Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia
3 de abril de 2018
Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.
O objetivo geral deste protocolo é identificar alvos hospedeiros que podem ser manipulados para melhorar a terapia com vírus oncolíticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia com vírus oncolíticos, como quais fatores específicos do hospedeiro e vias celulares modulam a replicação do vírus oncolítico. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite identificar alvos do hospedeiro que podem ser manipulados para melhorar a terapia com vírus oncolíticos de maneira abrangente e imparcial.
Este protocolo também pode ser utilizado para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação do vírus em geral. Depois de desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento de acordo com o protocolo de texto, remova um lote de placas de microtitulação do freezer e deixe-as descongelar por 20 a 30 minutos. Enquanto isso, encha duas garrafas com etanol a 70% e, em seguida, encha dois tubos cônicos de 50mL com PBS e um com água destilada.
Mergulhe o tubo dispensador de líquido em uma garrafa de etanol 70% e coloque um pedaço de fita adesiva ao redor do tubo para marcar o ponto abaixo do qual o tubo pode ser considerado estéril. Use aproximadamente 25mL de etanol a 70% para preparar a tubulação. Despeje etanol adicional na garrafa para repor o volume perdido e, em seguida, deixe o tubo descansar no etanol por no mínimo cinco minutos.
Depois de preparar a coifa de cultura de células, centrifugue as placas seladas e os endurecimentos a 1026 vezes G em temperatura ambiente por dois minutos. Em seguida, remova as vedações das placas. Em seguida, pipete a quantidade necessária de reagente de transfecção nos tubos cônicos que contêm o diluente de reagente de transfecção pré-aquecido.
Comece a tripsinizar as células aspirando o meio de cada placa. Use nove mL de PBS para enxaguar as células e, em seguida, pipetar três mL de tripsina por placa. Incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos.
Em seguida, use 22mL de meio para ressuspender as células pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Combine a suspensão celular de cada placa de cultura de tecidos em um frasco estéril e misture a suspensão celular invertendo o frasco. Em seguida, pipete um mL de aliquats na suspensão celular em dois tubos de microcentrífugas separados.
Remova a amostra de cada tubo de microcentrífuga e conte as células. Em seguida, calcule o volume de suspensão celular necessário para a densidade necessária e prepare uma suspensão celular diluída suficiente para dispensar em um lote de placas. Enquanto as células estão sendo preparadas, esvazie o tubo do dispensador de líquido de etanol.
Use aproximadamente 25mL de PBS para preparar o tubo e, em seguida, esvazie o tubo. Certifique-se de que a parte do tubo que será imersa no reagente de transfecção e, posteriormente, na suspensão celular, seja mantida estéril. Separe as placas que podem ser feitas com segurança com um tubo cônico de solução reagente de transfecção.
Pipete as soluções reagentes de transfecção para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, use a solução para preparar a tubulação antes de dispensar 5 microlitros por poço. Centrifugar as placas a 1026 vezes G à temperatura ambiente durante um minuto.
Em seguida, incubar as placas à temperatura ambiente durante o tempo prescrito para o reagente de transfecção que está sendo usado. Durante a incubação, esvazie o tubo da solução reagente de transfecção e coloque-o em um tubo cônico cheio de 50mL contendo PBS. Em seguida, use aproximadamente 25mL de PBS para enxaguar o tubo, preparando-o e esvaziando-o.
Misture o frasco contendo a suspensão celular, coloque o tubo na suspensão e prepare o tubo o suficiente para ver se cada ponta está sendo dispensada corretamente. Dispense 30 microlitros por poço da suspensão celular em todas as placas. Esvazie a suspensão celular do tubo e, em seguida, enxágue o tubo com aproximadamente 25mL de PBS seguido de aproximadamente 50mL de água destilada.
Deixe as placas em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos a partir do momento da semeadura celular. Em seguida, incube as placas em uma incubadora não perturbada para o comprimento desejado de silenciamento de genes. Para economizar tempo, no dia anterior à infecção das células, pipete em frascos estéreis a quantidade exata de meio necessária para infectar cada lote de placas, incluindo meio para poços não infectados.
