Name: Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio ratiométrica em neurônios HSN de Caenorhabditis elegans em movimento. Este método permite correlacionar atividade neural com comportamento em tempo real.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do NINDS para KMC (R01 NS086932). LMN foi apoiado por uma bolsa do programa de NIGMS IMSD (R25 GM076419). Estirpes utilizadas neste estudo c. elegans centro de genética, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Agradecemos a James Baker e Mason Klein para debates úteis.

1. cepas, cultura, mídia e montagem de animais
<ol><li>C. elegans worms a 20 ° C em padrão-60mm nematódeo crescimento médio (NGM) placas de ágar inoculadas com OP50 Escherichia coli alimentar bacteriana19de crescer.</li>
	<li>Prepare dois plasmídeos para cada promotor celular específico de interesse: um, dirigindo a expressão de GCaMP5 de registro intracelular Ca2 +e no segundo, dirigindo a expressão de mCherry para permitir a quantificação de ratiometric de GCaMP5 mudanças de fluorescência e simplifica a medição e a descoberta do objeto. Nota: GCaMP5:mCherry ratiometric imagem corrige para flutuações na fluorescência GCaMP5 que resultam em mudanças no movimento de foco e animal, não reais mudanças no intracelular Ca2 +.</li>
	<li>Injetar GCaMP5 - e mCherry-expressando plasmídeos juntamente com o plasmídeo de marcador de resgate visível pL15EK as gônadas de LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X animais mutantes e recuperar não-vum lin-15(+) animais expressando GCaMP5 e mCherry de um transgene alta-cópia20,21,22. Use o fundo mutante lite-1 para reduzir o comportamento de evitação de luz azul23,24.</li>
	<li>Integre os transgenes de cromossomos para reduzir mosaicismo e simplificar a geração de cepas mutantes composto25. Nota: A tensão de LX2004 descrita aqui carrega um transgene integrado de alta-cópia que expressa a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 (ver Tabela de materiais)26,27, 28 , 29. o promotor de PNL-3 foi encontrado a expressão forte de carro nos HSNs de tarde L4 e animais adultos sem causar defeitos significativos no desenvolvimento de HSN ou comportamento de oviposição em comparação com outros promotores testado (e.g.,tph-1, EGL-6e unc-86). Esta estirpe e outros que expressam a GCaMP5 e mCherry no cabo ventral (VC) neurônios, músculos vulvares e células neuroendócrinas uv1 estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis e detalhes de sua construção foram descritas 27.</li>
	<li>Aplicar OP50 escolher alimentar bacteriana de uma placa de ágar NGM semeada no fundo de um verme de platina e usá-lo para transferir ~ 20 animais L4 LX2004 tarde que expressam a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 . Certifique-se que a vulva em desenvolvimento aparece em um estereomicroscópio como uma mancha clara escura rodeada por uma lua crescente branca. Incube os animais a 20 ° C por 24-40 h.</li>
	<li>Após a incubação, aplicar OP50 para a escolha e transferência ~ 3 dos vermes para uma placa NGM não-semeada, deixando uma pequena quantidade de comida por trás para os vermes que alimentam-se durante a imagem latente. Certifique-se de alimentos suficientes, como também pouca comida bacteriana incentivará os vermes a vaguear longe do centro da placa, enquanto muita comida aumentará a fluorescência de fundo e causar hipóxia.</li>
	<li>Use uma espátula plana arredondada para cortar um ~ 20 mm x 20 mm bolão da placa carregando os vermes e transferir o bloco para baixo para o centro de uma lamela limpa 24 x 60 mm #1.5 (Figura 1). Inicie a aplicação de um lado para evitar bolhas sendo presa sob a lamela e interferentes com imagem latente. Uma lamela 22 x 22 mm #1 para o topo do parte para reduzir a degola e evaporação.</li>
</ol>2. hardware e instalação de instrumentação
<ol><li>Coloque o encenado, vermes transgênicos para o palco de um microscópio invertido com um ≥ 0,7 numérica abertura plano-Apochromat 20 x estágio objetivo, motorizado de XY controlável com um joystick, um divisor de imagem e fluorescência filtros para GCaMP5 simultânea e mCherry de excitação e emissão, câmeras de infravermelho e fluorescência brightfield de imagem e um sistema de iluminação triggerable do diodo emissor de luz (LED)(Figura 2). Nota: Um divisor de feixe de 80/20 envia 80% do sinal de imagem da câmera de fluorescência e 20% para a câmara de brightfield. Um microscópio vertical também pode ser usado, mas o pedaço NGM deve ser colocado entre uma lâmina de vidro e a lamela grande neste caso.<ol>
<li>Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem latente. Quando um animal é selecionado, deslize o filtro infravermelho no lugar acima do condensador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lógica do transistor-transistor (TTL) desencadeia<ol>
<li>Conecte cabos coaxiais de cada uma as três linhas de saída do TTL gatilho da câmera de fluorescência. Conecte a primeira saída à entrada BNC #3 do sistema de iluminação LED.</li>
		<li>Conecte a saída segunda a um adaptador de BNC 'banana' com verde e marrons fios do conector 8 pinos GPIO GPIO correndo entrada #3 (pino 4) e terra (pino 5) da câmera infravermelha, respectivamente.</li>
		<li>Conecte a saída de terceira para um adaptador de 'banana' BNC com fios de jumper, correndo para a entrada digital #8 e terra no dispositivo de aquisição digital (Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispositivo de aquisição digital (DAQ)<ol>
<li>Conecte a placa do microcontrolador DAQ (ver Tabela de materiais) para o PC através de um cabo USB. Atualize o firmware com o padrão Firmata protocolo (consulte Tabela de materiais) e configurar a porta USB para se comunicar em baud 57600.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diodos emissores de luz<ol>
<li>Executar o software de controlador de LED (veja a Tabela de materiais). Alterne para o modo de gatilho de 'Continuous' para 'Gated' e selecione canal gatilho 3' para ambos os LEDs 470 e 590 nm.</li>
		<li>Ligue e digite LED de potência de cada LED (por exemplo, conjunto a 470 nm LED para 20% e a 590 nm LED 40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o script 'XY-fase-final' em Bonsai (ver Tabela de materiais) de comunicação serial-palco30. Clique no nó cinzento 'CsvWriter' e selecione uma pasta para salvar o gravado X e Y palco informações (Figura 3). Pressione a seta verde da barra de ferramentas para inicializar o DAQ. Nota: O script começa a gravação a posição X e Y do palco, quando a câmara de fluorescência envia um sinal TTL. Este script produz quatro colunas de dados: frame número, X posição (µm), posição Y (µm) e o intervalo entre quadros (s).</li>
	<li>A câmera infravermelha, software de gravação (ver Tabela de materiais) em 'Modos de vídeo personalizado', selecione "Modo 1" (binning 2x2; 1.024 x 1.024 pixels), e "Pixel formato Raw 8". Sob ' gatilho / Strobe', defina a linha de entrada de gatilho (GPIO) "3", a polaridade de "Alta", o 'modo' para "14". Alternar 'Habilitar' parar aquisição de quadro até um sinal de gatilho TTL é recebido.<ol>
<li>Deixando a janela aberta, clique no botão "Record" vermelho na barra de ferramentas modo de exibição de câmera principal. Selecione a pasta para sequências de imagem ser salvo. Selecione o modo de gravação de 'Tampão' e 'Imagens' de salvar em formato JPEG. Clique em "Iniciar gravação" para inicializar a aquisição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Câmera e imagem divisor de fluorescência Nota: Os canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry devem ser recolhidos simultaneamente para garantir o registro de imagem apropriada para quantificação de ratiometric. Um divisor de imagem permite a aquisição de dois canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry em um sensor.<ol>
<li>Na aba 'Captura' do software de aquisição de imagem tempo de exposição definido (ver Tabela de materiais), a 10 ms, binning 4x, e profundidade de imagem de 16 bits. Selecione um subarray câmera centrada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura. Clique em 'Mostrar opções de gatilho de saída' e definir todos os gatilhos para 'Positivo'. Nota: O DAQ ocasionalmente pode perder TTL disparadores se eles são 10 ms ou menos.</li>
