Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

O objetivo geral deste procedimento é medir simultaneamente os níveis celulares de todos os RNAs de transferência em amostras biológicas, combinando a marcação metabólica in vivo com a análise de macroarray. Os RNAs de transferência foram por muito tempo considerados moléculas de manutenção que careciam de funções regulatórias. No entanto, um crescente corpo de evidências indica que os níveis de tRNA celular flutuam em resposta a condições variadas, como tipo de célula, ambiente e estresse.

A flutuação da expressão do tRNA influencia diretamente a tradução gênica, favorecendo ou reprimindo a expressão de determinadas proteínas. Compreender a dinâmica da síntese de proteínas requer métodos capazes de fornecer perfis de tRNA de alta qualidade. Apresentamos aqui uma técnica confiável e direta que permite a quantificação rápida e precisa dos níveis de RNA de transferência em organismos cultivados em laboratório.

Para começar, com uma agulha de calibre 18, coloque um único orifício no centro da tampa de um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro para permitir a aeração adequada. Em seguida, com cinco microlitros de Mycobacterium smegmatis de uma cultura inicial durante a noite, inocular 500 microlitros de caldo 7H9 estéril suplementado. Seguindo as práticas padrão de radioproteção, adicione 20 microcuries por mililitro de ortofosfato marcado com fósforo-32.

Cultive bactérias a 37 graus Celsius e 1.200 rpm, em uma incubadora agitadora colocada atrás de um escudo de acrílico de nove milímetros de espessura. Na fase intermediária, transfira toda a cultura para um tubo com tampa de rosca de dois mililitros e pulverize bactérias radioativas à temperatura ambiente centrifugando a 10.000 vezes a gravidade por dois minutos. Recolher o sobrenadante contendo ortofosfato radioactivo não incorporado num contentor de resíduos adequado.

Para preparar o RNA total, adicione um mililitro de reagente de extração de RNA comercial e aproximadamente 200 microlitros de esferas de vidro ao pellet. Tampe o tubo com segurança e interrompa as bactérias em um homogeneizador sob agitação máxima por dois minutos. Centrifugue a amostra a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros e descarte adequadamente as contas. Adicione 0,2 mililitros de clorofórmio e agite vigorosamente o tubo com a mão por 15 segundos. Em seguida, centrifugue a amostra a 12.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Colete a fase aquosa da amostra em um novo tubo, inclinando-o a 45 graus. Evite desenhar qualquer parte da interfase ou camada orgânica. Adicione dois microlitros de precipitante colorido e 0,5 mililitros de isopropanol 100% à fase aquosa.

Agitar vigorosamente o tubo com a mão durante cinco segundos e centrifugar novamente. Retirar o sobrenadante do tubo e eliminá-lo adequadamente, uma vez que a fracção líquida pode conter vestígios de radioactividade. Em seguida, após secar o pellet ao ar por cinco minutos, ressuspendê-lo em 200 microlitros de 2X SSC com 0,1% de peso por volume SDS.

Usando o banco de dados de tRNA genômico, projete sondas de DNA recuperando primeiro sequências de tRNA ou genes codificadores de tRNA. Depois de cortar os CCAs conservados de três extremidades primárias, se codificados, e gerar o complemento reverso, ordene as sondas com base nos primeiros 70 nucleotídeos. Para realizar a impressão de matrizes, descongele a placa de 96 poços à temperatura ambiente.

Com uma caneta diamantada, rotule lâminas de vidro revestidas de amina. Em seguida, coloque os slides em uma unidade de indexação. Após os posicionamentos da grade, mergulhe cuidadosamente os pinos do replicador nos poços.

Usando pressão mínima, imprima suavemente a matriz nas lâminas de vidro. Continue imprimindo sem limpar o arrayer até terminar com o bloco A.It requer alguma prática para poder imprimir de forma consistente. Recomendamos imprimir no máximo oito a 10 matrizes por sessão.

