Name: Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a quantificar níveis de tRNA em organismos de laboratório usando marcação metabólica in vivo e macroarrays. Este método rápido e reprodutível permite medir simultaneamente todos os RNAs de transferência em menos de 24 horas.

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Este trabalho foi financiado por um subsídio de SC INBRE do Instituto Nacional de General Medical ciência - NIH (P20GM103499 de R.G.) e concede a CA555536 & CA154664, do Instituto Nacional do câncer para P.H.H. Este programa foi apoiado em parte por uma concessão à Universidade de Charleston do Howard Hughes Medical Institute, através da pre-faculdade & graduação programa de educação científica e por concessões do centro nacional para recursos de pesquisa (5 P20 RR016461) e o Instituto Nacional de General Medical Ciências (P20 8 GM103499) dos institutos nacionais de saúde.

1. cultura e rotulagem metabólica
<ol><li>Picar uma vez o centro da tampa de um tubos de microcentrífuga estéril 1,5 mL com uma agulha de calibre 18, para permitir a aeração adequada. Inocular a 500 µ l de completados estéril 7h 9 caldo com 5 µ l de M. smegmatis de um starter cultura adulta durante a noite12. Nota: A receita para um litro de 7h 9 caldo é: 4,7 g comercial 7h 9 em pó, 2 mL de glicerol, 1 mL de Tween 80, 0,85 g de NaCl, 5 g de albumina, 2 g de Dextrose, H2O (para trazer o volume total de 1 L).<ol>
<li>
(Cuidado) Seguindo as práticas padrão de protecção contra as radiações, spike o meio de cultura com 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Cresce bactérias a 37 ° C e 1.200 rpm agitação, numa incubadora shaker colocado atrás de um escudo acrílico grosso de 9mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na fase midlog (O.D.600 nm ~ 0.5), transferir toda a cultura para um tubo de 2 mL tampa de rosca e bactérias radioativas à temperatura de pelotas por centrifugação para 2 min a 10.000 g. x coletar ortofosfato radioactivo não incorporado contendo sobrenadante em recipiente de resíduos adequado.</li>
</ol>2. preparação do RNA total
Nota: Total RNAs são extraídos de pelotas bacterianas usando um reagente de extração de RNA comercial (contendo guanidínio tiocianato, fenol e clorofórmio) seguindo o protocolo do fabricante.
<ol><li>Adicione 1 mL do reagente de extração de RNA comercial e aproximadamente 200 µ l de esferas de vidro para a pelota. Tampar o tubo firmemente e perturbar a bacteriana em um homogeneizador por 2 min sob agitação máxima, (definindo o número cinco no instrumento escolhido (consulte a Tabela de materiais)).</li>
	<li>Amostra de centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL e descartar os grânulos apropriadamente. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente o tubo à mão por 15 s. centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Recolha a fase aquosa da amostra para um tubo novo por pesca o tubo a 45°. Evite qualquer interfase ou camada orgânica de desenho. Adicione 2 µ l de dessensibilizador colorida e 0,5 mL de isopropanol 100%. Agite o tubo vigorosamente à mão para 5 s. centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante do tubo e descartar adequadamente como a fracção líquida pode conter vestígios de radioactividade. Ar seco da pelota por 5 min e Resuspenda em 200 µ l de solução salina-citrato de sódio (SSC), 0,1% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS) final de 2x. Nota: A composição de estoque 20 X SSC é 3,0 M NaCl, citrato de sódio 0,3 M, pH 7,0.</li>
</ol>3. preparação de 96 placas de impressora bem
Nota: tRNA microarrays manualmente são impressos com quarenta e dois 70-mer oligonucleotídeos de DNA complementares à extremidade 3' de cada tRNA M. smegmatis (terminal CCA excluído) usando um arrayer de oito pinos. As sequências de DNA do oligonucleotide sondas, bem como o layout de sonda na placa de bem e a matriz são fornecidas (arquivo complementar 1 - folha 1 a 3 respectivamente).
<ol><li>Projeto DNA sondas por primeiro recuperando sequências de tRNA ou tRNA codificação genes de tRNA bancos de dados como o tRNA Genomic Database13. Guarnição conservada 3' extremidade CCA se codificado. Complemento de inverter a sequência resultante. Sonda de ordem com base nos primeiros 70 nucleotídeos.</li>
	<li>Resuspenda sondas de DNA secas na água. Ajuste a concentração de sondas de 100 µM. Em uma placa-96, preparar 120 µ l de 50 µM oligos em 3 X SSC, 0,01% (p/v) SDS final (diluir 60 µ l de estoque sondas poço individuais com 60 µ l de 6 X SSC, 0,01% (p/v) SDS.</li>
	<li>Cubra o prato com papel alumínio para evitar evaporação ou contaminação, congelar imediatamente e manter a-20 ° C até ser necessário.</li>
</ol>4. impressão matriz
