Name: Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a reconstituir proteínas de membrana em bicamadas lipídicas sem detergente usando proteolipossomos fusogênicos complementares. Este método rápido permite montar sistemas de membrana multi-componentes para estudos de biologia sintética.

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Autores agradecem a Robert Gennis da Universidade de Illinois e Christoph von Ballmoos da Universidade de Berna para a prestação de um plasmídeo e uma estirpe de expressar bo3-oxidase. O projeto foi apoiado pela BBSRC conceder BB/L01985X/1 a R.I. e R.B.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A seguir alguns problemas precisam ser considerados para o sucesso desta abordagem experimental:
Escolha de carga lipídica para bilayers proteoliposomes e alvo: Lipídios catiônicos não são encontrados na natureza, enquanto lipídios aniônicos são abundantes em membranas biológicas, atingindo, por exemplo, ~ 25, 35 e 20% na membrana interna da e. coli, a membrana plasmática de levedura S. cerevisiaee membranas mitocondriais internas de muitas espécies, respectivamente27,28,29. Seria razoável esperar que a funcionalidade das proteínas de membrana em PL+ pode ser afectada pela força de uma carga positiva da bicamada, que por sua vez depende de um conteúdo relativo de lipídios catiônicos na BICAMADA e externo iônico força. Portanto, é importante abordar experimentalmente em que medida a funcionalidade das proteínas de membrana de interesse dependeria a carga do ambiente lipídios catiônicos. Aqui, nós mostramos que ambos F1Fo ATP sintase e bo3-oxidase são sensíveis ao ambiente de lipídios catiônicos, mas conseguimos modular e reverter esse efeito primeiro colocando as proteínas em PL+ e entregá-los em aniônicos, aceitando bilayers e em seguida, aumento da força iônica do meio de reação após a fusão está acabado.
Escolha de um determinado lipídios catiônicos: A maioria dos lipídios catiônicos comercialmente disponíveis são de natureza não-triacilglicerol; Portanto um lipido candidato potencial deve ser testado para compatibilidade com proteínas de membrana de interesse. Encontramos anteriormente15 que a ATP sintase utilizado neste estudo mostrou que seu melhor desempenho no PL+ formada de etil-PC, que tem a maior semelhança estrutural para os lipídios de triacilglicerol natural, enquanto em DOTAP (não-triacilglicerol lipídica) PL+ esta proteína foi menos ativa.
Ensaios de fusão de vesículas: Fusão de vesículas verdadeira (quando o conteúdo líquido intravesicular mistura) precisa ser diferenciada de Estados intermediários de hemi-fusão, quando vesículas aderem-se uns aos outros sem misturar seu conteúdo aquoso, mas facilmente misturam o conteúdo do seu externo ou ambos os lipídios folhetos de30. No caso de misturas de lipídios suboptimal ou certas condições, vesículas demonstraram também pronunciado vazamento conteúdo líquido durante fusão31. Concentrações mínimas de lipídeos carregadas em misturas de fusogenic permitindo a verdadeira fusão precisam ser encontrado experimentalmente para cada espécie de lipídios, mas em geral, encontra-se que as membranas com menos de 10% cobrado lipídios são processados não-fusogenic 32.
Enquanto formando fusogenic SUV na presença de íons de multi-valente, é importante não misturar componentes de carga oposta, pois isso pode causar aglutinação imediata e agregação de lipídios por esses íons. Por exemplo, enquanto se prepara SUV para o método de cobalto-calceína-EDTA, é importante evitar a mistura de uma mistura de lipídios catiônicos com EDTA para evitar o entupimento do filtro de policarbonato por componentes agrupados.
Também é importante mencionar que o método de cobalto-calceína-EDTA, sendo muito sensível e conveniente para monitoramento em tempo real fusão, pode ainda subestimam o grau de fusão devido 1) Self têmpera da fluorescência de calceína livre dentro vesículas postfusion, que é esperado para chegar a 1 mM, enquanto o limite de resfriamento self é relatado para ser em torno de 20 µM,33e 2) ligados a superfície cobalto-calceína, que permanece ligado ao SUV+ mesmo após a passagem com a resina de gel filtração e cores vesículas para uma cor laranja brilhante, enquanto o SUV0 tem uma cor laranja pálida. Observe também que o lançamento do limite cobalto-calceína sobre adição de detergente Triton X-100 na presença de EDTA gera sinais muito mais fortes para SUV+ (Figura 3, traço vermelho) que SUV0 (traço cinzento).