		<li>Certifique-se de que 'Gatilho 1' e 'Gatilho 2' estão definido como 'Exposição' enquanto 'Gatilho 3' é definida como 'Programável' com um 'período' de 25 MS. sob a aba 'Sequência', selecione 'Time Lapse' com um 'campo Delay1' de 50 ms para coletar imagens em 20 Hz. Select 'Salve Buffer temporário.'</li>
	</ol>
</li>
	<li>PGTO ganhar e intensidade de laser durante a imagem latente confocal canal três<ol>
<li>Defina o ganho de PGTO para a fluorescência de fundo está em um nível acima do mínimo (nível de preto). Aumente a potência de laser (verde) de nm 561 até um único saturado em 12 bits ou 16 bits de pixel é observado no terminal pré-sináptica no canal mCherry.</li>
		<li>Ajuste a intensidade de laser (azul) 488 nm para que GCaMP5 fluorescência é apenas visível no terminal pré-sináptica acima do fundo. Essa configuração baixa impede a saturação dos pixels GCaMP5 quando a fluorescência aumenta em resposta a transientes de Ca2 + fortes. Abra o pinhole confocal todo o caminho para maximizar a captura de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ratiometric Ca2 + imagens e gravação de comportamento
<ol><li>Na guia 'Sequência' do software de aquisição de fluorescência, clique em "Start" para começar a gravação. Rastrear o verme com o joystick, mantendo a célula (s) e sinapses de interesse em foco e no centro do campo de visão (FOV). Clique no botão 'Stats' na janela de histograma para mostrar estatísticas de pixel de cada canal.</li>
	<li>Ajuste a potência do LED para garantir uma fluorescência máxima mCherry de single-pixel no terminal pré-sináptica de ≥ 8.000 contagens (~ 4.000 photoelectrons), dando um ~ 12 bits intervalo dinâmico acima de fundo (~ 100 photoelectrons). Sinais de GCaMP5 no terminal pré-sináptica durante o descanso (baixo) Ca2 + deve ser em torno de ~ 2.500 conta - apenas visível acima do fundo.</li>
	<li>Gravar até atingir uma postura estado ativo; Geralmente, isso ocorre a cada 20-30 min em um verme selvagem-tipo7. Salve um subconjunto de 10 min (12.001 frames), 6.000 quadros antes e após o primeiro evento de postura (quadro 6.001). Certifique-se de manter o mesmo subconjunto de brightfield imagens de worm comportamento e momentos de posição XY, ou a perfeita sincronização de fluxos de dados serão perdida.</li>
	<li>Usar o ImageJ e o plugin BioFormats (consulte a Tabela de materiais) para converter sequências de imagem para o formato de imagem padrão Cytometry (ICS) assim pode ser importado para o software de quantificação de Ratiometric.</li>
</ol>4. segmentação e análise quantitativa de imagem
<ol><li>Importar sequências de imagem para o software de quantificação de Ratiometric (ver Tabela de materiais). Clique em 'Auto contraste' no menu 'Ferramentas' e ajuste o contraste de cada canal para estabelecer adequado preto (~ 1.800) e branco níveis (10.000). Selecione 'Alterar cores...' no menu ' ferramentas ' para confirmar que mCherry e atribuições de cor GCaMP5 canal estão corretas (Figura 4A - C).<ol>
<li>Clique com o botão direito sobre a série de tempo na aba 'Sequência' e configurá-lo para 20 frames/s e 1,25 µm/pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione 'Ratio' no menu 'Ferramentas' e selecione "GCaMP5" para 'Canal' e "mCherry" para 'Canal B'. Clique em "Calcular" ao lado de 'Limite' para subtrair o fundo de cada sequência de imagens. Selecione "Aplicar um arco-íris LUT para o canal de relação". Nota: Para uma gravação com uma relação de base média de 0,3 (baixa Ca2 +) e uma proporção máxima de 2-3 (alta Ca2 +), uma tabela de pesquisa adequado seria de 0 (azul) 1 (vermelho).</li>
	<li>Gere um canal de intensidade modulada proporção usando o canal de mCherry (Figura 4-D). O canal de intensidade modulada Ratio é uma imagem de milhões-de-cores onde a cor da relação é mapeada para o brilho do canal mCherry.</li>
	<li>Na guia 'Medidas', crie um protocolo de pesquisa de objeto, arrastando a ferramenta 'Encontrar objetos usando intensidade' no painel 'Protocolo'. Clique a 'engrenagem' para definir a janela de mCherry valores de intensidade e encontrar objetos.<ol>
<li>Selecione a intensidade valores ≥ 2 desvios padrão (SD) acima do plano de fundo (por exemplo, o limite inferior de ~ 2.500, limite máximo de 65.535). Verifique se o terminus pré-sináptica é detectado e que 'atualizar automaticamente feedback' é selecionada no menu de medições. Nota: O software também pode identificar objetos pelo seu desvio-padrão de fundo usando um protocolo relacionado 'SD intensidade.' No entanto, se um objeto especialmente brilhante entra o FOV, drasticamente muda a intensidade média durante esses momentos, que afectam as cortes de intensidade usados para localizar o HSN. Esta variabilidade não ocorrerá se os valores de intensidade crua são usados para localizar objetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione filtros adicionais visando apenas o canal de mCherry (tamanho, intensidade de Max, etc) se necessário excluir objetos indesejáveis como cabeça, cauda e estripá-fluorescência. Selecione 'Fazer medição Item' no menu de medições e escolha "Todos os momentos." Nota: Isto irá executar o protocolo, escrevendo todas as medições para um arquivo de valores separados por vírgula (. csv) que deve ser exportado usando o comando 'Exportar' no menu arquivo.</li>
	<li>Abra o arquivo exported.csv e copie o Commit, área (µm2), média (relação de canal), centroide X (µm) e dados de centroide Y (µm) em uma nova folha. Exporte arquivo de a.csv sem cabeçalhos de coluna. O software de quantificação de Ratiometric pode classificar uma célula de interesse, como um ou mais objetos por commit.<ol>
<li>Para recombinar esses objetos, use um script personalizado 'AnalzyeGCaMP_2017.m'. Nota: O script também identifica Ca2 + (ratio) picos nos dados e salva o arquivo de a.csv de seus momentos, amplitudes de pico e largura dos picos. Ele também gera arquivos postscript para os traços de proporção de matérias-primas e anotado. Com esta informação, devem ser determinadas a amplitude de Ca2 + transitória e intervalo inter transitório.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione a saída de X e Y valores de centroide de cada objeto de fluorescência para os valores X e Y, gravados pelo script XY-estágio de Bonsai. Use a posição líquida de XY para gerar um rastreamento de locomoção worm e para calcular o deslocamento da célula e velocidade que acompanham o comportamento de diferentes Estados31.</li>
	<li>Importe as imagens gravadas brightfield ImageJ como uma pilha virtual. Anote eventos de postura e outros comportamentos. Compare o calendário destes eventos de Ca2 + picos do rastreamento de relação.</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.

Transgenes:
Porque mCherry expressão foi melhorada através da inserção de códon-otimização e intrão (e mais disponível GCaMP repórteres não têm), injetar ~ 4 x a quantidade de GCaMP5-expressando de shRNA para assegurar níveis comparáveis de fluorescência GCaMP5 durante forte Ca 2 + transientes. Resgate da mutação lin-15(n765ts) permite a recuperação fácil dos animais transgénicos com efeitos mínimos na postura e outros comportamentos35. Transgenes deve ser integrado para garantir condições entre diferentes animais25de imagem e expressão uniforme. Marcadores selecionáveis, incluindo a resistência aos antibióticos36,37 e resgate de armas letais sensíveis à temperatura38 também devem funcionar, mas, porque os animais não-transgênicos são mortos, confirmação da integração do transgene e homozigotia é mais difícil comparado com marcadores que apresentam um fenótipo visível de25. Marcadores dominantes que perturbam o normal locomoção e diminuem a aptidão, tais como rol-6(dm), devem ser evitada39. Imagem latente na lite-1 fundo mutante é essencial para reduzir a fuga de luz azul respostas durante a imagem23,40,41. Mutação adicional de gur-3, que atua paralelamente à lite-1, pode minimizar ainda mais comportamento residual e alterações fisiológicas causadas pela luz azul42. Convenientemente, gur-3, 1-litee lin-15 estão todos situados na metade direita do cromossomo X, que deve simplificar a construção de novas estirpes de Ca2 + imagens e experiências optogenetic.