Aqueça o meio a 37 graus Celsius e, em seguida, encha duas garrafas com etanol a 70%, dois tubos cônicos de 50mL com PBS e um com água destilada. Esterilize a tubulação com etanol a 70%, conforme demonstrado anteriormente. Enquanto o tubo está parado no etanol, primeiro vortex o vírus e, em seguida, pipeta o volume preciso de vírus necessário para o frasco de meio de infecção.
Em seguida, enxágue o tubo usando 25mL de PBS para prepará-lo e esvazie-o. Depois de remover as placas da incubadora, coloque-as na capa de cultura de tecidos. Use o meio para preparar a tubulação e, em seguida, dispense 40 microlitros de meio nos poços de controle não infectados.
Esvazie o tubo do meio e use 25mL de PBS para enxaguá-lo. Depois de misturar o vírus, coloque o tubo no frasco que contém o vírus, dispense 40 microlitros de vírus nas placas. Centrifugue as placas a 400 vezes G em temperatura ambiente por 30 minutos.
Incube as placas pelo período de tempo previamente determinado. No dia anterior à fixação, prepare um frasco de solução fixadora contendo quatro por cento de formaldeído e PBS para cada lote de placas, mas omita a coloração de Hoechst. Guarde a solução no armário inflamável, longe da luz.
No dia seguinte, use etanol a 70% e PBS para enxaguar o tubo, conforme demonstrado anteriormente. Dispense 30 microlitros da solução em todas as placas e coloque as placas na incubadora por 30 minutos. Após a incubação, aplique as vedações nas placas e armazene-as a quatro graus Celsius protegidas da luz.
Realize imagens e análises de acordo com o protocolo de texto. Aqui são mostradas 786 células O coradas com Hoechst 33342 após uma incubação de 72 horas apenas com diluente reagente de transfecção. Reagente e diluente de transfecção, siRNA não direcionado e com siRNA direcionado a PLK1.
O gráfico de sobrevivência visto aqui indica que 22% das células transfectadas com siRNA PLK1 sobreviveram e 94% das células transfectadas com siRNA não alvo sobreviveram. Este gráfico mostra os resultados do curso ao vivo de 786 células O infectadas com o vírus vaccinia oncolítico expressando GFP aumentada em vários MOIs. Imagens representativas de células infectadas em um MOI de 0,05 ao longo de um curso de tempo real são mostradas aqui.
Um período de incubação de 21 horas permitiria detectar aumentos e diminuições na propagação, pois o ponto de tempo está dentro de uma faixa linear. Após triagens de RNAi em todo o genoma em três linhagens de células tumorais, 1008 ocorrências comuns a pelo menos duas das três linhas de células cancerígenas foram identificadas usando o método MAD. 10 acertos dentro das vias UPR e ERAD foram selecionados para validação secundária via siRNA com diferentes sequências de direcionamento.
Ao dispensar reagentes, é fundamental que você tenha o lote correto de placas, tenha selecionado o volume correto para dispensação e que a tubulação tenha sido preenchida com o reagente correto e esteja sempre totalmente submersa no reagente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir uma triagem de RNAi de alto rendimento para identificar alvos do hospedeiro que podem ser manipulados para aprimorar a terapia com vírus oncolíticos ou para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação do vírus em geral.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para triagem de RNAi de alto rendimento destinado a identificar alvos hospedeiros que possam potencializar a terapia com vírus oncolíticos, particularmente para rhabdovírus e vírus vaccinia. Ele é adaptável para outras plataformas de vírus oncolíticos e para a descoberta de genes hospedeiros que influenciam a replicação viral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapia com vírus oncolíticos
- Interferência de RNA (RNAi)
- Interações hospedeiro-patógeno
Antecedentes
- Os vírus oncolíticos são projetados para infectar e matar seletivamente células cancerígenas.
- O entendimento dos fatores do hospedeiro pode melhorar a eficácia das terapias com vírus oncolíticos.