<ol><li>Descongele a placa de 96 poços à temperatura ambiente (leva cerca de 20 min).</li>
	<li>Lâminas de vidro de rótulo amina-revestido com uma caneta de diamante. Coloque slides em unidade de indexação. Siga as colocações de grade e proceda como a seguir.<ol>
<li>Mergulhe cuidadosamente os pinos replicator em poços.</li>
		<li>Delicadamente, imprima a matriz nas corrediças de vidro, usando a pressão mínima (você vai sentir uma pequena resistência). Continuar a impressão sem limpeza a arrayer até terminar com o bloco A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando estiver pronto para avançar para o próximo bloco, siga o procedimento de lavagem descrito abaixo.<ol>
<li>Mergulhe o replicador em lixívia a 5% e agite suavemente.</li>
		<li>Replicador de imprensa em papel absorvente.</li>
		<li>Mergulhe replicator na água destilada, agitar suavemente e pressione no papel. Repita este passo uma vez.</li>
		<li>Mergulhe o replicador em isopropanol, agite e pressione o papel.</li>
		<li>Secar o replicador no ventilador por cerca de 20 s antes de passar para o próximo bloco da placa de 96 poços. Continue para o número desejado de cópias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permitir que os slides secar em seguida crosslink o oligos para o slide usando um agente reticulante UV de 254 nm.<ol>
<li>Defina o nível de energia a 999.990 µ j/cm2.</li>
		<li>Colocar o rosto de slides sobre uma superfície limpa no crosslinker. Pressione "start".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloquear as matrizes durante a noite em 450 mL de solução em um agitador magnético, à temperatura ambiente e sob agitação lenta de bloqueio. Recolher e reutilizar a solução bloqueio até quatro vezes. Nota: A receita para a solução de bloqueio é: 125 mM de tampão de fosfato (NaH2PO4/num2HPO4-) pH 7,2, SDS de 2,25% (p/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, BSA 1% (p/v).</li>
	<li>Lave as lâminas 2 vezes durante 5 min à temperatura ambiente em 500 mL de água destilada. Secar as lâminas por centrifugação para 10 s à temperatura ambiente em uma centrífuga de microarray. Matrizes de loja em um lugar seco e escuro por até 6 meses.</li>
</ol>5. hibridização de matriz
<ol><li>Antes da hibridização enxague slides em água fervente e seque por centrifugação (como em 4.6).</li>
	<li>Matriz de lugar dentro de uma gaveta de hibridização e carga radiolabeled amostra de RNA.</li>
	<li>Execute estação de hibridação-lavagem automatizada para máxima reprodutibilidade.<ol>
<li>Como seguindo as etapas do programa. Gaxetas de condição por 2 min a 75 ° C. Introduzir a sonda a 60 ° C. Desnaturar sondas e amostras de 5 min a 90 ° C. Cruzar as amostras por 3 h a 60 ° C.<ol>
<li>Lave os slides a 50 ° C, duas vezes com 2 X SSC, 0,1% (p/v) SDS, fluxo 10 s e mantenha 20 s. lavagem slides a 42 ° C, duas vezes com 0.1 X SSC, 0,1% SDS, fluxo 10 s e segurar 20 slides de lavagem s. a 42 ° C, duas vezes com 0,1 X SSC , fluxo 10 s e espera 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slides secas por centrifugação (como em 4.6).</li>
</ol>6. quantificação de matriz
<ol><li>Enrole os slides usando uma fina película de plástico. Verifique slides para sinal radioativo, usando um contador Geiger na sua configuração mais sensível. Expor slides em uma tela de fósforo de armazenamento em uma gaveta de exposição à temperatura de 10 a 90 h dependendo da intensidade do sinal. Nota: Como a sensibilidade dos contadores Geiger variam de um instrumento para outro, tempos de exposição devem ser otimizados empiricamente.</li>
	<li>Digitalize slides em 50 µm resolução usando um phosphorimager. Quantificar e fundo-subtrair intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda usando o software Image J livre atualizado com um gerador de perfil de microarray.</li>
	<li>Organizar e processar os dados utilizando uma planilha eletrônica. Gere mapas de calor usando a ferramenta de formatação condicional. Representa por exemplo cada sinal da sonda como uma fração (expressada em ‰) do sinal de sonda total.</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221(2006).</li>
<li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li>
<li>Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+transfer+RNAs%3A+similarity+and+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
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<li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%2C+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-%CE%B2-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li>
<li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li>
<li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GtRNAdb%3A+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li>
<li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li>
</ol>