Porque os tempos de exposição são curtos e imagens são coletadas em 20 Hz, sinais GCaMP5 e mCherry devem ser brilhantes. A explicação mais provável para barulhento Ca2 + gravações é fluorescência fraca causada pela expressão repórter fraco. Os promotores também devem ser razoavelmente específicos para a região a ser fotografada. Porque o corpo celular HSN e sinapses para os músculos vulvares são no centro do corpo, expressão adicional do promotor de PNL-3 na cabeça e cauda é tipicamente fora do campo de visão e podem ser excluído usando filtros adicionais na Software de quantificação de Ratiometric. Para garantir que observado alterações no resultado de fluorescência GCaMP5 de mudanças reais no intracelular Ca2 +, controle transgenes expressando GFP em vez de GCaMP5 devem ser preparadas de forma independente e analisados26. Mais recente Ca2 + repórteres com diferentes Ca2 + sensibilidades, cinética, cores e expandiram a escolha das ferramentas disponíveis de imagem, mas cada novo repórter deve ser validado usando o Ca2 +-variante fluorescente insensível14 ,16.
Mídia:
Placas NGM para a imagem latente devem ser preparadas com ágar de alta qualidade. Ágar de qualidade inferior não irá dissolver completamente após a autoclavagem, deixando pequenas partículas essa dispersão de luz durante a imagem latente e aumento da fluorescência, plano de fundo. Biologia molecular agarose de grau pode ser usado em vez disso, mas a quantidade adicionada deve ser reduzida para manter a firmeza de placa equivalente.
Comparações com outros métodos de montagem:
Abordagens anteriores, a atividade de imagem no circuito de comportamento de oviposição utilizaram vermes imobilizadas com cola para uma almofada de agarose. Sob estas condições, atividade de circuito e postura de comportamento não é favorecidas sem redução em meios de cultura osmolaridade8,10,44,45. Recentes sugerem que vários comportamentos de worm são modulados por estado de locomoção, levantando questões sobre a relação da atividade das células observadas em animais imobilizados ao observado em livremente, comportando-se animais. Recentemente mostramos que a atividade de circuito de postura é inesperadamente progressivamente com locomoção26,27. Da mesma forma, compartimentada Ca2 + sinalização no interneurônio RIA integra a atividade de neurônios sensoriais e neurônios cabeça durante movimentos46de forrageamento. Comportamento de defecação é também acompanhado de uma mudança de precisa e estereotipada de locomoção que permite que os animais se afastar de seu lugar de forrageio antes de expelir resíduos47. Juntos, estes resultados sugerem que a breves gravações de atividade de circuito de animais imobilizados podem ser fundamentalmente diferentes dos obtidos em livremente, comportando-se animais.
Apesar de ser directamente por baixo de uma lamela, comportamento do worm é semelhante ao visto em placas padrão de NGM. Ovos descontraídos vai continuar a eclodir, e a pequena quantidade de comida depositada permite que as larvas L1 para se transformar em adultos (dados não mostrados). O tamanho de bloco de ágar grande permite a troca gasosa razoável e resiste a desidratação, embora muita comida aumentará a fluorescência de fundo. Enquanto este método funciona melhor para adultos, a técnica também pode ser usado para animais de L4 de imagem. No entanto, a espessura da camada aquosa entre o bloco e a lamela é tal que larvas menores têm dificuldade rastejando e muitas vezes podem ficar preso na sequência de um adulto em movimento.
Uma limitação dessa técnica de montagem é que a estimulação mecânica ou química direta para regiões precisas do corpo é difícil. Desenvolvimentos recentes em técnicas de iluminação modelado permitem a excitação separada da cabeça ou cauda-expresso opsins microbianas com iluminação separada e detecção de fluorescência GCaMP/mCherry da número48,49. Como resultado, pode ser possível superar este problema usando abordagens optogenetic.
Comparações com outro Ca 2 + Abordagens de imagem:
Este método funciona muito bem para gravar alterações no citoplasmática Ca2 + do único, resolvidas as células e as suas regiões sinápticas. Imagem em tempo real, volumétrica de neurônios na cabeça foi recentemente conseguida usando a posição do núcleo de células para a identificação da célula e para dosar alterações no auxílio de cálcio50,,51,52. A relação entre nuclear e sináptica Ca2 + permanece obscura. Nossos dados sugerem que as mudanças mais visíveis no HSN intracelular Ca2 + ocorrem na termini pré-sináptica longe a soma da célula (Figura 4). A termini pré-sináptica do HSN e os neurônios VC é incorporados os músculos vulvares pós-sináptica26. Não está claro se haveria resolução suficiente na dimensão Z mesmo com girando o disco ou técnicas de folha de luz de atribuem pré-sináptica Ca2 + sinais de células específicas, sem depender de alguma forma somático cálcio para identificação de célula . Usando as técnicas descritas aqui, cada 10 min, dois canais de gravação com 12.001 256x256 pixel 16-bit TIFF imagens é ~ 4 GB. Relação proporção e intensidade modulada canais o dobro do tamanho do arquivo para ~ 8 GB. Um experimento típico de gravação 10 animais de cada um dos dois genótipos (tipo selvagem e experimentais) gera cerca de 150 GB de dados primários e requer 20 h para coletar e analisar. Análises volumétrica com 10 fatias de Z por commit exigiria uma ordem de magnitude mais dados e tempo analítico, explicando por que tão poucos tais estudos foram concluídos.
Ferragem:
Podemos gravar e analisar sequências de imagem com alto desempenho, estações de trabalho dual processador placas de vídeo (por exemplo, jogos), 64 GB de RAM, e drives de estado sólido de alta performance (ver Tabela de materiais). Dados devem ser armazenados na rede matriz redundante de discos independentes (RAID) e backup para a nuvem em um centro de dados off-site.
Recomendamos que usando de alta potência colimado LEDs para a excitação da fluorescência pulsado sobre iodetos metálicos ou fontes de luz à base de mercúrio. Vários sistemas de LED multi cores disponíveis comercialmente estão disponíveis. Enquanto alguns desses sistemas de LED têm um custo inicial mais alto, eles têm uma longa vida (> 20.000 h), podem simultaneamente excitar quatro ou mais diferentes fluorophores e oferecem controle temporal preciso, usando um serial e/ou interface TTL com baixa latência (10-300 µs alternar tempo). Desencadeando garante que a amostra só acende quando na verdade estão sendo recolhidos. Normalmente usamos uma exposição de 10 ms cada 50 ms (20% taxa de serviço). Isso reduz a fototoxicidade e borrão de movimento durante a captura de imagem, como relatado anteriormente,43.
Utilizamos câmeras de sCMOS pela sua velocidade e grande matriz de pixels pequenos, sensíveis. Uma câmera do CCD-EM é uma alternativa mais cara, mas efeitos de 'flor' podem resultar em capturados photoelectrons derramando em pixels adjacentes. Nova sCMOS back-iluminado câmeras têm fotossensibilidade semelhante da EM-CCDs a custo significativamente reduzido. De qualquer maneira que sensor é usado, os canais GCaMP5 e mCherry devem ser obtidos simultaneamente. Captura sequencial em mover vermes vai levar a Mal registradas imagens impróprias para quantificação de ratiometric. Imagem de canal duplo pode ser realizada em uma única câmera após a divisão de canais usando um divisor de imagem (Figura 2) ou usando duas câmeras idênticas. Sobre imagens de 8 bits para quantificação exacta ratiometric, recomenda-se a gama dinâmica das imagens de 16 bits. Para imagens de brightfield do comportamento de worm, capturamos usando uma câmera de 1 pol. 4.1 MP infravermelho USB3 para capturar grandes sequências de imagem de 8 bits 1.024 x 1.024 binned de 2 x 2 após a compressão JPEG. O FOV maior disponível em modelos mais novos do microscópio permite um verme adulto ser visualizado em 20 x depois x 0.63 demagnification com apenas leve vinheta (Figura 4E).