Perspectivas: esperamos que as abordagens rápidas descritas aqui grandemente podem facilitar e acelerar a montagem do complexo de membranas para as necessidades dos emergentes aplicações de biologia sintética. Nosso protocolo de reconstituição de proteína de membrana leva apenas meia hora para reconstituição das proteínas de membrana grande frágil conhecidos para ser sensível às técnicas demoradas reconstituição baseada em diálise, enquanto esta abordagem fusogenic leva apenas 5-10 min para entregar essas proteínas em bilayers do lipid grande. Aqui, demonstramos as vantagens dessas abordagens manipulando Escherichia coli F1Fo ATP sintase, que é um exemplo de uma proteína frágil. É feito de 23 subunidades e é conhecido por facilmente perder sua integridade se expostos a condições de qualidade inferior (por exemplo, calor) durante/Após solubilização, mas sendo usado nesses procedimentos, a proteína demonstra reproducibly alta atividade no bombeamento de prótons.

Functionalization de bilayers do lipid artificial com proteínas da membrana é um passo fundamental na montagem de sistemas de membrana modelo. O modelo mais simples, proteoliposomes (PL), consiste de pequenas (30-200 nm de diâmetro) unilamellar vesículas (SUV, também chamados lipossomas), com proteínas integrados em suas membranas. PL formam-se tradicionalmente em duas etapas1. Primeiro, pré-formadas SUV são misturados com uma proteína de membrana de interesse e um detergente em concentrações acima de sua concentração crítica micelle (CMC). Em segundo lugar, o detergente é removido com diálise, "bio-beads" ou gel filtração técnicas diferentes, deixando a proteína na membrana. A última abordagem é muito mais rápido (~ 30 min1) e, portanto, é preferível para reconstituição das proteínas de membrana frágil e sensível, enquanto as duas primeiras abordagens são limitadas pela velocidade de remoção do detergente, que leva muitas horas e pode causar um substancial perda de atividade e perda da integridade estrutural das proteínas. Functionalization de grandes vesículas (unilamellar grandes vesículas, LUV, até 1 µm de diâmetro) por esta abordagem é mais desafiador, como vesícula tamanho fica reduzido após a remoção do detergente, e não é possível para vesículas unilamellar gigante (GUV, > 1 µm), como eles são desestabilizado por detergentes (mas veja Johnson et al . 2 para 2D-cristalização lenta das proteínas de membrana em grandes bilayers). Abordagens alternativas para chefe da membrana functionalization3,4,5 existem mas são trabalhoso, demorado e ainda exigem um pouco de detergente em concentrações abaixo de CMC. Mais frágeis ou complexo lipídico modelos (por exemplo, gotículas hidrogel Bilayers6 e tecidos artificial para impressão 3D baseados em BICAMADA de Interface da gota7) não podem tolerar a detergentes. Emergindo rapidamente aplicações de biologia sintética8,9,10 criticamente dependem functionalization de tais estruturas complexas de membrana. Portanto, um método fácil e robusto que permite a entrega rápida e suave das proteínas de membrana para os bilayers frágil alvo é muito procurado no campo.
Uma alternativa, método de entrega de proteína livre de detergente é a fusão de vesículas, onde as membranas das vesículas interagindo unem-se na BICAMADA postfusion intacta, enquanto seu conteúdo aquoso intravesicular meter, sem ser liberado para o externo meio ambiente. Fusão de vesículas é habilitado e conduzido por rearranjos conformacionais dentro agentes fusogenic complementares (algumas proteínas11,12 e peptídeos13 ou especialmente modificado DNA14) localizados na contatar bilayers, ou Coulombic interações entre bilayers do lipid formadas de lipídios catiônicos e aniônicos complementarmente carregado15,16, ou bilayers catiônicos e proteínas carregadas negativamente17.
A primeira abordagem exige a presença de agentes fusogenic nas membranas interagindo antes da fusão, é relativamente lenta (~ 30 min para chegar a metade-máximo de fusão12,18), mas pode ser aplicado a ambos naturais e artificiais membranas.
