Name: Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar auxina e citocinina endógenas durante a formação de brotos adventícios em ipeca usando LC-MS/MS. Este método de alta sensibilidade auxilia pesquisadores a compreender a regeneração de tecidos vegetais.

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Nós estamos gratos ao Sr. Akira Murakami do departamento de Biociências aplicadas, Universidade de Toyo e Sr. Koudai Taniguchi do centro de tecnologia agrícola de Gunma para sua assistência técnica. Nós também estamos gratos ao Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidade Toyo para suas sugestões. Este estudo foi suportado em parte pelo centro de pesquisa para a vida e ciências ambientais, Universidade de Toyo.

Nota: Poaia (ipecacuanha c.) foi usada neste estudo porque facilita a análise de fitohormônios endógenas.
1. crescimento condições para induzir brotos adventícios de ipeca
<ol><li>Prepare phytohormone livre B5 médio ajustado ao pH 5.710e adicionar gelano 0,2%. Esterilize em autoclave.</li>
	<li>Despeje uma placa de Petri estéril (90 mm × 20 mm), 25 mL do meio de autoclave.</li>
	<li>Corte-8mm internodal segmentos de plântulas de ipecac, usando um bisturi cirúrgico com uma lâmina n º 22, em uma placa de acrílico estéril e coloque no meio (Figura 1).</li>
	<li>Cultura livre phytohormone B5 meio a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h por 5 semanas.</li>
	<li>Identificar regiões eu (apical) a IV (basal) em cada segmento (Figura 1B). Conte o número de brotos adventícios > 0,3 mm de comprimento em cada região sob um microscópio, uma vez por semana.</li>
</ol>2. extração e purificação de fitohormônios
<ol><li>Coloque uma pérola zircônia 5 mm em cada um dos quatro tubos 2 mL de amostra.</li>
	<li>Corte os segmentos em regiões I a IV (cada 2 mm em comprimento) usando um bisturi cirúrgico em uma placa de acrílico estéril.</li>
	<li>Colete oito segmentos de cada região em tubos de amostra separada (peso fresco de 10 a 30 mg).</li>
	<li>Pesar e em seguida, congelar as amostras em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Esmaga as amostras congeladas, usando um homogeneizador de grânulo-baseado.</li>
	<li>Suspender as amostras esmagadas em 1 mL acetonitrila contendo 500 pg de cada padrão interno de auxina e CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) usando um misturador do vortex.</li>
	<li>Mantenha a 4 ° C, durante 1 h e, em seguida, centrifugar a 3.500 × g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave o pellet em acetonitrila 80% (v/v) contendo ácido acético a 1% (v/v). Centrifugar novamente 3.500 × g por 5 min à temperatura ambiente. Combine os sobrenadantes (a partir de etapas 2.7 e 2.8) em um tubo de vidro descartáveis.</li>
	<li>Adicione 600 µ l contendo ácido acético de 1% (v/v) para cada sobrenadante combinada de água e evaporar o acetonitrilo usando um concentrador a vácuo.</li>
	<li>Equilibrar o hidrófilo lipofílico-balanceamento de cartuchos de coluna (HLB) aplicando-se 1 mL de água contendo 1% (v/v) de ácido acético, metanol e acetonitrila.</li>
	<li>Aplica uma solução de amostra por cartucho HLB equilibrado.</li>
	<li>Lave os cartuchos com 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).</li>
	<li>Eluir todos hormônios com acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL contendo ácido acético a 1% (v/v) em um tubo de vidro.</li>
	<li>Evapore o acetonitrilo no eluato para obter o extrato em água contendo 1% (v/v) de ácido acético usando um concentrador a vácuo. Nota: Não seque isto completamente.</li>
	<li>Equilibrar os cartuchos de coluna de modo misto, forte permutadora de catiões (MCX) aplicando-se 1 mL acetonitrilo, 1 mL de metanol, 0,5 mL 0,1 M de HCl e 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).</li>
	<li>Aplica uma solução de amostra por cartucho MCX equilibrado.</li>
	<li>Lave os cartuchos com 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).</li>
	<li>Eluir IAA com acetonitrilo de 30% (v/v) de 2 mL contendo ácido acético a 1% (v/v) em um tubo de vidro.</li>
	<li>Lave os cartuchos com acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL contendo 1% (v/v) de ácido acético.</li>
	<li>Lave os cartuchos com 2 mL de água e 1 mL de água contendo amônia aquosa de 5%.</li>
	<li>Eluir os CKs com acetonitrilo de 60% (v/v) de 2 mL contendo 5% de amônia aquosa em um tubo de vidro.</li>
	<li>Evaporar o solvente de cada fração do hormônio usando um concentrador a vácuo e armazenar a 30 ° C até a análise de LC-MS/MS.</li>
</ol>3. a LC-MS/MS análise de IAA e CKs
<ol><li>Dissolver cada extracto de hormônio em um tubo com 600 µ l de metanol e transferir a solução para um frasco de recuperação total do pescoço de parafuso. Evapore o solvente usando um concentrador a vácuo.</li>
	<li>Dissolva a fração de IAA em 20 µ l de 30% (v/v) acetonitrila e as frações CK em água de 20 µ l contendo ácido acético a 1% (v/v) em frascos de recuperação total de pescoço de parafuso.</li>
	<li>Analise as amostras no modo de íon positivo em um sistema de MS triplo quadrupolo equipado com um sistema HPLC. Nota: Podemos definir as condições HPLC conforme listado na tabela 1.<ol>
<li>Para a eluição do IAA, use um gradiente binário de 5% - 50% solvente B mais 7 min, em seguida, aumentar por 98% de solvente B Aguarde 1 min e então equilibrar por 2 min em 5% solvente B por injeção de ninho.</li>
		<li>Para a eluição de CK, use um gradiente binário de 2% - 40% de solvente B mais 5 min, 40% - 70% de solvente B em 7 min, em seguida, aumentar em 95% solvente B Aguarde 1 min e então equilibrar por 2 min em 2% solvente B por ninho de injeção.</li>
		<li>Definir a ionização electrospray (ESI)-MS parâmetros da fonte de íons, conforme listado na tabela 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use a reação múltiplo monitoramento transição (MRM) para quantificação de cada analito listado na tabela 3.</li>
	<li>Quantificar os níveis endógenos de IAA e CK contra uma curva-padrão do rácio de sem rótulo para padrões de deutério-rotulado.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
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<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.