Recomendamos usar os sinais de tensão padrão TTL para sincronizar a iluminação e a captura de quadro. Por latências potenciais em diferentes softwares, recomendamos aos usuários configurar a câmara de fluorescência com saídas de gatilho como mestre com saídas TTL, deixando todos os outros dispositivos. Desta forma, informações de posição brightfield e fase serão coletadas para cada medição de Ca2 + .
Fenda - ou ressonantes microscópios confocal ponto-digitalização, tipicamente encontrados em instalações confocal compartilhadas também dar excelente desempenho durante a ratiometric Ca2 + imagem latente. Tais instrumentos podem ser usados para capturar dois ou mais canais de fluorescência juntamente com brightfield24. Neste caso, o pinhole confocal deve ser aberto para seu diâmetro máximo, e um detector espectral deve ser usado para separar os sinais infravermelhos brightfield, mCherry e GCaMP5. Isso maximiza a luz coleção de uma espessa (~ 20 µm) fatia ao ainda permitir a rejeição da fluorescência fora de foco. Uma desvantagem é o FOV menor e mais restrições para personalização de hardware e software.
Software:
A maioria dos fabricantes do navio e instalar suas câmeras e microscópios com software proprietário, incluindo configuração de desencadeamento de entradas e saídas. Podem variar os recursos e desempenho deste software durante a gravação. Porque, movendo-se rápido vermes pode ser um desafio para rastrear, imagem exibir durante a gravação deve ser suave e estável a 20 Hz. Para melhorar o desempenho, sequências de imagem podem ser temporariamente salva na memória RAM com subconjuntos comportamentalmente relevantes, salvos no final do experimento. Esses arquivos de sequência de dois canais de imagem podem ser convertidos para o formato de imagem Cytometry padrão aberto (ICS) para importar para o software de quantificação de Ratiometric. OME-TIFF é um formato de imagem aberto mais recente, embora diferentes instalações podem ser incapazes de salvar sequências de imagem TIFF maior que 4 GB.
Uma característica fundamental do pipeline de quantificação é a geração do canal de relação e, em seguida, um procedimento de segmentação de imagem imparcial usando mCherry fluorescência para encontrar células de interesse. De cada objeto encontrado, o tamanho do objeto, posição do centroide XY e o mínimo, quer dizer, e calculam-se valores de intensidade de fluorescência máxima para cada canal (incluindo o canal de relação). Juntos, esses valores são usados para dosar alterações intracelulares Ca2 + em cada commit na gravação. Medições de objeto para cada commit são então exportadas como arquivo a.csv para análises subsequentes.
Uma limitação importante do protocolo descrito aqui é a dependência de mover os dados em diferentes formas, através de uma colcha de retalhos de produtos de software. Uma irritação adicional é que algum do software aberto e livre, enquanto os outros estão fechados, caro e desigualmente atualizado. Uma melhoria principal seria usar ou desenvolver uma parte de software (idealmente aberto) que fornece níveis semelhantes de desempenho e facilidade de uso de aquisição para análise. Conforme observado acima, análise ratiometric dobra o tamanho do arquivo e o tempo necessário para realizar um experimento. Geração de condutores de câmera que podem ser integrados em estruturas personalizável pelo usuário como Bonsai permitiria imagens e outros fluxos de dados sejam coletados e analisados em tempo real, melhora significativamente a taxa de transferência.
Perspectivas futuras:
Enquanto nós normalmente rastrear movimentos de worm manualmente, rastreamento de centroide worm detectado em gravações de infravermelho brilhante - ou campo escuro deve permitir para nós que fornecem loop fechado de ajuste da posição de palco e automatizados de processamento de imagem adicional rastreamento (Figura 3 e dados não mostrados). A maioria das gravações de fluorescência obtidos com este método é escuro e desprovida de biologicamente interessantes dados. No sensor ou em tempo real pós-aquisição processamento de imagem técnicas que sequências de imagem para objetos relevantes de culturas permitiria para aumento de resolução espacial e agilizar o pipeline de análise de dados, particularmente se Z-fatias adicionais são coletadas para cada Commit para visualizar a atividade dentro de todas as células pré e pós-sinápticas no circuito.

Um objetivo central da neurociência é compreender como os neurônios se comunicam em circuitos de comportamento animal unidade. Circuitos neurais integram uma gama de diversas pistas sensoriais a fim de mudar atividade do circuito, assim conduzir mudanças comportamentais necessárias para os animais respondem a seus ambientes. O nemátodo do Pinheiro, c. elegans, tem um sistema nervoso simples com 302 neurônios cujas conexões sinápticas têm sido completamente mapeado1. Além disso, os genes que codificam para proteínas envolvidas na neurotransmissão são altamente conservados entre c. elegans e mamíferos2. Apesar da simplicidade anatômica de seu sistema nervoso, ele exibe um repertório complexo de comportamentos conservados, fornecendo uma plataforma fértil para compreender como os neurônios regulam o comportamento3.
C. elegans é passível da aplicação de uma vasta gama de abordagens como a manipulação genética, célula ablação a laser, técnicas eletrofisiológicas, bem como na vivo óptico de imagem de4,5. Estudos recentes produziram mapas detalhados do neurotransmissor importante sinalização sistemas em c. elegans , incluindo o colinérgicos e redes neuronais gabaérgica. Estes estudos, juntamente com estudos em andamento para mapear a expressão dos receptores de proteína G-acoplado todos neuronais Coloque este modelo em uma posição única para alavancar estrutural altamente detalhada e mapas de conectividade neuronal funcional para entender completamente como esses sinal de neurotransmissores diferentes através de receptores diferentes e escalas de tempo diferentes aspectos de unidade de comportamento animal.
A fim de estudar os padrões de actividade neuronal dinâmico em qualquer sistema, um pré-requisito essencial é desenvolver metodologias robustas para registrar a atividade nos neurônios individuais ou circuitos inteiras durante comportamentos. Especialmente importante é a acessibilidade de tais abordagens óticas para visualizar a atividade pré-sináptica que impulsiona a fusão de vesículas sinápticas. Rápido e altamente sensíveis repórteres fluorescentes de intracelular Ca2 +, juntamente com a disponibilidade crescente de fotodetectores sensível, revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica em animais acordados, vivas durante o comportamento. Porque um resultado importante da atividade elétrica sináptica é regular os canais de Ca2 + , mudanças no intracelular Ca2 + são pensadas para fielmente comportamentalmente relevantes alterações no relatório na atividade das células.
Neste estudo, apresentamos uma abordagem para executar ratiometric Ca2 + imagem do HSN motor neurônios serotoninérgicos que promovem o comportamento de oviposição em c. elegans6,7. Esta abordagem baseia-se esforços anteriores para visualizar o Ca2 + atividade em c. elegans e o circuito de postura durante comportamento5,8,9,10,11 . O método permite simultaneamente correlacionar as mudanças observadas na atividade celular/circuito com eventos de postura, bem como alterações no estado de locomoção animal. Embora nós usamos esta abordagem para estudar a atividade em vermes adultos, trabalho não publicado de nosso laboratório mostra que essa abordagem pode ser estendida para animais juvenis na quarta larval (L4) fase também. É provável que a atividade de outros neurônios de c. elegans que funcionam em circuitos distintos e comportamentos deve ser da mesma forma acessível com esta técnica. Outros recentemente desenvolvido rápido Ca2 + indicadores com disjunto espectros de emissão12,13,14,15,16, ferramentas optogenetic17 e geneticamente codificado ópticas indicadores de membrana de tensão18, deverá permitir-nos realizar penetrantes 'all-optical' investigações como alterações na atividade de circuito neural dirige Estados de comportamento distinto.