Uma vantagem da abordagem usando fusogenic lipídios (Figura 1) é que ele permite que muito mais rápida fusão de membrana (~ 1 min para chegar a metade-máximo e 5-10 min para terminar a reação). Além disso, o ponto de fusão pode ser controlado por i) fácil de formular o conteúdo relativo de lipídios carregados em bilayers fusogenic e ii) iônico e, em geral, osmótica força do meio de reação (sais em acima de 50 mM e, por exemplo, sacarose15 são mostrados para impedir fusão), ou uma combinação de ambos. Para iniciar a fusão, vesículas fusogenic opostas carregadas são misturadas em um meio de força iônica baixa (tipicamente sal 10-20mm) por 5-10 min. Uma desvantagem relativa do método é que lipídios catiônicos podem exercer um efeito negativo sobre a funcionalidade das proteínas de membrana em proteoliposomes catiônica antes da fusão, especialmente em baixa força iônica, mas este efeito é reversível e mitigados por um natural composição lipídica da membrana pós-fusão e seu retorno ao meio de força iônica normal.

<table><tbody><tr><td>Lipídio neutro DOPC</td><td>Avanti Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA lipídio aniônico</td><td>Avanti Lipids</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PC lipídio catiônico Avanti</td><td>Lipids</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Colesteril-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Tipo 400-DL</td><td>Sigma</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>Sigma</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>Sigma</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase</td><td>Sigma / Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de extrusão</td><td>Avanti Extrusora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminômetro de tubo único, modelo Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de policarbonato, D19 mm</td><td>Sigma, membranas Whatman NucleporeTrack-Etched</td><td>WHA800309, WHA800284</td><td>100 ou 200 nm para formar SUV e 400 ou 800 nm para LUV</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</strong</td></tr><tr><td>>Buffers usados no papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4, 0,1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer C</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4</td></tr><tr><td>Tampão D</td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7,4 Várias concentrações de KCl</td></tr></tbody></table>

livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos bilayers usando fusogenic proteoliposomes complementares carregada.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergentes são indispensáveis para a entrega das proteínas de membrana em vesículas de pequenas unilamellar 30-100 nm, enquanto bilayers do lipid modelo maiores, mais complexos, são menos compatíveis com detergentes.
Aqui nós descrevemos uma estratégia para contornar esta limitação fundamental usando fusogenic opostas cobrado lipossomas tendo uma proteína de membrana de interesse. Fusão entre tais vesículas ocorre dentro de 5 min em um buffer de baixa força iônica. Lipossomas de fusogenic positivamente carregado podem ser usados como vetores de transporte simples para entrega livre de detergente de proteínas de membrana em biomimetic bilayers lipídica de alvo, que são carregadas negativamente. Também mostramos como reconstituir as proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes com um protocolo rápido 30 min.
Combinando essas duas abordagens, demonstramos uma montagem rápida de uma cadeia de transporte de elétrons, que consiste de duas proteínas de membrana de e. coli, um próton primário bomba bo3-oxidase e F1Fo ATP sintase, nas membranas celulares das vesículas de vários tamanhos, variando de 0,1 a > 10 mícrons, bem como a produção de ATP por essa cadeia.

O uso de fusogenic complementares-carregado proteoliposomes para entrega rápido detergente livre de proteínas de membrana em membranas de BICAMADA alvo inclui três etapas (Figura 1): Aformação de fusogenic SUV de misturas de lipídios com alta conteúdo de lipídeos carregados; Estes SUV opcionalmente pode transportar uma carga intravesicular; B, conversão de fusogenic SUV em PL usando nossa reconstituição de proteína de membrana rápido; C, fusão de fusogenic PL com bilayers do alvo em um meio de baixo teor de sal, seguido pela adição de sal elevado para parar a reação de fusão. No caso de grandes vesículas (D), uma estratégia preferível é entregue a proteína de membrana na BICAMADA alvo aniônico, que fornece um melhor ambiente de lipídios para atividade de proteínas de membrana (mais discutidas no texto).
