Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

O objetivo geral deste protocolo é gerar uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidos a partir de fibroblastos de pele humana adulta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos distúrbios neurológicos, pois permite a degeneração de um sistema neural baseado no paciente que mantém a idade da célula. A principal vantagem desse método é que ele permite a geração de neurônios induzidos de pessoas de qualquer idade de maneira muito padronizada e eficiente em apenas 25 dias.

Ele permite uma vasta gama de aplicações biomédicas, incluindo modelagem de doenças, toxicologia, diagnósticos, bem como ensaios de triagem de drogas em grande escala. Demonstrando o procedimento estará Shelby, uma estudante de doutorado dentro da unidade onde o cérebro treina, bem como Karlonia, em nosso laboratório. Para começar, descongele os fibroblastos dérmicos humanos adultos usando um sistema automatizado de descongelamento celular.

Depois de contar o número de células com um contador de células automatizado, semeie duzentas mil células por frasco T-75 contendo 10 mililitros de meio fibroblasto. Manter a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o meio antigo por meio de fibroblastos novo.

Continue trocando o meio de fibroblastos a cada três ou quatro dias até que as células atinjam 95% de confluência. Uma hora antes de revestir os fibroblastos dérmicos humanos adultos da reprogramação, cubra cada poço de uma placa de 24 poços com 250 microlitros de gelatina a 0,1%. Incube a placa a 37 graus Celsius.

Aspire o meio de fibroblastos do frasco e lave com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco uma vez. Após a lavagem, lise as células com 1,5 mililitros de 0,05% de tripsina por frasco T-75 a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione três mililitros de meio fibroblasto para neutralizar a solução de tripsina.

Resfrie as células destacadas em um tubo de 15 mililitros, lavando as células do frasco duas vezes. Em seguida, centrifugue as células a 400 G durante cinco minutos. Expulsar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em um mililitro de meio fibroblasto.

Em seguida, prepare uma suspensão celular de 1.320.000 células em 13,2 mililitros de meio fibroblasto para atingir 100.000 células por mililitro de meio. Depois de aspirar a gelatina da placa, lave a placa com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco duas vezes. Em seguida, adicione 500 microlitros de suspensão celular a cada um dos poços e incube a 37 graus Celsius durante a noite.

Aqueça 13,2 mililitros de meio de fibroblastos a 37 graus Celsius. Em seguida, descongele o vetor lentiviral na coifa laminar à temperatura ambiente. Adicione o volume necessário de lentivírus necessário para infectar os fibroblastos dérmicos humanos adultos em uma multiplicidade de infecção de 20 ao meio sem nenhum intensificador de transdução.

Em seguida, substitua o meio por 500 microlitros de meio fibroblasto com a adição do vetor lentiviral. Incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio contendo lentivírus por meio de fibroblastos fresco sem o vetor lentiviral.

No terceiro dia após a transdução viral, remova o meio de fibroblastos e adicione 500 microlitros de meio de conversão neuronal inicial. Duas ou três vezes por semana, substitua 225 microlitros de meio antigo de cada poço por 250 microlitros de meio de conversão neuronal inicial fresco. No 18º dia após a transdução viral, remova o meio de conversão neuronal precoce e substitua por 500 microlitros de meio de conversão neuronal tardia.

Continue trocando o meio a cada dois ou três dias como antes até o 25º dia ou o ponto final experimental. Use uma pipeta de 1000 microlitros para remover o meio. Em seguida, adicione dois 250 microlitros de agente dissociante celular a cada poço e deixe a placa na incubadora por 10 a 20 minutos até que as células se desprendam e flutuem como células únicas.

Enquanto isso, prepare o buffer FACS. Triturar com uma pipeta de 1000 microlitros. Incube um pouco mais se houver aglomerados de células restantes.

Transferir a suspensão monocelular obtida para um tubo de 1,5 mililitros. Lave os poços duas vezes com meio de conversão neuronal tardia e transfira para o mesmo tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue a 400 G durante cinco minutos e elimine o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão FACS. Novamente, gire as células a 400 G por cinco minutos e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em tampão FACS e centrifugue.

Repita mais duas vezes. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 50 microlitros de tampão FACS contendo anticorpo CD56 humano em uma concentração de um a 50 por 15 minutos no gelo, longe da luz. Centrifugue as células a 400 G por cinco minutos e dissolva o pellet celular em 200 microlitros de tampão FACS para lavar as células.

Centrifugar novamente as células a 400 G durante cinco minutos. Lavar duas vezes com tampão FACS, seguido de centrifugação. Finalmente, ressuspenda em 200 microlitros de tampão FACS contendo 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio.

Classificar as células positivas e negativas para o iodeto de propídio utilizando gating com base no nível de intensidade de fluorescência das amostras de controlo que não foram coradas com o anticorpo NCAM ou com o iodeto de propídio. Use um contador de células automatizado para contar o número de células e semeie 50.000 células por centímetro quadrado em uma placa revestida de fibronectina e laminina poli-L-ornitina com meio de conversão neuronal tardio. Continue mudando metade do meio duas a três vezes por semana com o meio de conversão neuronal tardia até o ponto final experimental.

Imagens representativas de contraste de fase mostram as mudanças morfológicas nas células durante o período de conversão. Uma transformação significativa na morfologia celular é visível a partir do quinto dia. No 22º dia, aproximadamente metade das células se converteu em neurônios.

Imagens representativas de fluorescência amino mostram a presença de marcadores neuronais padrão nas células. No 25º dia, as células obtêm morfologia neuronal e expressam marcadores neuronais como MAP2 e TAU. Os núcleos são corados com DAPI.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar neurônios induzidos a partir de fibroblastos humanos adultos. E isso inclui o revestimento das células para reprogramação, transdução viral, manutenção celular, bem como classificação FACS para purificação. O desenvolvimento dessa técnica abre caminho para que pesquisadores da área de distúrbios neurológicos estudem diferentes características associadas à doença, bem como possíveis terapias.

E isso pode ser feito em um sistema que não é apenas um sistema neural humano, mas que pode ser específico do paciente e da doença.