<table><tbody><tr><td>C. elegans crescimento, cultivo e montagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli cepa bacteriana, OP50</td><td>Centro Genético de Caenorhabditis</td><td>OP50</td><td>Alimento para C. elegans. Uracila auxotrófica. E. coli B. Nível de Biossegurança</td></tr><tr><td>1 HSN GCaMP5+mCherry cepa de verme</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>LX2004</td><td>Transgene integrado usando promotor nlp-3 para conduzir a expressão de GCaMP5 e mCherry em HSN.&nbsp; Genótipo completo:&nbsp; vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X</td></tr><tr><td>lite-1(ce314), lin-15(n765ts) cepa mutante para preparação de transgene</td><td>autor</td><td>LX1832</td><td>Cepa para recuperação de transgenes de alta cópia após microinjeção com pL15EK lin-15(n765ts) plasmídeo de resgate. Também possui a mutação ligada lite-1(ce314) que reduz a sensibilidade à luz azul. Disponível no autor mediante solicitação</td></tr><tr><td>pL15EK lin-15a/b plasmídeo de resgate genômico</td><td>autor</td><td>pL15EK</td><td>Plasmídeo de resgate para recuperação de animais transgênicos após injeção em LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X cepa. Disponível do autor por solicitação</td></tr><tr><td>plasmídeo pKMC299</td><td>autor</td><td>plasmídeo pKMC299</td><td>Plasmídeo para expressão de mCherry nas HSNs do promotor nlp-3. Has nlp-3 3' região não traduzida</td></tr><tr><td>autor do plasmídeo pKMC300</td><td></td> Plasmídeo <td>pKMC300</td><td>para expressão de GCaMP5 nas HSNs do promotor nlp-3. Possui nlp-3 3' região não traduzida</td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td>Para preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Dibásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Para preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio Heptahidratado</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>Para preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio Dihidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>12312</td><td>Para a preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211820</td><td>Para a preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td>Para a preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td>Para a preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>Para a preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-164&nbsp;</td><td>Para preparação de placas NGM</td></tr><tr><td>24 x 60 mm micro vidro de cobertura, #1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>Vidro de cobertura através do qual os vermes são fotografados</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro vidros de cobertura, #1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Vidro de cobertura que cobre a parte superior do pedaço de ágar</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio com base de luz transmitida</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Microscópio de dissecação para manutenção, preparação e montagem de tensão de vermes</td></tr><tr><td>Fio de irídio de platina, (80:20), 0,2 mm</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>Para transferência de sem-fim</td></tr><tr><td><forte>Microscópio de imagem de cálcio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de ar antivibração</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>Micro-g' Mesa de laboratório 30" x 48" mesa antivibração com 4" CleanTop M6 em 25mm superior</td></tr><tr><td>Microscópio composto invertido</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 invertido microscópio</td></tr><tr><td>Sideport L80/R100 (3 posições)</td><td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>Para desviar 20% da saída para a câmera de campo claro (CMOS), 80% para a câmera de fluorescência (sCMOS)</td></tr><tr><td>Suporte de iluminação inclinado para trás</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>Para infravermelho/imagem de comportamento</td></tr><tr><td>Caixa de lâmpada 12V/100W c/ Coletor</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>Para infravermelho/imagem de comportamento</td></tr><tr><td>Lâmpada de halogéneo 12V/ 100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>Para imagens infravermelhas/comportamentais. Os LEDs de luz branca não emitem luz infravermelha significativa, portanto, não permitem imagens de campo claro após o filtro passa-banda infravermelho</td></tr><tr><td>32 mm Filtro passa-banda infravermelho (750-790 nm) para lâmpada halógena</td><td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790; DMR 32mm, para iluminação infravermelha para campo claro e comportamento</td></tr> Torre <tr><td>do condensador de 6 filtros (LD 0,55 H/DIC/Ph), Zeiss motorizado</td><td></td><td>424244-0000-000</td><td>Para infravermelho/imagem de comportamento</td></tr><tr><td>Condensador & Obturador</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>Para imagem infravermelha/comportamental</td></tr><tr><td>Ocular binocular com fototubo para câmera CMOS infravermelha</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>Para imagem infravermelha/comportamental</td></tr><tr><td>Ocular 10x, 23mm</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>Para localização de vermes no pedaço de ágar</td></tr><tr><td>Adaptador C-Mount 2/3" 0.63x demagnificador</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>Montagem para câmera CMOS infravermelha</td></tr><tr><td>Câmera CMOS para campo claro infravermelho e comportamento (sensor de 1")</td><td>FLIR (anteriormente Point Grey Research)</td><td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Câmera para imagem de campo claro</td></tr><tr><td>USB 3.0 Host Controller Card</td><td>FLIR (anteriormente Point Grey Research)</td><td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100, 4 Portas</td></tr><tr><td>8 pinos, Cabo GPIO de 1m, Conector Circular Hirose HR25&nbsp;</td><td>FLIR (anteriormente Point Grey Research)</td>Cabo <td>ACC-01-3000</td><td>para acionamento TTL. O fio verde se conecta ao GPIO3 / Pin 4 e o fio marrom se conecta ao Terra / Pin 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>Melhor combinação de ampliação, abertura numérica e distância de trabalho</td></tr><tr><td>Torre Refletora de 6 cubos, Motorizada</td><td>Zeiss</td><td>424947-0000-000</td><td>Para imagens de fluorescência</td></tr><tr><td>Trem de Luz de Fluorescência, Zeiss Motorizado</td><td></td><td>423607-0000-000</td><td>Para imagens de fluorescência</td></tr><tr><td>Obturador de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>Para imagens de fluorescência</td></tr><tr><td>GFP e mCherry cubo de filtro de excitação dupla e emissão (para microscópio)</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>FL Conjunto de filtros 62 HE BFP+GFP+HcRed para imagem de fluorescência</td></tr><tr><td>Sistema de iluminação LED</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Sistema LED Colibri.2 acionável para iluminação fluorescente</td></tr><tr><td>Módulo LED GFP (470 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>Colibri.2 LED para excitação de fluorescência GFP</td></tr><tr><td>mMódulo LED Cherry (590 nm)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>LED Colibri.2 para excitação de fluorescência mCherry</td></tr><tr><td>Controle deslizante de parada de íris para equipamento de luz incidente</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>Abertura de campo íris para limitar a iluminação LED ao campo de visão</td></tr> <tr><td>da câmeraAdaptador C-Mount 1" 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>Adaptador para divisor de imagem e câmera de fluorescência sCMOS</td></tr><tr><td>Divisor de imagem</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View, outros divisores de imagem podem ser usados, mas podem não ser otimizados para o grande tamanho do sensor das câmeras sCMOS</td></tr><tr><td>Espelho dicróico GFP / mCherry (divisor de imagem)</td> <td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>Dividindo GCaMP5 de mCherry e infravermelho sinais</td></tr><tr><td>Filtro de emissão GFP (divisor de imagem)</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>Capturando fluorescência GCaMP5</td></tr><tr><td>mCherry/filtro de emissão (divisor de imagem)</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>Este filtro é necessário para excluir a luz infravermelha usada para imagem de campo claro</td></tr><tr><td>câmera sCMOS para sensor de fluorescência (1")</td> <td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>Orca FLASH 4.0 V2. Os modelos mais recentes permitem configurações separadas de aquisição de imagem em metades separadas do sensor, permitindo a aquisição de imagens de dois canais em combinação com um divisor de imagem</td></tr><tr><td>Motorizado XY Stage</td><td>M&auml; rzh&auml; usuário</td><td>SCAN IM 130 x 100</td><td>Movimento de palco; a resolução XY deste estágio é 0.2&micro; m por passo&nbsp;</td></tr><tr><td>Controlador de palco XY com joystick</td><td>LUDL</td><td>MAC6000, joystick XY</td><td>Rastreamento manual de vermes. MAC6000 controlador deve ser conectado ao PC através da porta serial (RS-232) configurada para 115200 baud</td></tr><tr><td>Placa de aquisição digital (DAQ)</td><td>Arduino</td><td>Uno</td><td>Recebendo gatilhos TTL da câmera sCMOS. O Uno deve ser carregado com o pacote padrão Firmata, e a porta USB do computador configurada para 57600 baud</td></tr><tr><td>BNC Macho para Cabo BNC Macho - 6 pés</td> Conectores BNC <td>HOBB6</td><td>da Hosa Technology</td> para <td>acionamento TTL</td></tr> Cabo <tr><td>coaxial BNC macho banhado a ouro para SMA macho (8.8")</td><td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>Para conectar as saídas de disparo da câmera de fluorescência</td></tr><tr><td>Adaptador de cabeça giratória BNC</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>Adaptador BNC para Banana Plug (4mm)</td></tr><tr><td>Conector BNC fêmea para fêmea</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>Fêmea para fêmea Adaptador BNC para conectar a saída BNC da câmera ao Banana Plug</td></tr><tr><td>Fios jumper de placa de ensaio flexíveis sem solda</td><td>Z& T</td><td>GK1212827</td><td>Para conectar as saídas de disparo BNC ao Arduiono DAQ.&nbsp; De homem para homem.</td></tr><tr><td>Estação de trabalho de alto desempenho</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7, 64GB RAM, processador Dual Xeon, unidade C: de estado sólido, porta serial (RS-232), vários slots PCIe3 para conectividade ethernet, cartões USB 3.0 e unidades de estado sólido</td></tr><tr><td>adicionais Unidade de estado sólido M.2</td><td>Samsung</td><td>MZ-V5P512BW</td><td>Streaming de alta velocidade e análise de dados de imagem Adaptador de</td></tr><tr><td>unidade de estado sólido M.2 para estações de trabalho</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>M.2 para PCIe 3.0 adaptador de 4 pistas</td></tr><tr><td>Armazenamento conectado à rede</td><td>Synology</td><td>DS-2415+</td><td>Armazenamento e análise de dados de imagem</td></tr><tr><td>Discos rígidos</td><td>Western Digital</td><td>WD80EFZX</td><td>RED 8 TB, 5400 RPM Classe SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Polegadas. Armazenamento de dados de imagem (10 unidades + redundância de 2 unidades)</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquisição de fluorescência</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage DIA</td><td>Gravação de sequências de imagens de fluorescência de dois canais (GCaMP5 e mCherry) a 20 fps</td></tr><tr><td>Aquisição de campo claro</td><td>FLIR (anteriormente Point Grey Research)</td><td>Flycapture</td><td>Gravação de sequências</td></tr> <tr><td>de imagens JPEG de campo claroStage Serial Port Reader</td><td>Bonsai</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>Facilita o rastreamento de worms durante o comportamento</td></tr><tr><td>Software do controlador de LED</td><td>Zeiss</td><td>Micro Toolbox Test 2011</td><td>Para configurar a intensidade e as entradas de gatilho para os diferentes LEDs na unidade Colibri.2</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>Revisão simples de sequências de imagens e alterações de formatação para importação para o software de quantificação raciométrica</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>&nbsp; 2002984-001-000001</td><td>Para gerar subconjuntos de dados de valores separados por vírgula de Volocity para análise MATLAB</td></tr><tr><td>Peak Finding</td><td>MATLAB</td><td>R2017a</td><td>Script usado para cálculos de recursos de pico de proporção</td></tr><tr><td>Quantificação ratiométrica</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Facilita o cálculo de canais de imagem raciométrica, segmentação de imagem para localização de objetos e medição de proporção de objetos encontrados</td></tr><tr><td>Scripts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-stage-final.bonsai</td><td>Bonsai</td><td>DAQ acionado por TTL e leitor de porta serial de posição do stage</td><td>Registra a posição do estágio X e Y (em mícrons) quando o Arduino conectado recebe um sinal TTL positivo da câmera sCMOS durante a exposição do quadro. O script grava um arquivo .csv com quatro colunas: número do quadro, posição X (mícrons), posição Y (mícrons) e o tempo decorrido entre os quadros (normalmente ~ 50 ms ao gravar a 20 fps).&nbsp; A posição do estágio X e Y desta saída (colunas 2 e 3, respectivamente) é adicionada às posições do centróide X e Y do script MATLAB AnalyzeGCaMP_2017.m (colunas 4 e 5, respectivamente), para fornecer a posição X e Y final do objeto fluorescente para a gravação.</td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio ratiometric de neurônios individuais se comportando caenorhabditis elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Tornou-se cada vez mais claro que atividade de circuito neural em se comportando animais difere substancialmente que visto em animais anestesiados ou imobilizados. Altamente sensíveis, geneticamente codificados repórteres fluorescentes de Ca2 + revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica usando abordagens ópticas não-invasiva em comportamento de animais. Quando combinado com genética e optogenetic técnicas, os mecanismos moleculares que modulam a atividade celular e do circuito durante o comportamento de diferente Estados-Membros pode ser identificados.
Aqui descrevemos os métodos para a ratiometric Ca2 + imagem latente de neurônios único em livremente se comportando vermes Caenorhabditis elegans . Podemos demonstrar uma técnica de montagem simples que gentilmente vermes de sobreposições, crescendo em um ágar padrão de nematódeo crescimento Media (NGM) bloqueiam com uma lamela de vidro, permitindo animais para ser gravado em alta resolução durante o movimento irrestrito e comportamento. Com essa técnica, nós usamos sensível Ca2 + repórter GCaMP5 para gravar as alterações no intracelular Ca2 + nos neurônios específico serotoninérgico hermafrodita (HSNs) como eles conduzem o comportamento de oviposição. Expressando co mCherry, uma Ca2 +-proteína fluorescente insensível, podemos rastrear a posição da HSN dentro ~ 1 µm e correto para flutuações na fluorescência causadas por mudanças no foco ou movimento. Imagem de infravermelho, simultânea brightfield permite gravação de comportamento e rastreamento de animais usando um palco motorizado. Integrando essas técnicas microscópicas e fluxos de dados, podemos gravar a atividade de Ca2 + no circuito de postura de c. elegans como progride entre Estados de comportamento ativo e inativo por dezenas de minutos.

A técnica de montagem simples descrita aqui (Figura 1) provoca mínimas alterações no ambiente da cultura de L4 e adulto c. elegans , permitindo alta resolução gravação em comportamento de animais através de uma lamela de vidro (Figura 4). Sincronização de fontes de luz LED, controladores de fase e exposições de câmera permite para aquisição de dados de vários fluxos a 20 frames/s para cima de 1 h. intermediário ampliação (20 x) com objectivos de abertura numérica elevada (0,7-0,8) fornece boa resolução espacial da região sináptica no circuito de comportamento de postura, mesmo com 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/pixel). Aquisição simultânea de sinais de fluorescência GCaMP5 e mCherry (Figura 4A, B) é usada para gerar um canal de relação pixel por pixel que compensa as alterações na circulação de animais e foco (Figura 4-D). O terminus pré-sináptica HSN é tão grande como muitos corpos celulares neuronais, em c. eleganse mudanças na pré-sináptica HSN Ca2 + podem ser visualizado claramente. O FOV grande da câmera infravermelho brightfield permite que o worm ser manualmente controlados durante a gravação (Figura 4E). Para cada animal, mudanças no intracelular Ca2 + podem ser correlacionadas com comportamentos evidentes na imagem brightfield, incluindo o lançamento de ovo e as alterações na locomoção (Figura 4E).