Não há conflito de interesse declarado.

Emissões de partículas beta são conhecidas agentes bactericidas e bacteriostáticas,14, no entanto, radiações na faixa testada não tem nenhum impacto significativo na aptidão de célula. Contagem de cintilação mostrou que a radioatividade é incorporada por 25% do total-célula extratos e, posteriormente, 1% do RNA total purificada.
Das sondas tamanhos idênticos, temperatura de fusão comparável e conteúdo GC, juntamente com um protocolo uniforme para macroarranjo manchando, hibridização e quantificação permite imparcial medição dos níveis de tRNA diretamente de sinais local.
SPOt é reprodutível e específicos. Seu grande alcance dinâmico e facilmente ajustável limiar permite a criação de perfil baixos espécies abundantes, tais como os tRNAs associados polissomos, simplesmente prolongando matriz exposição vezes9. Após o investimento inicial para o equipamento necessário, a execução, custo por amostra, incluindo consumíveis, média de US $15 por amostras.
SPOt é aplicável a qualquer organismo cujo genoma está disponível para o projeto da sonda. Organismos-modelo que são cultivados em vitro são candidatos ideais para a rotulagem metabólicos. Como genomas de mamíferos codificam frequentemente muitos isodecoders (os tRNAs que compartilham anticódons idênticos mas exibir pequenas diferenças em suas sequências de corpo) sondas precisam ser parcialmente degenerado para preservar homogênea hibridação de espécies perto do tRNA. Finalmente, células de mamíferos aderentes rendem normalmente menor quantidade de RNA total, em comparação com os organismos cultivados em suspensão tais como M. smegmatis, então culturas precisam ser substancialmente ampliados.

