
- Valor Preditivo: Gera dados de dose-resposta para triagem de compostos antimicrobianos ou que superam resistência, em condições ambientais realistas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: A extração de ácidos nucleicos baseada em microesferas magnéticas fornece um preparo padronizado de amostras resistente a inibidores para detecção em alto rendimento de patógenos.
- Saída Quantitativa: A PCR em tempo real baseada em sondas fluorogênicas fornece valores de Ct que permitem a determinação do limite de detecção (tão baixo quanto 100 cópias) para otimização do ensaio.
- Transferibilidade da Plataforma: A compatibilidade do protocolo com instrumentos portáteis apoia fluxos de triagem descentralizados em locais de estudo geograficamente diversos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para Doenças: Utiliza Spongospora subterranea em matrizes de solo para modelar desafios reais de detecção de patógenos em culturas de tubérculos.
- Continuidade Translacional: Conecta o desenvolvimento de ensaios laboratoriais com diagnósticos aplicáveis em campo, reduzindo o risco de translação na biotecnologia agrícola.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite o monitoramento da dinâmica da carga patogênica para avaliar o mecanismo de ação de biológicos ou protetores químicos aplicados ao solo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere na continuidade entre descoberta e aplicação translacional ao permitir a quantificação precoce de patógenos na validação de alvos, apoiar a padronização de ensaios na triagem e orientar decisões de avançar/não avançar no desenvolvimento pré-clínico de agentes de proteção de cultivos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a investigação orientada por hipóteses das interações patógeno-hospedeiro por meio da quantificação precisa de DNA alvo em ambientes naturais de solo.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de detecção de patógenos adequadas para avaliação de bibliotecas de compostos em formatos de ensaio baseados em solo.
- Análises: Gera valores de Ct reprodutíveis e curvas de amplificação que permitem comparação estatística dos efeitos de tratamentos entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade desde ensaios laboratoriais controlados até estudos de validação em campo, mantendo o desempenho do ensaio em diferentes tipos de amostras.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma portátil e reprodutível de detecção de patógenos aplicável a múltiplos sistemas de fitopatógenos em redes globais de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de planta-patógeno ao fornecer medidas precisas e validadas em campo da carga de patógenos.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade e escalabilidade da detecção de patógenos em diversos locais de campo por meio de protocolos padronizados de extração e amplificação.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões de avançar ou interromper programas de proteção de cultivos em estágios iniciais, reduzindo as taxas de falsos negativos na detecção de patógenos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos líderes com base na eficácia demonstrada sob condições realistas de pressão de patógenos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em diagnóstico molecular e patologia vegetal para o planejamento e interpretação do ensaio.
- Depende do acesso a instrumentos portáteis de PCR em tempo real e conjuntos compatíveis de sondas fluorogênicas.
- Necessita padronização dos protocolos de coleta e processamento de amostras entre os locais de campo para garantir a comparabilidade dos dados.
- Deve levar em conta inibidores da PCR derivados do solo mediante a validação da eficiência da extração baseada em microesferas magnéticas em matrizes-alvo.
- Limita-se à detecção baseada em ácidos nucleicos; não avalia a viabilidade ou infectividade do patógeno sem ensaios complementares.
