Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

O objetivo geral desta técnica é testar os efeitos de diferentes compostos nos organismos modelo C.elegans em um ensaio de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo químico, biológico e de envelhecimento, como estruturas químicas específicas prolongam a vida útil de C.elegans? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a triagem de vários compostos de maneira rápida e eficiente em termos de tempo.

Para preparar placas de cultura em massa para a produção de um grande número de vermes, em um gabinete de fluxo laminar, primeiro dispense 30 mililitros de ágar de meio de crescimento de nematóide a 60 graus Celsius em placas de cultura de 10 centímetros para solidificação durante a noite. Na manhã seguinte, adicione dois mililitros de E.coli concentrada em cada placa, inclinando e girando a placa para espalhar a bactéria completamente pela superfície da placa. Quando as placas de cultura em massa estiverem secas, armazene-as a quatro graus Celsius por até duas semanas.

Para preparar placas de cultura de ensaio de alto rendimento para triagem, use um dispensador automatizado de oito canais para adicionar 0,15 mililitros de ágar de meio de crescimento de nematóide fundido em cada poço de uma placa de 96 poços. Deixe o ágar-ágar solidificar durante a noite. Em seguida, armazene as placas de ensaio de alto rendimento a quatro graus Celsius por até duas semanas.

Para configurar as culturas de C. elegans, use um pincel de minhoca e um microscópio de dissecação para transferir 20 ovos para cada placa de cultura em massa e incubar as placas a 20 graus Celsius por seis dias. No sétimo dia, use um microscópio de dissecação para confirmar visualmente a presença de óvulos no útero. Para coletar os adultos grávidas, use uma pipeta de vidro para adicionar dois a três mililitros de solução S Basal por placa e agite as soluções ao redor de cada placa manualmente.

Use a pipeta de vidro para transferir os vermes para um tubo de 15 mililitros e peletizar os vermes por centrifugação. Ressuspenda os vermes em 10 mililitros de solução de hipoclorito e agite rapidamente os tubos para cima e para baixo por cinco segundos. Em seguida, incube os vermes por cinco minutos em temperatura ambiente, agitando a cada 2,5 minutos.

No final da incubação, centrifugue novamente os vermes. Os pellets devem ser marrom-amarelados. Substitua os sobrenadantes por 10 mililitros de solução fresca de hipoclorito e agite vigorosamente o tubo novamente.

Incube os vermes por mais um a três minutos com agitação ocasional. Quando restarem apenas ovos, centrifugue os tubos e aspire os sobrenadantes. Os pellets devem ser brancos, sem coloração marrom.

Usando a técnica estéril, abra os tubos em um gabinete de fluxo laminar estéril e adicione 14 mililitros de solução S Basal a cada pellet. Lave o pellet três vezes com 14 mililitros de S Basal. Após três lavagens por centrifugação, ressuspender os ovos em dois a três mililitros de solução fresca de S basal.

Para preparar a larva de estágio L1 C.elegans, transfira os sobrenadantes para uma placa de Petri de vidro estéril por tubo e use dois a três mililitros de solução S Basal para enxaguar os ovos restantes dos tubos em cada placa. Adicione cinco mililitros de solução S Basal a cada prato para aliviar a aglomeração e coloque o prato em um agitador orbital a 20 graus Celsius e 20 rpm por 16 a 24 horas para estimular a eclosão. Todos os filhotes vão parar no primeiro estágio larval devido à falta de comida.

Usando uma pipeta sorológica, transfira as larvas L1 para um tubo de 15 mililitros para sua centrifugação. Depois que todos os L1 eclodidos tiverem sido consolidados por centrifugação e aspiração repetidas, ressuspenda o pellet de larva com 10 mililitros de solução S Basal estéril. Em seguida, transfira 10 microlitros para uma placa sem sementes e conte o número de larvas presentes na placa.

Repita isso 10 vezes para obter a densidade média de L1s em sua solução. Com uma pipeta serológica estéril, determinar o volume total da solução que contém as L1s. Em seguida, use o volume da solução L1 e a densidade de L1s na solução para calcular o número total de L1s presentes em sua solução.

Para colocar os vermes em uma placa de ensaio de alto rendimento de 96 poços, dilua a suspensão L1 para uma larva L1 por microlitro em um frasco de mídia redondo estéril, equipado com uma barra de agitação de giro moderadamente lento e deixe as placas de ensaio aquecerem à temperatura ambiente. Em seguida, em um gabinete de fluxo laminar, adicione cinco microlitros de E.coli concentrada a cada poço, seguidos por 10 microlitros de suspensão L1 por poço para produzir uma média de 10 vermes por poço. Quando todos os vermes tiverem sido plaqueados, cubra as placas e incube os vermes por dois dias a 25 graus Celsius, para permitir que as larvas se desenvolvam em adultos.

No final da incubação, leve as placas da biblioteca química até a temperatura ambiente do congelamento. Agite suavemente as placas descongeladas a 60 rpm em um agitador de microplacas por um minuto imediatamente antes do uso. Usando um manipulador de líquido automatizado de 96 poços, transfira 0,75 microlitros de composto da placa biblioteca para a placa de ensaio.

Quando todos os poços tiverem sido tratados, seque ao ar o composto da superfície das placas em um gabinete de fluxo laminar por quatro a oito horas, removendo as placas individuais assim que estiverem secas. Sele as placas secas com filme transparente e tampe-as. Em seguida, gire as placas por 45 segundos a 1000 G e guarde-as na posição invertida a 25 graus Celsius.

Para testar as respostas de C. elegans aos compostos de interesse, uma placa de controle negativa pode ser usada para pontuar a sobrevivência total até que 95% dos animais de controle estejam mortos, momento em que todas as placas de teste podem ser pontuadas. Por exemplo, neste estudo, 57 acertos foram observados na biblioteca de reteste de 179 compostos, demonstrando que 32% dos produtos químicos de reteste testaram positivo no total. O agrupamento das pontuações médias de porcentagem de vivos para os poços de controle e teste negativos indicou que os poços de teste superaram os poços de controle.

Telas em pequena escala também podem ser realizadas, conforme demonstrado neste ensaio representativo no qual foram utilizadas concentrações de 50 micromolares e 100 micromolares do composto de teste. A repontuação dessas placas de teste de ensaio de tela pequena quando mais de 99% dos animais tratados com controle negativo estavam mortos, indicou que os poços de controle positivo superaram em muito os poços de controle negativo e teste, pois os poços de teste tiveram um desempenho ligeiramente melhor do que os controles negativos. Neste experimento, o último resultado foi tendencioso pela indicação de que muitos dos poços de teste pareciam exibir toxicidade em relação ao tratamento de controle, confundindo assim essa interpretação simples.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas a quatro semanas, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante manter a integridade das placas de ensaio, certificando-se de que estejam imaculadas antes de serem usadas. Seguindo essa técnica, perguntas adicionais podem ser respondidas, como: qual desses compostos induz a mitofagia?

Para um ensaio de mitofagia, uma fita repórter de mitofagia seria usada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como realizar uma triagem química de alto rendimento usando C.elegans como organismo modelo.