Níveis de tRNA celular variam de acordo com condições tais como o tipo de célula, ambiente e stress1,2,3. SPOt, plataforma simplificada para observar o tRNA, é uma original, confiável e uma técnica simples que permite a rápida e precisa de quantificação dos níveis de RNA de transferência em organismos laboratório-crescido.
os tRNAs têm estruturas secundárias e terciárias notavelmente estável4. Eles também exibem numerosas modificações pós-transcricional5. Esses recursos representam significativa estrutural e bloqueios de estradas sequência de polarização ou às vezes impedindo direta e reprodutíveis tRNA perfis usando de técnicas de quantificação de RNA de referência padrão6. Grupos de pesquisa ao redor do mundo foram obrigados a desenvolver técnicas criativas, mas muitas vezes complicadas para avaliar níveis de tRNA celular. Alguns desses métodos incluem: (1) separação eletroforética bidimensional de tRNAs metabolicamente rotulado combinado com atribuição local metódica pelo Borrão do Norte1; (2) individual quantificação por Northern blot usando cuidadosamente padronizado radioativo DNA sondas7; (3) pós-extração de rotulagem com fluorochromes cianina seguido de análise de microarray3e (4) em vitro descascamento de modificações de tRNA usando enzimas recombinantes demodification combinadas com a transcrição reversa e subsequentes arranjar em sequência do elevado-throughput,8.
SPOt é uma combinação simples e original de duas abordagens de padrão e simples: corpo de RNA (1) rotulagem, que consiste na síntese, no cultivo de organismos, de RNAs totais radioactivos e (2) tRNA macroarrays, uma ferramenta genômica sistemática e miniaturizada otimizado para segregação de tRNA.
As amostras são simplificadas de organismos vivos para a plataforma de quantificação. Eles são analisados diretamente após a extração e não processados mais longe que limita significativamente a preconceitos em relação às técnicas que requerem amplificação pós-extração ou tratamentos enzimáticos. SPOt é versátil e pode ser facilmente combinado para fracionamento de polysome a identificação e quantificação de subpopulações de tRNA fisicamente associados traduzir ribossomas.
O protocolo aqui apresentado é otimizado para Mycobacterium smegmatis, e foi usado também com sucesso para os tRNAs perfil em9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, rato e culturas de células humanas11 .

<table><tbody><tr><td>Sistema de indexação de lâminas de vidro</td><td>V& P Científico, Inc.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>Replicador de matriz de lâminas de vidro</td><td>V & P Científico, Inc.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de indexação de microplacas de 96 poços</td><td>V & P Científico, Inc.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>Estação de lavagem e borrão</td><td>V& P Científico, Inc.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>Secador de pinos replicador</td><td>V& P Científico, Inc.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com amina</td><td>Molecular Devices</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>Hybridizer / Hibridização automatizada e estação de lavagem</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca Tubos de 2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr> <tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>Tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>contas de vidro de 0,5 mm</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>Mini moinho de esferas</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>Tela de fósforo de armazenamento</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>Fósforo</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotídeos</td><td>IDT</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador UV</td><td>Spectroline</td><td>Select série 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Microarray</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas descartáveis</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>Precipitante (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 caldo</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>de hibridização</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr>Produtos <td>Químicos do Espectro</td> de<td>Albumina</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ácido Etilenodiaminotetracético)</td><td>Fisher Biorreagentes</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Tampão fosfato pH 7,2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetando metabólica e caracterização das rnas de transferência usando macroarrays

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

RNAs de transferência (tRNA) são curtos não-codificantes do RNA espécies abundantes que são tipicamente de 76 a 90 nucleotídeos de comprimento. os tRNAs são diretamente responsáveis pela síntese de proteínas, traduzindo códons de RNAm em sequências de aminoácidos. os tRNAs tempo foram considerados como moléculas de domésticas que faltava funções reguladoras. No entanto, um conjunto crescente de evidências indica que os níveis de tRNA celular flutuarem em correspondência com condições variáveis tais como o tipo de célula, ambiente e stress. A flutuação da expressão de tRNA influencia directamente a tradução do gene, favorecendo ou reprimindo a expressão de proteínas específicas. Em última análise, compreender a dinâmica da síntese de proteínas requer o desenvolvimento de métodos capazes de fornecer perfis de tRNA de alta qualidade. O método que apresentamos aqui é chamado SPOt, sigla para plataforma simplificada para Observing tRNA. Ponto consiste de três etapas, começando com rotulagem metabólico de culturas de células com ortofosfato radioactivo, seguido pela extração de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio de RNAs totais radioactivos e finalmente hibridação na in-house impressos macroarrays. níveis de tRNA são estimados por quantificar as intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda. No protocolo apresentado aqui nós perfil tRNAs em Mycobacterium smegmatis mc2155, uma bactéria não-patogênicas frequentemente usada como um organismo modelo para estudar a tuberculose.

