Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens raciométricas de cálcio dos efeitos do neurônio hermafrodita específico, ou atividade HSN, no comportamento de Caenorhabditis elegans. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Neurociência Comportamental sobre como a atividade do circuito neurológico produz mudanças no comportamento animal à medida que os animais alternam entre estados comportamentais. Essa técnica permite que as mudanças na atividade intracelular do cálcio sejam registradas com a alta relação sinal-ruído, ao mesmo tempo em que rastreia o comportamento e a locomoção do animal.

Embora este método possa fornecer informações sobre a atividade neuronal em C. elegans, ele também pode ser aplicado a outros sistemas modelo transparentes, incluindo larvas de Drosophila e peixe-zebra. Demonstrando o procedimento comigo, estarão os alunos do Collin's Labs: Richard Kopcock, Pravat Dhakal e Layla Nassar. Para montar os animais, primeiro aplique o alimento bacteriano OP50 de uma placa de ágar de meio de crescimento de nematóide semeado no fundo de um palito de minhoca de platina e use o palito para transferir aproximadamente 20 L tardio quatro L-X 2.000 para animais que expressam o repórter de cálcio sensível GCaMP5 e mCherry em HSN do promotor NL três P em uma placa de meio de crescimento de nematóide semeado.

Confirme a presença da vulva em desenvolvimento sob um microscópio estéreo como uma mancha escura clara cercada por um crescente branco e incube os vermes a 20 graus Celsius por 24-40 horas. No final da incubação, aplique OP50 em uma nova picareta e transfira três minhocas para uma placa de meio de crescimento de nematóides sem sementes, deixando uma pequena porção de comida na nova placa para os vermes se alimentarem durante a imagem. Em seguida, use uma espátula plana arredondada para cortar um pedaço de 20 por 20 milímetros da placa não semeada e coloque o pedaço, com o lado da minhoca voltado para baixo, em uma das bordas de uma lamínula limpa de 24 por 60 milímetros número 1,5

Em seguida, deslize cuidadosamente o pedaço de ágar no centro da lamínula e coloque uma lamínula número um de 22 por 22 milímetros em cima da peça de ágar para reduzir a aderência e a evaporação. Para configurar o gerador de imagens, coloque os vermes no palco de um microscópio invertido e selecione o subjetivo 20x. Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem e deslize o filtro infravermelho e coloque-o acima do condensador.

Abra um programa de análise de vídeo apropriado e execute o script de comunicação final do estágio XY serial. Clique em CsvWriter e selecione uma pasta para salvar as informações gravadas dos estágios X e Y. Em seguida, clique na seta verde para inicializar o dispositivo de aquisição digital.

No software de gravação da câmera infravermelha em configurações, selecione Alternar caixa de diálogo de controle da câmera. Em seguida, selecione o menu Modos de vídeo personalizados e selecione Modo 1 e Pixel Format Raw oito. Em Trigger Stroke, defina a linha de entrada do gatilho como três, a polaridade como alta e o modo como 14.

Alterne Ativar para interromper a aquisição do quadro até que o voltage sinal de disparo é recebido da câmera fluorescente. Com a janela de visualização de imagens aberta, clique em Gravar e selecione a pasta para salvar as sequências de imagens. Selecione Modo de gravação em buffer e salve as imagens no formato JPEG.

Em seguida, clique em Iniciar Gravação para inicializar a aquisição. Em seguida, abra a guia Capturar no software de aquisição de florescência e defina o tempo de exposição para 10 milissegundos, o Binning para quatro X e a profundidade da imagem para 16 bits. Selecione uma submatriz de câmera centralizada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura.

O programa dividirá automaticamente a imagem ampla ao meio para gerar os canais de florescência separados. Clique em Mostrar opções de gatilho de saída e defina todos os gatilhos como positivos. Confirme se o gatilho um e o gatilho dois estão definidos como Exposição e o gatilho três está definido como Programável com um período de 25 milissegundos.

Em seguida, na guia de sequência, selecione Time Lapse Em Scan Settings, defina Field Delay de um a 50 milissegundos para coletar imagens a 20 hertz. Selecione salvar no buffer temporário. Para Imagens Raciométricas de Cálcio, na guia Sequência, clique em Iniciar para iniciar a gravação e rastrear o verme com o joystick, mantendo as células e sinapses do interesse em foco no centro do campo de visão.