O chefe protocolo de formação com método de emulsão invertida é realçado em detalhe na Figura 2. Nós preferimos usar hexadecano na mistura lipídica-óleo devido à sua relativamente alta temperatura de congelamento (18 ° C), que permite a fácil remoção do óleo solidificado depois chefe de granulação.
A Figura 3 demonstra a fusão de vesículas, usando o método de cobalto-calceína-EDTA. Fusão é visto apenas quando vesículas carregadas complementares são usadas nos buffers de sal baixos, enquanto altas concentrações de sal (&gt; 50 mM14) ou o uso de vesículas fusogenic não demonstram nenhuma fusão.
Este protocolo rápido de reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic SUV é ilustrado na Figura 4A. Usando este protocolo, demonstramos rápido reconstituição de próton primário bomba bo3-oxidase e F1Fo ATP sintase em PL e avaliação da sua actividade específica nestas membranas. É importante mencionar que o rendimento da reconstituição de proteína não depende do custo de um lipídio usado15 e é cerca de 50-75%25,12, e que, após reconstituição em PL, a proteína pode ser armazenada pelo menos três dias, mesmo à temperatura ambiente sem óbvia perda de atividade da proteína. Este procedimento também fornece orientação unidirecional da ATP sintase, onde mais de 95% dos tem seu grupo hidrofílico F1 orientado para o exterior15,26.
A Figura 5 demonstra que o próton bombeamento atividade de F1Fó (painel A) e bo3-oxidase (painel B) em lipídios catiônicos é reduzida e sensíveis à baixa força iônica, em comparação com o ambiente de lipídios aniônicos e neutra, mas Este efeito é atenuado em membranas de postfusion após a fusão PL+ com aniônico LUV–.
A Figura 6 demonstra a entrega de F1Fo ATP sintase em membranas das vesículas grandes. No presente experimento, PL+ e 800 nm LUV– foram fundidos em 20 mM KCl por 5 min e o produto da reação foi peletizado para remover não fundida PL+, resuspended e analisada para bombear protões. Experimentos de controle não mostrou nenhum bombeamento de prótons quando LUV0 em vez de LUV– foram usados na reação de fusão (traço preto), ou vazio LUV– sozinho foram analisado (traço azul).
Montagem rápida de uma funcionamento cadeia de transporte electrónico, nas membranas das vesículas grandes por meio de fusogenic PL é mostrada na Figura 7. Nós usamos F1Fo SUV+ e bo3 SUV+ para fusão com 800 nm LUV-e demonstrada a produção de ATP por essa cadeia em vesículas postfusion adicionando sequencialmente coenzima Q1 e TDT para energizar membranas e então a adição de fosfato para desencadear a síntese de ATP por F1Fó.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg"> Figura 1: concepção de entrega livre de detergente ultra rápida de proteínas de membrana em bilayers do lipid alvo através da fusão de vesículas unilamellar formada de lipídios carregados complementares. (A) formação de fusogenic catiônica e aniônica unilamellar pequenas vesículas (+de SUV, SUV–), opcionalmente, carregados com cargas intravesicular. (B) conversão de SUV de fusogenic em fusogenic proteoliposomes (PL) por reconstituição das proteínas de membrana. (C) detergente livre entrega de proteínas de membrana em membranas postfusion com estratégia preferível de fusogenic PL. (D) para a entrega das proteínas de membrana em membranas das vesículas grandes, ilustradas pela fusão entre 100 nm PL+ e 800 nm LUV–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg"> Figura 2: chefe protocolo de formação com um método de emulsão invertida. (A) formação de uma monocamada de lipídios na fronteira entre a mistura de óleo-lipídios e água. (B) formação de uma emulsão (água em óleo) invertida. (C), chefe de formação, passando a emulsão através da fronteira da óleo-água por meio de centrifugação. (D) resfriamento do tubo abaixo &lt; 18 ° C, para solidificar e remover o óleo. Imagem de microscopia fluorescente (E), A de um chefe que contém lipídios fluorescente (1% peso fração colesterol-Bodipy-FL12) em sua membrana (verde) e um fluoróforo polar (1mm sulforhodamina 101) no lúmen da vesícula (vermelho). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg"> Figura 3: fusão de vesículas lipídicas estudou com o método de cobalto-calceína-EDTA. (A) diagrama esquemático do método, onde livre calceína é liberada de um complexo não-fluorescente cobalto-calceína pelo EDTA. (B) fusão de SUV em diferentes concentrações de KCl. (C) lançamento da calceína intravesicular pela adição de EDTA e Triton X-100 detergente para vesículas postfusion mostrado em B , conforme descrito no texto. A extensão de fusão (%) para rastreamento de vermelho é calculada dividindo-se o sinal de máxima fusão fundo-corrigido (1 - 2) pelo sinal máximo fundo-corrigido após o lançamento de calceína encapsulado (3-2) e multiplicando por 100. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg"> Figura 4: Ultrafast reconstituição de bo3-oxidase e F1Fó em fusogenic proteoliposomes e medidas de atividade da proteína em tais proteoliposomes. (A) esquema do protocolo de reconstituição. (B), coenzima Q1 oxidação conduzida bombeamento de prótons pelo bo3-oxidase no PL medido com ACMA têmpera (explicado no texto). (C) ATP orientada por hidrólise próton bombeamento por F1Fó em PL medido com ACMA têmpera (explicado no texto). (D) ATP hidrólise por F1Fó no PL medido com sistema de regeneração de ATP (explicado no texto) e sua estimulação pelo desacoplador. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg"> Figura 5: influência do ambiente de lipídios e da força iônica na atividade de proteínas de membrana. Próton de bombeamento por F1Fo (A) e bo3-oxidase (B) em PL catiônica (traço vermelho), PL aniônico (traço azul), PL neutro (traço preto) e PL catiônica fundido com aniônico LUV (traço verde) em 20 e 100 mM KCl. controle rastreamento ( cinza) não mostra nenhuma mudança no próton bombeamento por F1Fó PL– após mistura com SUV–. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg"> Figura 6: Entrega de F1Fo ATP sintase em membranas de 800 nm LUV– , através da fusão com o PL+. (A) diagrama esquemático do experimento: PL+ e 800 nm LUV– foram fundidos em 1mm MOPS (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl por 5 min, peletizado para remover não fundida PL e resuspended a mesma reserva. (B) prótons de bombeamento pelo postfusion LUV (traço vermelho). Experimentos de controle não mostrou nenhum ACMA têmpera quando PL0 foram misturadas com LUV– (traço preto), ou vazio LUV– sozinho foram analisado (traço azul). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg"> Figura 7: montagem sem detergente de 5 min de uma cadeia de transporte electrónico, nas membranas de 800 nm LUV– , através da fusão com o PL+. (A) diagrama esquemático da experiência: 100 nm F1Fo PL+ e 100 nm bo3-oxidase PL+ foram fundidos com LUV-, conforme descrito na Figura 6. Fusão foi interrompida pela adição de KCl e MOPS para 100 e 50 mM, respectivamente. As membranas foram misturadas com ADP-luciferina-luciferase cocktail e fortalecidas por adição de TDT e Q1, conforme descrito no texto. Produção de ATP foi iniciada pela adição de fosfato de 1 mM (Peu) e monitorado em tempo real com sistema de luciferase-luciferina, conforme descrito no texto. (B) ATP síntese por vesículas postfusion (traço vermelho). Experimentos de controle mostrados sem produção de ATP quando PL+ foram misturadas com LUV– em alta sal (cinza), ou PL0 foram misturadas com LUV– (preto). Taxa de síntese de ATP foi calculada conforme explicado no texto (etapas 8.8-8,9). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

O objetivo geral do nosso procedimento fácil de implementar é demonstrar a entrega rápida e sem detergente de proteínas de membrana em bicamadas lipídicas de vários tamanhos usando a fusão entre bicamadas lipídicas formadas por lipídios de carga oposta. Nossa metodologia pode ser usada em bioquímica e biofísica para montagem em uma etapa de sistemas de bicamada lipídica multicomponente métrica de bicamada de bicamada de bicamada de camada a partir de componentes individuais de camada. É importante mencionar que a vantagem de nossa abordagem está nessa funcionalização rápida, ou seja, na bilase lipídica modelo complexa, com proteínas, lipídios e outras moléculas de interesse.Essa metodologia também pode ser usada para estudar processos de transporte de membrana que requerem energização da membrana lipídica. Por exemplo, bombas primárias podem ser usadas para acionar o transporte secundário