Para identificar a distribuição dos fitohormônios envolvidos na organogênese, é importante o uso de materiais vegetais em que organogênese pode ser observado na média phytohormone-livre, porque quando os fitohormônios são exogenamente aplicados a explantes para induzir brotos ou raízes, elas afetam o explante todo, tornando-se difícil avaliar a plasticidade inerente de plantas na diferenciação celular e organogênese. Brotos adventícios podem ser induzidos em meios de cultura livre phytohormone em outras espécies de plant...

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propôs o conceito de "totipotência", pela qual planta células podem dividir, diferenciar e regenerar plantas inteiras mesmo após sua prévia diferenciação em tipos de células específicas em plantas maduras1. Em cultura de tecidos, se planta regeneração pode ser induzida ou não é determinada pela combinação e concentração de fitohormônios exogenamente aplicadas no meio de crescimento. Skoog e Miller encontraram que brotos adventícios poderiam ser induzidos de tabaco calo no meio de cultura contendo uma alta proporção de CKs de auxinas, Considerando que raízes adventícias poderiam ser induzidas em meio contendo uma baixa relação2. Desde essa constatação, cultura de tecidos foi amplamente utilizada para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgénicas3. Brotos adventícios podem ser induzidos a partir de tecidos que não sejam o meristema apical de tiro, como folhas, raízes e entrenós. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies de plantas. No entanto, o ideais concentrações e combinações diferem por espécie e entre tecidos utilizados como explantes. Assim, muito esforço vai para determinação da concentração ideal e combinações de fitohormônios para experimentos.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecacuanha) é uma planta medicinal que contém alcaloides como Emetina e a Cefalina, principalmente no raízes4. Extratos de raiz são usados como um expectorante, um emético e um amoebicide5. Embora ipecac cresce naturalmente nas florestas tropicais do Brasil, é relutante em conjunto de sementes na cultura, e a taxa de germinação diminui durante o armazenamento de sementes no Japão, com seus de clima mais frio6. Em vez disso, ele é propagado por cultura de tecidos, no qual adventícios atirar formação em entrenós é o mais eficiente método de7,8. Curiosamente, os brotos adventícios podem ser induzidos nesta espécie sem phytohormone tratamento8.
Brotos adventícios são formados na epiderme na região apical dos segmentos internodal sem callusing, mas não na região basal9. Esta diferença indica a polaridade do tecido em segmentos internodal, que é, provavelmente, ao abrigo do Regulamento fitohormonal. O sistema de cultura de ipecac permite uma oportunidade única para analisar as alterações nos níveis endógenos phytohormone durante formação de tiro acidental. Aqui apresentamos nosso método para a análise dos níveis endógenos de uma auxina (ácido indol-3-acético (IAA)) e quatro CKs (isopentenilo adenina (iP), Ribosídica de adenina de isopentenilo (iPR), trans-Zeatina (tZ) e trans-Zeatina Ribosídica (tZR)) em segmentos internodal através do uso de LC-MS/MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5]ácido indol-3-acético</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>Padrão interno para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>Padrão interno para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatina ribosídeo</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>Padrão interno para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenil adenina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>Padrão interno para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenil adenosina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>Padrão interno para ácido indol-3-acético LC-MS/MS</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>098 00181</td><td>padrão para LC-MS/</td></tr><tr><td>MS trans-zeatina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td><td>padrão para LC-MS/</td></tr><tr><td>MS trans-zeatina ribosídeo</td><td>Wako</td><td>262 01081</td><td>padrão para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenil adenina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>padrão para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenil adenosina</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>padrão para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>acetonitrila hipergrade para LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>solvente para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Água para cromatografia LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>solvente para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>Proeminência</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 mg/1 cc</td><td>Coluna</td><td>de cartucho de WAT094225</td><td></td>Waters</tr><tr><td>Oasis MCX 30 mg/1 cc</td><td>Frasco</td> de recuperação total do <td>gargalo de rosca da coluna de cartucho</td><td>de 186000252</td></tr><tr><td></td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>azul, tampa de pescoço de rosca de 12 x 32 mm e septo de PTFE/silicone</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mm</td><td>Coluna Waters</td><td>186002350</td><td>UPLC</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>Coluna UPLC</td></tr><tr><td>Microscópio digital</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica</td><td>Feather</td><td>No. 22</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Feather</td><td>No. 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/Armadilha de vapor refregenada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>concentrador de vácuo</td></tr><tr><td>Tobe de vidro descartável (13x100 mm)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de auxina endógena e citocinina durante internode cultura de ipeca