No momento em que a gravação da florescência é iniciada, os gatilhos são enviados para a câmera de campo claro em espera e para o controlador de palco, que começam a coletar imagens sincronizadas e a posição do palco. Clique no botão Estatísticas na janela Histograma para mostrar as estatísticas de pixel de cada canal. Ajuste a potência do LED para garantir um único pixel máximo de florescência mCherry no terminal pré-sináptico maior ou igual a 8.000 contagens no canal vermelho, fornecendo aproximadamente 12 bits de faixa dinâmica acima do fundo.

Os sinais do Calcium Reporter no terminal pré-sináptico durante o repouso ou baixo teor de cálcio devem ser em torno de 2.500 contagens no canal verde. Registre o comportamento até que um estado ativo de postura de ovos seja alcançado. Em seguida, salve um subconjunto de 10 minutos contendo 6.000 quadros antes e 6.001 quadros após o primeiro evento de postura.

Tome cuidado para manter o mesmo subconjunto de imagens de campo brilhante do comportamento do verme e pontos de tempo da posição do estágio XY ou a sincronização precisa dos fluxos de dados será perdida. Para segmentação de imagem, importe as sequências de imagens para um programa de software de quantização raciométrica apropriado e clique com o botão direito do mouse na série temporal na guia de sequência para definir a série temporal para 20 quadros por segundo e 1,25 micrômetros por pixel. No menu Ferramentas, selecione Proporção, selecione mCherry para o Canal A e GCaMP5 para o Canal B e clique em Calcular para subtrair o plano de fundo de cada sequência de imagens.

Selecione Aplicar uma tabela de pesquisa de arco-íris ao canal de proporção e use o canal mCherry para gerar um canal de proporção modulada por intensidade para mapear a cor da taxa no brilho do canal mCherry. Clique em Proporção para gerar os dois canais. Para criar um protocolo de localização de objetos, arraste a ferramenta Localizar objetos usando intensidade na guia de medições para o painel de protocolo e clique na engrenagem para definir a janela de valores de intensidade mCherry e para Localizar objetos.

Selecione valores de intensidade maiores ou iguais a dois desvios padrão acima do fundo, tomando cuidado para que o corpo celular e o terminal pré-sináptico sejam detectados. Adicione quaisquer filtros adicionais direcionados ao canal mCherry apenas conforme necessário para excluir objetos indesejados, como: cabeça, cauda ou florescência do intestino. Em seguida, abra o menu Medições e selecione Criar Item de Medição e escolha todos os pontos de tempo para executar o Protocolo de Análise de Quantização de imagem.

A aquisição simultânea de sinais de florescência GCaMP5 e mCherry é usada para gerar um canal de proporção pixel a pixel que compensa as mudanças no movimento e foco do animal. Para cada animal, as alterações no cálcio HSN intracelular pré-sináptico podem ser correlacionadas com comportamentos evidentes em imagens de campo claro, incluindo liberação de ovos e alterações na locomoção. De fato, diferenças significativas na velocidade do verme antes, durante e depois do estado ativo de postura de ovos podem ser observadas.

O zoom em um evento de postura revela uma mudança robusta na florescência do GCaMP5 antes do evento de postura. Enquanto a florescência mCherry permanece relativamente inalterada. Além disso, as alterações medidas na relação GCaMP5: mCherry mostram claramente um transiente de cálcio HSN cerca de 4 segundos antes da liberação do ovo.

O produto contração do músculo vulvar evidente de uma clara desaceleração da locomoção do verme que termina com a liberação do ovo. Além disso, a imagem e o rastreamento dos vermes, como acabamos de demonstrar, permitem a visualização da organização espacial do comportamento de postura de ovos a partir do forrageamento, mudanças transitórias de cálcio HSM e atividade de HSN que faz a transição para o disparo de explosão antes da locomoção para o local de postura. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma ou duas horas, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o foco nas células de interesse e seus terminais pré-sinápticos durante as etapas de imagem. Após este procedimento, outros métodos, como a Ativação Optogenética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como o HSN responde à estimulação pré-sináptica. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da Neurociência explorarem a função do circuito de postura de ovos em C. elegans.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a imagem raciométrica de cálcio de HSN em Caenorhabditis elegans ativos.