Quantificação de HSN Ca2 + e velocidade confirma que vermes mudam sua locomoção como eles transição para comportamento de oviposição. Existem diferenças significativas na velocidade de verme antes, durante e após o estado ativo de postura (Figura 5A). Isto não é causado pelo ruído inerente para a imagem ou o sistema de rastreamento. Zoom em uma postura evento, observamos uma forte mudança na fluorescência de GCaMP5 (ΔF/F) antes do evento de poedeiras, enquanto mCherry fluorescência é relativamente inalterada (Figura 5B). Medido mudanças na proporção de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) mostram claramente uma HSN Ca2 + transitória ~ 4 antes do s lançamento do ovo (Figura 5B). Uma clara desaceleração de locomoção worm coincidente com a contração muscular vulval, ocorre que termina com ovo libera. Resultados anteriores mostraram que os neurônios colinérgicos de motor VC, que são inervados pelos HSNs, mostrar atividade de pico durante as contrações musculares vulval forte e ovo lançamento 8,10,27. Também mostramos que a optogenetic de ativação dos neurônios VC leva uma desaceleração imediata da locomoção, sugerindo que os neurônios VC podem ser ativados pela contração muscular vulval, assim retardando a locomoção até receber feedback de lançamento de ovo27 .
A imagem latente e rastreamento sistema descrito permite a visualização da organização espacial de comportamento de oviposição (Figura 5-C). Como anteriormente indicado, vermes entram execuções sustentadas de locomoção para a frente antes de ser o estado ativo de32. Vermes gastam a maioria de seu tempo forrageando em bactérias no centro do pedaço de ágar. Antes da entrada em estado ativo, vermes mover-se longe da comida, que é coincidente com a aparência de infrequente HSN Ca2 + transientes. Atividade HSN então as transições para disparar rajada, com vários espaçadas HSN Ca2 + transientes que sustentam a postura eventos. As minhocas então muitas vezes virem, retomar a locomoção para frente e desovar o caminho de volta para sua posição inicial perto as bactérias OP50. Presumimos que podem estar influenciando mudanças no local O2 e/ou concentração de CO2 , onde os vermes se decidir colocar ovos33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> Figura 1. C. elegans montagem técnica para geração de imagens de alta resolução da atividade de circuito de postura e comportamento. Top, a montagem final do lado. No fundo, a montagem final como se fosse visto através do fundo da lamela grande. As setas indicam OP50 alimentar bacteriana, worms de c. elegans e ovos, imprensado entre o pedaço de ágar NGM e a lamela de grande 24 x 60 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> Figura 2 . Widefield ratiometric Ca2 + imagem e comportamento de gravação em um microscópio de epifluorescência invertido. (A) posição de verme e comportamento é capturado em brightfield através um 20 x (0,8 NA) plano-Apochromat objetivo usando luz infravermelha (750-790 nm) (setas roxas) emitida por uma lâmpada de halogéneo através do pedaço NGM. Um joystick e palco motorizado controlador é usado para manter o verme no campo de visão durante a gravação. Posição de fase (Δx, Δy) é enviada para o PC pela porta serial. GCaMP5 e mCherry de proteínas expressadas no worm estão animadas usando 470 nm (setas azuis) e 590 nm (setas amarelas) diodos emissores de luz (LED). Emitido GCaMP5 (verde setas) e mCherry (setas laranja) fluorescência juntamente com a luz infravermelha passa através de um espelho dicroico multi-banda (ver Tabela de materiais). Um divisor de feixe de 80/20 envia 20% da luz através de um demagnifer x 0.63 para captura em uma câmera do CMOS infravermelho-sensíveis (seta roxa). Os restantes 80% da luz é enviado através da porta do lado do microscópio para um divisor de imagem que separa o GCaMP5 e mCherry de fluorescência para separar as metades de uma câmera de sCMOS enquanto retira a luz infravermelha brightfield. Dados de ambas as câmaras são transferidos para um PC via cabos USB3. As portas do disparador da câmera sCMOS fluorescência (azul) são usadas para enviar + 5V TTL aciona o sistema de iluminação LED, a câmera CMOS infravermelho brightfield e o dispositivo de aquisição Digital (DAQ). (B) gatilho 3 saída sinais TTL são detectados pelo DAQ no pino digital #8 e enviados para o PC através de uma conexão USB. Estas entradas digitais acionar um ' onde XY' comando serial de um roteiro de software de Bonsai (XY-fase-final) onde se lê o X e Y palco posição para cada imagem de fluorescência/infravermelho GCaMP5/mCherry capturada. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> Figura 3 : Layout do script de comunicação serial-estágio de Bonsai XY-fase-final. O top DigitalInput nó (rosa) lê TTL disparadores entrando pin #8 do DAQ. Para cada TTL tensão positiva (verde), o DAQ faz um timestamp (azul) e grava uma sequência de 'Onde XY?' (rosa) para o controlador de fase através da porta serial (cinza). O nó de SerialStringRead (rosa) lê que o X e Y coordenam a resposta do controlador de palco. Essa sequência é então convertida em mícrons e separada em X e Y coordenadas de palco. Finalmente, esses quatro fluxos são combinados usando um nó de fecho de correr (azul) e um arquivo de quatro column.csv está escrito: uma contagem de quadro dos sinais TTL recebido (nó de gama, rosa), as coordenadas X e Y e o intervalo entre momentos subsequentes (tipicamente ~ 50 ms quando gravação a 20 Hz). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografias representativas de fluorescência HSN e todo animal brightfield durante o comportamento de oviposição. (–D) Imagem de ratiometric simultânea de fluorescência GCaMP5 e mCherry nos HSNs apenas antes da liberação do óvulo. Termini pré-sináptica HSN é indicadas com setas. (C) fusão de GCaMP5 e mCherry de fluorescência. (D) intensidade modulada GCaMP5:mCherry ratio; um rácio elevado (vermelho) indica alta intracelular Ca2 + no terminal pré-sináptica. (E) Brightfield imagem do verme inteira apenas depois que os ovos foram colocados. Setas indicam as metades anteriores e posteriores da vulva da qual os ovos são postos. Barra de escala para todas as imagens é 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> Figura 5 : Gravação do HSN Ca2 + e locomoção velocidade durante o comportamento de oviposição. (A) vestígios de mudanças de relação GCaMP5:mCherry em resposta a intracelular Ca2 + transientes (ΔR/R; vermelho) juntamente com a velocidade instantânea do worm (µm/s; azul). Eventos de desova são indicados por setas. (B) vestígios de fluorescência GCaMP5 HSN (verde; ΔF/F), mCherry de fluorescência (vermelho; ΔF/F), relação de fluorescência GCaMP5:mCherry (preto; ΔR/R) e worm velocidade (azul) em torno do momento da liberação do óvulo. (C) organização espacial dos comportamentos de postura e locomoção durante a gravação inteira de 10 min. A faixa de worm foi obtida a partir das informações de fase XY que foi adicionadas para a posição do centroide da HSN obtido a partir da gravação de fluorescência mCherry. O timing de transientes HSN (círculos vermelhos), eventos de postura (setas pretas) e o início e fim da gravação (diamantes de verdes e azuis) são indicados. Barra de escala é 1 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens raciométricas de cálcio dos efeitos do neurônio hermafrodita específico, ou atividade HSN, no comportamento de Caenorhabditis elegans. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Neurociência Comportamental sobre como a atividade do circuito neurológico produz mudanças no comportamento animal à medida que os animais alternam entre estados comportamentais. Essa técnica permite que as mudanças na atividade intracelular do cálcio sejam registradas com a alta relação sinal-ruído, ao mesmo tempo em que rastreia o comportamento e a locomoção do animal.Embora este método possa fornecer informações sobre a atividade neuronal em C. elegans, ele também pode ser aplicado a outros sistemas modelo transparentes, incluindo larvas de Drosophila e peixe-zebra. Demonstrando o procedimento comigo, estarão os alunos do Collin's Labs: Richard Kopcock, Pravat Dhakal e Layla Nassar. Para montar os animais, primeiro aplique o alimento bacteriano OP50 de uma placa de ágar de meio de crescimento de nematóide semeado no fundo de um palito de minhoca de platina e use o palito para transferir aproximadamente 20 L tardio quatro L-X 2.000 para animais que expressam o repórter de cálcio sensível GCaMP5 e mCherry em HSN do promotor NL três P em uma placa de meio de crescimento de nematóide semeado.Confirme a presença da vulva em desenvolvimento sob um microscópio estéreo como uma mancha escura clara cercada por um crescente branco e incube os vermes a 20 graus Celsius por 24-40 horas. No final da incubação, aplique OP50 em uma nova picareta e transfira três minhocas para uma placa de meio de crescimento de nematóides sem sementes, deixando uma pequena porção de comida na nova placa para os vermes se alimentarem durante a imagem. Em seguida, use uma espátula plana arredondada para cortar um pedaço de 20 por 20 milímetros da placa não semeada e coloque o pedaço, com o lado da minhoca voltado para baixo, em uma das bordas de uma lamínula limpa de 24 por 60 milímetros número 1,5.Em seguida, deslize cuidadosamente o pedaço de ágar no centro da lamínula e coloque uma lamínula número um de 22 por 22 milímetros em cima da peça de ágar para reduzir a aderência e a evaporação. Para configurar o gerador de imagens, coloque os vermes no palco de um microscópio invertido e selecione o subjetivo 20x. Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem e deslize o filtro infravermelho e coloque-o acima do condensador.Abra um programa de análise de vídeo apropriado e execute o script de comunicação final do estágio XY serial. Clique em CsvWriter e selecione uma pasta para salvar as informações gravadas dos estágios X e Y. Em seguida, clique na seta verde para inicializar o dispositivo de aquisição digital.No software de gravação da câmera infravermelha em configurações, selecione Alternar caixa de diálogo de controle da câmera. Em seguida, selecione o menu Modos de vídeo personalizados e selecione Modo 1 e Pixel Format Raw oito. Em Trigger Stroke, defina a linha de entrada do gatilho como três, a polaridade como alta e o modo como 14.Alterne Ativar para interromper a aquisição do quadro até que o voltage sinal de disparo é recebido da câmera fluorescente. Com a janela de visualização de imagens aberta, clique em Gravar e selecione a pasta para salvar as sequências de imagens. Selecione Modo de gravação em buffer e salve as imagens no formato JPEG.Em seguida, clique em Iniciar Gravação para inicializar a aquisição. Em seguida, abra a guia Capturar no software de aquisição de florescência e defina o tempo de exposição para 10 milissegundos, o Binning para quatro X e a profundidade da imagem para 16 bits. Selecione uma submatriz de câmera centralizada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura.O programa dividirá automaticamente a imagem ampla ao meio para gerar os canais de florescência separados. Clique em Mostrar opções de gatilho de saída e defina todos os gatilhos como positivos. Confirme se o gatilho um e o gatilho dois estão definidos como Exposição e o gatilho três está definido como Programável com um período de 25 milissegundos.Em seguida, na guia de sequência, selecione Time Lapse Em Scan Settings, defina Field Delay de um a 50 milissegundos para coletar imagens a 20 hertz. Selecione salvar no buffer temporário. Para Imagens Raciométricas de Cálcio, na guia Sequência, clique em Iniciar para iniciar a gravação e rastrear o verme com o joystick, mantendo as células e sinapses do interesse em foco no centro do campo de visão.No momento em que a gravação da florescência é iniciada, os gatilhos são enviados para a câmera de campo claro em espera e para o controlador de palco, que começam a coletar imagens sincronizadas e a posição do palco. Clique no botão Estatísticas na janela Histograma para mostrar as estatísticas de pixel de cada canal. Ajuste a potência do LED para garantir um único pixel máximo de florescência mCherry no terminal pré-sináptico maior ou igual a 8.000 contagens no canal vermelho, fornecendo aproximadamente 12 bits de faixa dinâmica acima do fundo.Os sinais do Calcium Reporter no terminal pré-sináptico durante o repouso ou baixo teor de cálcio devem ser em torno de 2.500 contagens no canal verde. Registre o comportamento até que um estado ativo de postura de ovos seja alcançado. Em seguida, salve um subconjunto de 10 minutos contendo 6.000 quadros antes e 6.001 quadros após o primeiro evento de postura.Tome cuidado para manter o mesmo subconjunto de imagens de campo brilhante do comportamento do verme e pontos de tempo da posição do estágio XY ou a sincronização precisa dos fluxos de dados será perdida. Para segmentação de imagem, importe as sequências de imagens para um programa de software de quantização raciométrica apropriado e clique com o botão direito do mouse na série temporal na guia de sequência para definir a série temporal para 20 quadros por segundo e 1,25 micrômetros por pixel. No menu Ferramentas, selecione Proporção, selecione mCherry para o Canal A e GCaMP5 para o Canal B e clique em Calcular para subtrair o plano de fundo de cada sequência de imagens.Selecione Aplicar uma tabela de pesquisa de arco-íris ao canal de proporção e use o canal mCherry para gerar um canal de proporção modulada por intensidade para mapear a cor da taxa no brilho do canal mCherry. Clique em Proporção para gerar os dois canais. Para criar um protocolo de localização de objetos, arraste a ferramenta Localizar objetos usando intensidade na guia de medições para o painel de protocolo e clique na engrenagem para definir a janela de valores de intensidade mCherry e para Localizar objetos.Selecione valores de intensidade maiores ou iguais a dois desvios padrão acima do fundo, tomando cuidado para que o corpo celular e o terminal pré-sináptico sejam detectados. Adicione quaisquer filtros adicionais direcionados ao canal mCherry apenas conforme necessário para excluir objetos indesejados, como: cabeça, cauda ou florescência do intestino. Em seguida, abra o menu Medições e selecione Criar Item de Medição e escolha todos os pontos de tempo para executar o Protocolo de Análise de Quantização de imagem.A aquisição simultânea de sinais de florescência GCaMP5 e mCherry é usada para gerar um canal de proporção pixel a pixel que compensa as mudanças no movimento e foco do animal. Para cada animal, as alterações no cálcio HSN intracelular pré-sináptico podem ser correlacionadas com comportamentos evidentes em imagens de campo claro, incluindo liberação de ovos e alterações na locomoção. De fato, diferenças significativas na velocidade do verme antes, durante e depois do estado ativo de postura de ovos podem ser observadas.O zoom em um evento de postura revela uma mudança robusta na florescência do GCaMP5 antes do evento de postura. Enquanto a florescência mCherry permanece relativamente inalterada. Além disso, as alterações medidas na relação GCaMP5: mCherry mostram claramente um transiente de cálcio HSN cerca de 4 segundos antes da liberação do ovo.O produto contração do músculo vulvar evidente de uma clara desaceleração da locomoção do verme que termina com a liberação do ovo. Além disso, a imagem e o rastreamento dos vermes, como acabamos de demonstrar, permitem a visualização da organização espacial do comportamento de postura de ovos a partir do forrageamento, mudanças transitórias de cálcio HSM e atividade de HSN que faz a transição para o disparo de explosão antes da locomoção para o local de postura. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma ou duas horas, se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o foco nas células de interesse e seus terminais pré-sinápticos durante as etapas de imagem. Após este procedimento, outros métodos, como a Ativação Optogenética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como o HSN responde à estimulação pré-sináptica. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da Neurociência explorarem a função do circuito de postura de ovos em C. elegans.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a imagem raciométrica de cálcio de HSN em Caenorhabditis elegans ativos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Imagem de cálcio: um método para visualizar a atividade neural em C. elegans vivos

Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de cálcio em neurônios individuais de Caenorhabditis elegans em comportamento usando proteínas repórteres fluorescentes geneticamente codificadas. Ele descreve as etapas envolvidas na imagem do movimento do verme e na medição das taxas de fluorescência repórter dos neurônios para correlacionar os níveis de cálcio intracelular com a atividade neuronal e as mudanças comportamentais durante a postura dos ovos.

Imagem de cálcio em neurônios individuais que regulam o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans

Fonte: Doser, R., et al. Imagem subcelular do manuseio de cálcio neuronal in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra imagens in vivo do fluxo de cálcio subcelular nos neurônios do cordão nervoso ventral de cepas transgênicas de Caenorhabditis elegans. Dois indicadores distintos de cálcio são empregados: um indicador citoplasmático em uma cepa e um indicador mitocondrial em outra. Os neurônios são observados sob um microscópio de fluorescência para monitorar mudanças em tempo real na...

Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

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Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

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Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada

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