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

Formação de tiro acidental é uma técnica importante para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgênicas. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies. Se os brotos adventícios podem ser induzidos é determinado pelo saldo entre a auxina e citocinina (CK) níveis. Muito esforço vai para determinar concentrações óptimas e combinações de fitohormônios em cada tecido usado como explantes e em cada espécie de planta. Em ipecac, no entanto, brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal em meio de cultura sem tratamento phytohormone. Isso permite que a plasticidade inerente de ipeca para diferenciação de célula a ser avaliada. Para induzir os brotos adventícios em ipecac, nós cultivadas internodal segmentos a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h phytohormone livre B5 meio solidificado com 0,2% gelano por 5 semanas. Para investigar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógeno ácido indol-3-acético e CKs nos segmentos por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia de LC-MS/MS. Este método permite a análise de ácido indol-3-acético endógeno e CKs níveis de forma simples. Pode ser aplicado para investigar a dinâmica de auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.

Em 1 semanast , sem brotos adventícios tinham formado. Na semana de 2nd , pequenos brotos apareceram. O 3rd e 4 semanas deth , o número de tiros aumento principalmente nas regiões apicais (I e II)(Figura 2). Na semana de 5th , o número de brotos foi aproximadamente 7 em região eu e 5 na região II (Figura 2B). Em contraste, apenas alguns tiros...

Brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal de ipeca sem tratamento phytohormone. Para avaliar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógena auxina e citocinina em segmentos internodal por LC-MS/MS.

Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever como os níveis endógenos de fitohormônios mudam durante a formação de brotos adventícios em ipeca. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à regeneração de tecidos na roda de cultura de tecidos vegetais. A principal vantagem desta técnica é o nível endógeno de ácido indol-3-acético e as citocininas podem ser simplesmente analisadas com alta sensibilidade.A implicação dessa técnica se estende por todo o estabelecimento da degeneração do tecido vegetal, pois as alterações no nível endógeno de fitohormônios desencadeiam a formação de brotos adventícios. Para começar, prepare um meio B5 sem fitohormônios e adicione 0,2% de goma gelana. Em seguida, autoclave o meio para esterilizá-lo.Usando um bisturi cirúrgico em uma placa de acrílico estéril, corte segmentos internodais de oito milímetros de plântulas de ipeca e coloque-os no meio. Em seguida, cultive os segmentos de ipeca a 24 graus Celsius sob 15 micromoles por metro quadrado de segundo de luz em um ciclo de luz de 14 horas e escuro de 10 horas por cinco semanas. Depois de cultivar os segmentos de ipeca, identifique as regiões de um a quatro em cada segmento.

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