Três biológica independente Replica mostram que, sob as condições de crescimento testadas, todos os tRNAs M. smegmatis exprimem-se acima do nível do plano de fundo (Figura 1). Nesta experiência particular, o desvio padrão observado para cada sonda está compreendido entre 2% (Arg (TCT)) e 22% (Cys (GCA)), com uma mediana de 5% (Figura 1). Falsas mudanças entre repetições são significativamente influenciadas por fatores como preparação da matriz e hibridação. Alta reprodutibilidade é conseguida com impressão de matriz de cuidadoso e consistente, bem como automatizado da hibridação de amostra. Há uma 5-fold diferença entre tRNA Ile (GAT) e tRNA (Val (TAC), a mais alta e mais baixa abundante espécie respectivamente. Ponto mostra que a expressão do tRNA isoacceptors não é uniforme. Isoacceptors são espécies que mantenha o mesmo aminoácido mas exibir sequências anticodão diferentes e, portanto, decodificar diferentes códons sobre mRNAs. Por exemplo, todos os isoacceptors de alanina são expressos em níveis semelhantes, Considerando que a arginina maior e menor, aceitando os tRNAs diferem por 3 vezes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> Figura 1: resultados de tRNA representativo macroarranjo. (A) digitalizados bacteriano, mouse e macroarrays humano. Matrizes de M. smegmatis usam apenas 43 sondas em vez de 48 para rato e humanos. Como consequência, a matriz bacteriana exibe 40 pontos vazios (sondas são replicadas oito vezes em cada matriz) que se misturam com o fundo. A maioria deles é agrupada no canto superior esquerdo. (B) histograma e heatmap representações de perfis de tRNA em M. smegmatis sob condições de crescimento ideal. Sinais de sonda são a média de três experimentos independentes (incluindo o crescimento bacteriano, rotulagem metabólicos, hibridação de extração e matriz) e são expressos como por mil valores de tRNAs total. Desvios-padrão para as três repetições são indicados como barras de erro e tons de laranja no histograma e heatmap, respectivamente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Nós descrevemos uma plataforma de análise de RNA de transferência original chamada SPOt (plataforma simplificada para observar o tRNA). Local simultaneamente mede níveis celulares de todos os tRNAs em amostras biológicas, em apenas três passos e em menos de 24 horas.