Conte de 10 a 15 minutos por matriz. É fácil perder o controle da sequência de padrões de impressão, portanto, dedique toda a sua atenção à tarefa e desative todas as distrações. Quando estiver pronto para passar para o próximo bloco, mergulhe o replicador em 5% de alvejante e agite suavemente.

Pressione o replicador em papel absorvente. Em seguida, mergulhe o replicador em água destilada, agite suavemente e pressione no papel. Repita esta etapa uma vez.

Em seguida, mergulhe o replicador em isopropanol, agite suavemente e pressione-o no papel. Seque o replicador no ventilador por cerca de 20 segundos antes de passar para o próximo bloco da placa de 96 poços. Continue para o número desejado de impressões.

Em seguida, deixe as lâminas secarem. Coloque as lâminas secas voltadas para cima em uma superfície limpa em um reticulador UV de 254 nanômetros. Defina o nível de energia para 999, 990 microjoules por centímetro quadrado e pressione iniciar.

Transfira as matrizes para 450 mililitros de solução de bloqueio e incube-as à temperatura ambiente em um agitador magnético, sob agitação lenta durante a noite. Lave as lâminas em 500 mililitros de água destilada em temperatura ambiente, duas vezes por cinco minutos cada. Seque as lâminas centrifugando em uma centrífuga de microarray à temperatura ambiente por 10 segundos.

Armazene as matrizes em local seco e escuro por até seis meses. Antes da hibridização, enxágue as lâminas em água fervente e seque-as por centrifugação. Coloque a matriz dentro de um de hibridização e carregue a amostra de RNA radiomarcada.

Execute as amostras em uma estação automatizada de lavagem de hibridização para máxima reprodutibilidade de acordo com o protocolo de texto. No final da corrida, secar as lâminas por centrifugação. Enrole as lâminas com plástico fino.

Em seguida, use um contador Geiger em sua configuração mais sensível para verificar se há sinal radioativo nos slides. Exponha as lâminas em uma tela de fósforo de armazenamento em um de exposição em temperatura ambiente por 10 a 90 horas, dependendo da intensidade do sinal. O tempo de exposição que pode durar de algumas horas a alguns dias depende diretamente do sinal da matriz.

É preciso alguma prática para ser capaz de traduzir as contagens no contador Geiger em tempo de exposição. Digitalize a lâmina com resolução de 50 micrômetros usando um gerador de imagens de fósforo. Quantifique e subtraia as intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda usando o software gratuito ImageJ atualizado com um perfilador de microarray.

Gere mapas de calor de acordo com o protocolo de texto. Aqui são mostrados macroarrays bacterianos, de camundongos e humanos escaneados. As matrizes M.smegmatis usam apenas 43 sondas em vez das 48 usadas para camundongos e humanos.

Como resultado, a matriz bacteriana exibe 40 pontos vazios que se misturam com o fundo. Três réplicas biológicas independentes mostram que, sob as condições de crescimento testadas, todos os tRNAs de M. smegmatis são expressos acima do nível de fundo. Neste experimento em particular, o desvio padrão observado para cada sonda está entre 2% de arginina TCT e 22% de cisteína GCA com a mediana em 5% Além disso, este experimento mostra que a expressão dos isoaceitadores de tRNA não é uniforme.

Por exemplo, todos os isoaceitadores de alanina são expressos em níveis semelhantes, enquanto os tRNAs de aceitação de arginina mais altos e mais baixos diferem em três vezes. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 24 horas se for executada corretamente e se o sinal pontual for adequado. Nosso método é aplicável a qualquer organismo cujo genoma esteja disponível para projeto de sonda.

Organismos modelo cultivados in vitro são candidatos ideais para marcação metabólica. O protocolo apresentado aqui é otimizado para Mycobacterium smegmatis, mas também foi usado com sucesso para traçar o perfil de tRNA em E.coli, leveduras, camundongos e células cultivadas humanas. Nossa técnica é reprodutível e específica.

Sua grande faixa dinâmica e limite facilmente ajustável permitem traçar perfis de espécies pouco abundantes, como tRNAs associados a polissomos, simplesmente prolongando os tempos de exposição da matriz.