habilitado por outras proteínas de membrana. Nosso método também pode servir em necessidades de biologia sintética.Por exemplo, para criar vesículas de membrana com várias funcionalidades do programa. No futuro, prender pequenas vesículas como essas dentro de outras maiores semelhantes, talvez seja um passo em direção à construção de uma célula artificial. Para formar a solução lipídica e oleosa, misture o caldo de clorofórmio com um mililitro de hexadecano em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, para evaporar o clorofórmio, misture e aqueça constantemente a mistura em um agitador horizontal a 80 graus Celsius por 30 minutos, deixando o tubo aberto. Após a evaporação, feche o tubo e esfrie até a temperatura ambiente. Em seguida, para formar a monocamada lipídica, na interface do tampão aquoso lipídico em óleo, pegue um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e transfira 200 microlitros de lipídio em solução oleosa em cima de 0,5 mililitros de tampão B. Em seguida, aguarde 30-60 minutos em temperatura ambiente para que a borda de separação de fases se achate, indicando a formação da monocamada lipídica.A forma convexa da borda de separação de fases é devido à incompatibilidade de tensão superficial entre o óleo e o tampão aquoso. Em seguida, para preparar a emulsão de água e óleo, misture uma solução de polissacarídeo não iônico no tampão B com uma densidade superior à da água. Em seguida, transfira 0,5 microlitros da mistura para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, contendo 100 microlitros de lipídios em solução de óleo.Em seguida, sonicar a mistura a 44 kilohertz e 14 watts durante 30 segundos em banho-maria ultrassónico. Após a sonicação, vórtice vigorosamente por 45 minutos para formar a água em emulsão de óleo. Em seguida, para converter a água em emulsão de óleo em GUV aniônico, transfira cuidadosamente a emulsão sobre a interface aquosa de lipídios e óleo.Na emulsão, cada gota é revestida com monocamada lipídica. O vórtice de distribuição adequado da água em emulsão de óleo determina o sucesso da formação de GUV. Se não for formada corretamente, a gota de emulsão coalescerá por sua vez, reduzindo o rendimento da formação de GUV.Para obter o pellet GUV, centrifugue rapidamente a amostra a 1000 vezes G por dois minutos. Coloque um fio de metal dobrado no tubo para que fique dentro do óleo. Em seguida, deixe o tubo no gelo para solidificar a mistura de lipídios e óleo.Remova cuidadosamente o óleo congelado e colete a fase aquosa. Em seguida, ressuspenda o pellet GUV em 50 microlitros de tampão B fresco e transfira para um novo tubo. Inspecione o GUV sob uma objetiva de imersão em óleo de 100 X de um microscópio fluorescente.Use resina de filtração em gel para preparar uma coluna de fluxo por gravidade e equivaler com o tampão A mantido em temperatura ambiente. Em seguida, diluir a proteína de membrana purificada até uma concentração final de 0,7 miligramas por mililitro usando o tampão de extração. Em seguida, misture a proteína com SUV catiônico pré-formado na proporção de um para 30, juntamente com a colagem contendo o tampão A até um volume final de 660 microlitros.Em seguida, coloque o sample tubo em um balancim e agite suavemente a mistura por 15 minutos. Em seguida, passar a mistura através da resina de filtração em gel e recolher as fracções turvas dos proteolipossomas e centrifugar a 4 000 vezes G durante 15 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante de proteína não reconstituído e dissolva o pellet em um mililitro de tampão fresco A.In uma cubeta fluorômetro, adicione 20 microlitros de proteolipossomo com B03 oxidase junto com dois mililitros de tampão A na presença de ACMA de 0,5 micromolar e aguarde o sinal estável a 430 nanômetros de excitação e 515 nanômetros de emissão.Em seguida, adicione 40 micromolares de coenzima Q1 à cubeta. Em seguida, adicione dois DTT milimolares ao proteolipossomo para iniciar o bombeamento de prótons e, em seguida, dissipe o pH delta formado. Em uma cubeta separada, adicione 40 microlitros de proteolipossomas com F1-F0 a 2 mililitros de tampão A na presença de ACMA 0,5 micromolar e acione o bombeamento de prótons adicionando 0,2 milimolar ATP ao proteolipossomo e, em seguida, dissipe o delta de pH formado.Funda 50 microlitros de PL+ com 50 microlitros de 800 nanômetros LUV-em um mililitro de tampão D, suplementado com um milimolar de cloreto de magnésio e 20 milimolares de cloreto de potássio por cinco minutos. Em seguida, centrifugue a amostra a 6.000 vezes G por cinco minutos para granular o LUV pós-fusão. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante constituído por PL+ não reagido e, em seguida, ressuspender o sedimento formado num mililitro de tampão D, suplementado com um milimolar de cloreto de magnésio e 100 milimolares de cloreto de potássio.Novamente, conduza o ensaio de têmpera ACM. Primeiro, misture três microlitros de B03 oxidase PL+ e cinco microlitros de F1F0 PL+, em seguida, funda a mistura com três microlitros de LUV-ou GUV-em 800 microlitros no Tampão D, suplementado com 20 milimolares de cloreto de potássio e um milimolar de cloreto de magnésio por cinco minutos. Em seguida, adicione cloreto de potássio e tampão de esfregão à mistura de membrana fundida a uma concentração final de 150 milimolares.Misture 400 ADP micromolar, 50 luciferina micromolar e 2,5 de luciferase em 200 microlitros de tampão A para preparar um coquetel de ADP de luciferina luciferase. Em seguida, adicione o coquetel à mistura de membrana fundida. Para a medição correta da síntese de ADP, é importante ter um sinal de luciferase estável para evitar falsos positivos, antes da adição de Q1 e TDT.Em seguida, adicione 40 coenzima Q1 oxidada micromolar e, em seguida, adicione dois DTT milimolares para iniciar a energização da membrana fundida. Após um minuto, adicione uma solução de fosfato de potássio de cinco milimolares às vesículas energizadas para iniciar a síntese de ATP. Para inspecionar o GUV ressuspenso na remoção do hexadecano congelado da mistura lipídica e oleosa, foi utilizada microscopia fluorescente.Imagens do GUV obtidas mostram a presença do colesterol fluorescente biopoty FL12 em sua membrana, e da auto-erodimina 101, um fluoróforo polar no lúmen. Para quantificar a fusão do SUV no aumento da concentração de cloreto de potássio, um gráfico foi plotado. O gráfico explica que, com o aumento da concentração de cloreto de potássio além de 50 milimolares, a fusão das vesículas lipídicas SUV começa a diminuir.No entanto, em baixa concentração de cloreto de potássio, entre um a 20 milimolares, as vesículas carregadas complementares se fundem. Em seguida, para medir a oxidação do motor de bombeamento de prótons meditado pela BO3 oxidase do substrato da coenzima Q1, um gráfico foi plotado com base no ACMA Quenching Assay. Os resultados mostram que a adição de um desacoplador aumenta o sinal de fluorescência ACMA representado ao longo do eixo Y do gráfico.Em seguida, o bombeamento de prótons dependente da hidrólise de ATP por F1F0 também foi medido com base no ACMA Quenching Assay. No gráfico, mostra que a adição de um desacoplador aumenta o sinal de fluorescência AMCA. Além disso, o sistema de luciferase de luciferina foi usado para monitorar a síntese de ATP em vesículas fundidas.A adição sequencial de coenzima Q1 DTT, seguida pela adição de fosfato, mostra a produção bem-sucedida de ATP pelas vesículas fundidas. Uma vez dominada, a primeira técnica de formação de proteolipossomas fusogênicos a partir de detergentes simbolizados por proteínas de membrana e miomédicos de união pode ser feita em apenas 30 minutos. A segunda técnica, a fusão física, pode ser feita ainda mais rápido em apenas dez minutos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como se pode construir sistemas de membrana multicomponentes combinando vários blocos de construção individuais que são apresentados por vesículas lipídicas funcionalizadas. Esperamos tais sistemas modulares onde as principais propriedades e funções que são impossíveis com uma reconstituição de proteínas de membrana em uma etapa. Em geral, nossos procedimentos fornecem uma estrutura simples para a construção de sistemas bioquímicos compartimentados complexos, a partir de biotijolos mais simples, os chamados biotijolos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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