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

O objetivo geral deste procedimento é medir simultaneamente os níveis celulares de todos os RNAs de transferência em amostras biológicas, combinando a marcação metabólica in vivo com a análise de macroarray. Os RNAs de transferência foram por muito tempo considerados moléculas de manutenção que careciam de funções regulatórias. No entanto, um crescente corpo de evidências indica que os níveis de tRNA celular flutuam em resposta a condições variadas, como tipo de célula, ambiente e estresse.A flutuação da expressão do tRNA influencia diretamente a tradução gênica, favorecendo ou reprimindo a expressão de determinadas proteínas. Compreender a dinâmica da síntese de proteínas requer métodos capazes de fornecer perfis de tRNA de alta qualidade. Apresentamos aqui uma técnica confiável e direta que permite a quantificação rápida e precisa dos níveis de RNA de transferência em organismos cultivados em laboratório.Para começar, com uma agulha de calibre 18, coloque um único orifício no centro da tampa de um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro para permitir a aeração adequada. Em seguida, com cinco microlitros de Mycobacterium smegmatis de uma cultura inicial durante a noite, inocular 500 microlitros de caldo 7H9 estéril suplementado. Seguindo as práticas padrão de radioproteção, adicione 20 microcuries por mililitro de ortofosfato marcado com fósforo-32.Cultive bactérias a 37 graus Celsius e 1.200 rpm, em uma incubadora agitadora colocada atrás de um escudo de acrílico de nove milímetros de espessura. Na fase intermediária, transfira toda a cultura para um tubo com tampa de rosca de dois mililitros e pulverize bactérias radioativas à temperatura ambiente centrifugando a 10.000 vezes a gravidade por dois minutos. Recolher o sobrenadante contendo ortofosfato radioactivo não incorporado num contentor de resíduos adequado.Para preparar o RNA total, adicione um mililitro de reagente de extração de RNA comercial e aproximadamente 200 microlitros de esferas de vidro ao pellet. Tampe o tubo com segurança e interrompa as bactérias em um homogeneizador sob agitação máxima por dois minutos. Centrifugue a amostra a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros e descarte adequadamente as contas. Adicione 0,2 mililitros de clorofórmio e agite vigorosamente o tubo com a mão por 15 segundos. Em seguida, centrifugue a amostra a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 15 minutos.Colete a fase aquosa da amostra em um novo tubo, inclinando-o a 45 graus. Evite desenhar qualquer parte da interfase ou camada orgânica. Adicione dois microlitros de precipitante colorido e 0,5 mililitros de isopropanol 100% à fase aquosa.Agitar vigorosamente o tubo com a mão durante cinco segundos e centrifugar novamente. Retirar o sobrenadante do tubo e eliminá-lo adequadamente, uma vez que a fracção líquida pode conter vestígios de radioactividade. Em seguida, após secar o pellet ao ar por cinco minutos, ressuspendê-lo em 200 microlitros de 2X SSC com 0,1% de peso por volume SDS.Usando o banco de dados de tRNA genômico, projete sondas de DNA recuperando primeiro sequências de tRNA ou genes codificadores de tRNA. Depois de cortar os CCAs conservados de três extremidades primárias, se codificados, e gerar o complemento reverso, ordene as sondas com base nos primeiros 70 nucleotídeos. Para realizar a impressão de matrizes, descongele a placa de 96 poços à temperatura ambiente.Com uma caneta diamantada, rotule lâminas de vidro revestidas de amina. Em seguida, coloque os slides em uma unidade de indexação. Após os posicionamentos da grade, mergulhe cuidadosamente os pinos do replicador nos poços.Usando pressão mínima, imprima suavemente a matriz nas lâminas de vidro. Continue imprimindo sem limpar o arrayer até terminar com o bloco A.It requer alguma prática para poder imprimir de forma consistente. Recomendamos imprimir no máximo oito a 10 matrizes por sessão.Conte de 10 a 15 minutos por matriz. É fácil perder o controle da sequência de padrões de impressão, portanto, dedique toda a sua atenção à tarefa e desative todas as distrações. Quando estiver pronto para passar para o próximo bloco, mergulhe o replicador em 5% de alvejante e agite suavemente.Pressione o replicador em papel absorvente. Em seguida, mergulhe o replicador em água destilada, agite suavemente e pressione no papel. Repita esta etapa uma vez.Em seguida, mergulhe o replicador em isopropanol, agite suavemente e pressione-o no papel. Seque o replicador no ventilador por cerca de 20 segundos antes de passar para o próximo bloco da placa de 96 poços. Continue para o número desejado de impressões.Em seguida, deixe as lâminas