Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

O objetivo geral deste protocolo experimental é permitir que investigadores de PTM inexperientes determinem efetivamente se sua proteína-alvo é modificada endogenamente por um ou mais PTMs usando um único sistema abrangente. Este método aprimorará a investigação no campo de modificação pós-tradução, permitindo a detecção de PTMs chave e diafonia potencial para qualquer proteína-alvo usando um sistema único e simplificado. A principal vantagem dessa técnica é que os especialistas não PTM podem detectar se uma proteína é modificada endogenamente por um ou mais PTMs em seu sistema modelo.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez enquanto estudávamos mecanismos regulatórios para várias vias de sinalização celular e descobrimos que nossos kits ou sistemas fáceis de usar não estavam realmente disponíveis para estudar PTMs não fosfofosos. Comece este procedimento com a preparação de células A431, conforme descrito no protocolo de texto. Além disso, prepare a lise do blaster em tampões de diluição com inibidores.

Despeje o meio de cultura e coloque as células no gelo. Em seguida, lave as células duas vezes com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Remova o máximo de PBS possível antes de adicionar o tampão de lise do blaster para maximizar a lise celular.

Adicione 600 microlitros de tampão de lise de blaster a cada placa de 150 milímetros. A quantidade de tampão é baseada no rendimento de proteína esperado. Em seguida, lise as células usando um raspador de células.

O lisado se tornará viscoso devido à lise nuclear. Use uma ponta de pipeta cortada de um milímetro para transferir o lisado bruto para um filtro blaster que foi colocado em um tubo de coleta de 15 mililitros. Use o êmbolo do filtro fornecido para comprimir completamente o filtro blaster e coletar o fluxo de lisado, incluindo quaisquer bolhas, em um tubo de 15 mililitros.

O filtro blaster simples e eficiente remove o DNA genômico, em vez de cortá-lo, como visto em outros métodos comumente usados. Diluir o lisado clarificado com tampão de diluição blaster até um volume final de três mililitros para cada placa de 150 milímetros. O volume final é baseado no rendimento de proteína esperado.

Esta etapa é importante, pois a composição final do tampão afetará o rigor da reação de precipitação de aminoácidos. Em seguida, prepare o ensaio de quantificação de proteínas, conforme descrito no protocolo de texto. Meça a absorbância da amostra de lisado a 600 nanômetros e calcule a concentração de proteína.

Inverta o tubo de reagente de estoque várias vezes para certificar-se de que os grânulos sejam completamente ressuspensos no tubo. Para cada ensaio IP, alíquota da suspensão do cordão em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro no gelo. Aqui, adicione 20 microlitros de grânulos de afinidade de ubiquitina, 30 microlitros de grânulos de afinidade de fosfotirosina, 40 microlitros de grânulos de afinidade SUMOylation 2/3 ou 50 microlitros de grânulos de afinidade de acetilação aos tubos de microcentrífuga individuais.

Inverta os tubos de reagentes de estoque contendo esferas de controle IP de ubiquitinação e esferas de controle IGG várias vezes para certificar-se de que as esferas sejam completamente ressuspensas no tubo. Em seguida, alíquota dos cordões de controle por reação de controle para determinar a ligação inespecífica. Aqui, adicione 20 microlitros de esferas de controle de ubiquitina, 30 microlitros de esferas de controle de fosfotirosina, 40 microlitros de esferas de controle SUMOylation 2/3 ou 50 microlitros de contas de controle de acetilação a tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro no gelo.

Economize 20 microlitros de lisado para funcionar como um controle de lisado de entrada de western blot. Adicione cinco microlitros de tampão de amostra 5x ao lisado reservado e ferva a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione lisado a cada tubo IP e controle o tubo IP.

Aqui, um miligrama de lisado foi usado por IP e reação de controle, resultando em um total de oito reações IP. incubar os tubos em uma plataforma final e rotativa a quatro graus Celsius por duas horas. Após a incubação, colete as esferas por centrifugação a três a 5.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius.

Aspire o máximo de sobrenadante possível sem perturbar as contas, depois lave as esferas em um mililitro de tampão de lavagem por cinco minutos em uma plataforma giratória de quatro graus Celsius e colete as contas por centrifugação como antes. Após centrifugação, aspirar o máximo possível de sobrenadante sem perturbar os grânulos e repetir o passo de lavagem mais duas vezes. Após a lavagem e centrifugação finais, aspirar a maioria no sobrenadante tampão e, em seguida, remover o sobrenadante residual usando uma ponta de carga de proteína de furo fino.

A interrupção mínima do pellet do grânulo é aceitável. Certifique-se de que todo o tampão de lavagem foi removido, minimizando a interrupção do pellet de batimento para maximizar a recuperação de suas proteínas PTM. Em seguida, adicione 30 microlitros de tampão de eluição de esferas e ressuspenda as esferas batendo suavemente ou sacudindo a lateral do tubo.

Não use uma pipeta nesta fase. Incube as esferas ressuspensas à temperatura ambiente por cinco minutos. Corte a extremidade da ponta da pipeta de transferência e transfira suavemente cada suspensão de cordão para uma coluna de centrifugação de microcentrífuga de 1,5 mililitro que foi colocada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Centrifugar a amostra entre nove e 10.000 vezes G a partir de um minuto à temperatura ambiente para recolher a amostra IP, adicionar dois microlitros de 2-mercaptoetanol a cada amostra e misturar bem. Coloque as amostras em banho-maria a 95 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, colher a amostra por centrifugação a 10 000 vezes G durante um minuto à temperatura ambiente.

Por fim, prossiga para a execução da análise SDS PAGE, transferência e western blot conforme descrito no protocolo de texto. O lisado de células A431 não tratado e tratado com EGF foi adicionado aos grânulos de afinidade de ubiquitina, fosfotirosina, SUMO 2/3 e acetil lisina. Um anticorpo PD-L1 foi utilizado para análise de immunoblot ocidental para determinar se a proteína PD-L1 foi modificada por esses quatro PTMs em resposta à estimulação de EGF.

Os resultados representativos mostrados aqui indicam que este método identifica efetivamente as modificações endógenas do PTM de PD-L1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a 4 horas e meia, se executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como detectar PTM enógeno ou diafonia para sua proteína-alvo ou via de sinalização usando este sistema abrangente de detecção de PTM.