Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca

O objetivo geral deste procedimento é descrever como os níveis endógenos de fitohormônios mudam durante a formação de brotos adventícios em ipeca. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à regeneração de tecidos na roda de cultura de tecidos vegetais. A principal vantagem desta técnica é o nível endógeno de ácido indol-3-acético e as citocininas podem ser simplesmente analisadas com alta sensibilidade.

A implicação dessa técnica se estende por todo o estabelecimento da degeneração do tecido vegetal, pois as alterações no nível endógeno de fitohormônios desencadeiam a formação de brotos adventícios. Para começar, prepare um meio B5 sem fitohormônios e adicione 0,2% de goma gelana. Em seguida, autoclave o meio para esterilizá-lo.

Usando um bisturi cirúrgico em uma placa de acrílico estéril, corte segmentos internodais de oito milímetros de plântulas de ipeca e coloque-os no meio. Em seguida, cultive os segmentos de ipeca a 24 graus Celsius sob 15 micromoles por metro quadrado de segundo de luz em um ciclo de luz de 14 horas e escuro de 10 horas por cinco semanas. Depois de cultivar os segmentos de ipeca, identifique as regiões de um a quatro em cada segmento.

Uma vez por semana, use um microscópio para contar o número de brotos adventícios em cada região. Primeiro, coloque um cordão de zircônia de cinco milímetros em quatro tubos de amostra de dois mililitros. Em seguida, use um bisturi cirúrgico em uma placa de acrílico estéril para cortar os segmentos de ipeca nas regiões I a IV. Em seguida, colete oito segmentos de cada região em um tubo de amostra.

Pesar cada uma das amostras e congelá-las em azoto líquido. Em seguida, use um homogeneizador à base de esferas para esmagar as amostras congeladas. Use um misturador de vórtice para suspender as amostras em um mililitro de acetonitrila com 500 picogramas de cada padrão interno de bois e CKs.

Alojar as amostras a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, centrifugue as amostras a 3500 G por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave o pellet em 80% de acetal nitrilo com um por cento de ácido acético.

Em seguida, repita a centrifugação e use um tubo de classe descartável para combinar os sobrenadantes. Adicione 600 microlitros de água com um por cento de ácido acético ao sobrenadante combinado. Em seguida, use um concentrador de vácuo para evaporar o acetal nitrilo.

Carregue as soluções de amostra em cartuchos HLB balanceados individuais. E lave os cartuchos com um mililitro de água com um por cento de ácido acético. Em seguida, aluda a todos os hormônios com dois mililitros de acetil nitrilo a 80% com ácido acético a 1% em um tubo de vidro.

Usando um concentrador a vácuo, evapore o acetal nitrilo para obter extrato em água com um por cento de ácido acético. Carregue as soluções de amostra em cartuchos MCX balanceados individuais e lave os cartuchos com um mililitro de água com ácido acético a um por cento. Em seguida, aluda ao IAA em um tubo de vidro, com dois mililitros de nitrilo acetal a 30% com ácido acético a 1%.

Em seguida, lave os cartuchos com dois mililitros de acetal nitrilo a 80% com ácido acético a 1%. Em seguida, lave os cartuchos com dois mililitros de água e um mililitro de água com cinco por cento de amônia aquosa em uma câmara de tiragem. Aluda aos CKs em um tubo de vidro com dois mililitros de 60% de nitrilo acetal com cinco por cento de amônia aquosa em uma câmara de tiragem.

Em seguida, use um concentrador a vácuo para evaporar o solvente de cada fração hormonal. Agitar as amostras a menos trinta graus Celsius até à análise LCMSMS. Primeiro, dissolva cada extrato hormonal em um tubo com 600 microlitros de metanol.

Em seguida, transfira a solução para um frasco para injetáveis de recuperação total com gargalo de rosca e utilize um concentrador de vácuo para evaporar o solvente. Dissolva a fração IAA em 20 microlitros de acetal nitrilo a 30% e as frações CK em 20 microlitros de água com ácido acético a 1%. Em seguida, use um sistema MS triplo quadrupolo equipado com um sistema HPLC para analisar as amostras no modo de íons positivos.

Finalmente, quantifique o IAA endógeno nos níveis de CK em relação a uma curva padrão da proporção de padrões de marcação não marcados com deutério. Neste protocolo, a citocinina oxidante endógena em calhas adventícias foi medida via LCMSMS por cinco semanas. Na primeira semana, nenhuma calha adventícia se formou e as primeiras pequenas rampas apareceram durante a segunda semana.

Durante a terceira e quarta semanas, o número de calhas aumentou principalmente nos regentes um e dois. Durante a quinta semana, o número de calhas foi de aproximadamente sete na região um e cinco na região dois. Antes da cultura, o nível de IAA era ligeiramente maior na região um do que nas regiões dois, três e quatro.

Durante a primeira semana, o nível de IAA aumentou muito na região quatro e diminuiu ligeiramente nas regiões um, dois e três. Em cinco semanas de cultivo, surgiu um gradiente de concentração de IAA. Com níveis aumentando da região um para a região quatro.

Antes da cultura, havia apenas vestígios da maioria das CKs. Na primeira semana, o nível de tZR aumentou para 13,8 picogramas por miligrama na região dois. E 18,1 picogramas por miligrama na região três.

Em contraste, os níveis de tZ, iP e iPR mudaram apenas ligeiramente durante o cultivo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o hormônio da parte endógena é estável. Depois de desenvolvida pelo homem, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da cultura de tecidos vegetais.

Explorar a formação adventícia em outros organismos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar o ácido indol-3-acético endógeno e as citocininas.