secarem. Coloque as lâminas secas voltadas para cima em uma superfície limpa em um reticulador UV de 254 nanômetros. Defina o nível de energia para 999, 990 microjoules por centímetro quadrado e pressione iniciar.Transfira as matrizes para 450 mililitros de solução de bloqueio e incube-as à temperatura ambiente em um agitador magnético, sob agitação lenta durante a noite. Lave as lâminas em 500 mililitros de água destilada em temperatura ambiente, duas vezes por cinco minutos cada. Seque as lâminas centrifugando em uma centrífuga de microarray à temperatura ambiente por 10 segundos.Armazene as matrizes em local seco e escuro por até seis meses. Antes da hibridização, enxágue as lâminas em água fervente e seque-as por centrifugação. Coloque a matriz dentro de um de hibridização e carregue a amostra de RNA radiomarcada.Execute as amostras em uma estação automatizada de lavagem de hibridização para máxima reprodutibilidade de acordo com o protocolo de texto. No final da corrida, secar as lâminas por centrifugação. Enrole as lâminas com plástico fino.Em seguida, use um contador Geiger em sua configuração mais sensível para verificar se há sinal radioativo nos slides. Exponha as lâminas em uma tela de fósforo de armazenamento em um de exposição em temperatura ambiente por 10 a 90 horas, dependendo da intensidade do sinal. O tempo de exposição que pode durar de algumas horas a alguns dias depende diretamente do sinal da matriz.É preciso alguma prática para ser capaz de traduzir as contagens no contador Geiger em tempo de exposição. Digitalize a lâmina com resolução de 50 micrômetros usando um gerador de imagens de fósforo. Quantifique e subtraia as intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda usando o software gratuito ImageJ atualizado com um perfilador de microarray.Gere mapas de calor de acordo com o protocolo de texto. Aqui são mostrados macroarrays bacterianos, de camundongos e humanos escaneados. As matrizes M.smegmatis usam apenas 43 sondas em vez das 48 usadas para camundongos e humanos.Como resultado, a matriz bacteriana exibe 40 pontos vazios que se misturam com o fundo. Três réplicas biológicas independentes mostram que, sob as condições de crescimento testadas, todos os tRNAs de M. smegmatis são expressos acima do nível de fundo. Neste experimento em particular, o desvio padrão observado para cada sonda está entre 2% de arginina TCT e 22% de cisteína GCA com a mediana em 5% Além disso, este experimento mostra que a expressão dos isoaceitadores de tRNA não é uniforme.Por exemplo, todos os isoaceitadores de alanina são expressos em níveis semelhantes, enquanto os tRNAs de aceitação de arginina mais altos e mais baixos diferem em três vezes. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 24 horas se for executada corretamente e se o sinal pontual for adequado. Nosso método é aplicável a qualquer organismo cujo genoma esteja disponível para projeto de sonda.Organismos modelo cultivados in vitro são candidatos ideais para marcação metabólica. O protocolo apresentado aqui é otimizado para Mycobacterium smegmatis, mas também foi usado com sucesso para traçar o perfil de tRNA em E.coli, leveduras, camundongos e células cultivadas humanas. Nossa técnica é reprodutível e específica.Sua grande faixa dinâmica e limite facilmente ajustável permitem traçar perfis de espécies pouco abundantes, como tRNAs associados a polissomos, simplesmente prolongando os tempos de exposição da matriz.

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Research

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Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

O uso do uracil swcnts a purificar sensitivamente e especificamente o RNA recentemente transcrito do fermento Saccharomyces cerevisiae.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

O objetivo deste protocolo é possibilitar a medição quantitativa da vida útil da fluorescência das sondas Riboglow para fluxos de trabalho de imagem de RNA reprodutíveis in vitro, em células vivas de mamíferos e em modelos celulares tridimensionais. Descrevemos os fluxos de trabalho de preparação de amostras, entrega de sondas, aquisição de dados e análise quantitativa para extração de medições de vida útil de fluorescência imparciales.

Caracterização das Sondas de Riboglow In Vitro como Base para Imagens de Vida Fluorescente em Células Vivas de Mamíferos e Modelos Celulares Tridimensionais

Aprenda a quantificar níveis de tRNA em organismos de laboratório usando marcação metabólica in vivo e macroarrays. Este método rápido e reprodutível permite medir simultaneamente todos os RNAs de transferência em menos de 24 horas.

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