- A triagem de alto rendimento permite a identificação abrangente de alvos do hospedeiro relevantes.
- Este protocolo pode ser adaptado para diversas plataformas virais.
Objetivo do Estudo
- Identificar alvos hospedeiros que podem ser manipulados para aprimorar a terapia com vírus oncolíticos.
- Explorar fatores hospedeiros e vias celulares que modulam a replicação viral.
- Fornecer um método abrangente e imparcial para identificação de alvos.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um ensaio de triagem de alto rendimento.
- Preparação de placas de microtitulação para triagem.
- Uso de RNAi para silenciar genes do hospedeiro.
- Análise da replicação viral em resposta à manipulação de alvos do hospedeiro.
Resultados Principais
- Identificação de fatores hospedeiros específicos que potencializam a terapia com vírus oncolíticos.
- Compreensão de vias celulares que influenciam a replicação viral.
- Demonstração da eficácia do rastreamento de RNAi de alto rendimento.
- Potencial para aplicações mais amplas no entendimento das interações vírus-hospedeiro.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para aprimorar terapias com vírus oncolíticos.
- A identificação de alvos hospedeiros pode levar a estratégias terapêuticas melhoradas.
- Este método pode ser adaptado para diversas aplicações de pesquisa em virologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sequenciamento de RNAi em todo o genoma permite a identificação imparcial de fatores hospedeiros que modulam a replicação de vírus oncolíticos, fornecendo uma abordagem sistemática para reduzir os riscos na seleção de alvos terapêuticos na fase inicial de descoberta. Ao mapear as interações hospedeiro-patógeno que influenciam a infectividade viral, o tamanho do surto e a citotoxicidade, o método reforça a confiança preditiva na validação de alvos e na priorização de portfólios. Essa capacidade aprimora a compreensão mecanicista e orienta decisões de avanço ou interrupção nos processos de desenvolvimento de vírus oncolíticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a identificação de genes do hospedeiro que modulam a replicação viral em células cancerígenas.
- Valor Operacional: Fornece um levantamento abrangente e imparcial dos fatores do hospedeiro ao longo do genoma para esclarecer o envolvimento de vias metabólicas.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica de alvos ao associar a modulação de fatores do hospedeiro a alterações mensuráveis na atividade oncolítica viral.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Estabelece um sistema padronizado e reproduzível de ensaio para quantificar fenótipos de replicação viral, como infectividade e efeito citopático.
- Valor Operacional: Gera dados quantitativos e de alto conteúdo, adequados para seleção de alvos e fluxos de trabalho de validação posteriores.
- Valor Científico: Facilita a escalabilidade do ensaio e sua aplicabilidade entre plataformas a outros vírus oncolíticos além do Maraba e da vacínia.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Identifica alvos hospedeiros com relevância para doenças em linhagens celulares tumorais, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite validação secundária e terciária utilizando sequências ortogonais de siRNA para confirmar a especificidade do alvo.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a confirmação de alvos em múltiplas linhagens celulares de câncer usando métodos estatísticos robustos (MAD).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a validação pré-clínica, permitindo a investigação orientada por hipóteses de vias do hospedeiro que influenciam a eficácia do vírus oncolítico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao associar a diminuição de genes do hospedeiro a alterações na dinâmica da replicação viral.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e resultados quantitativos (por exemplo, gráficos de sobrevivência, métricas de infecção) que permitem avaliação confiável de compostos ou perturbações genéticas.
- Análises: Gera resultados estatísticos (por exemplo, identificação de alvos com base no desvio absoluto mediano) que possibilitam comparação entre condições e priorização de candidatos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica ao validar alvos em múltiplos modelos de tumores e associá-los a vias conhecidas (RPU, ERAD).
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de triagem reutilizável, aplicável a diversas plataformas de vírus oncolíticos e a estudos gerais de interação vírus-hospedeiro.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista nas interações hospedeiro-patógeno.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de fluxos de trabalho de triagem de RNAi em alto rendimento.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante desmistificação precoce de alvos.
- Impacto na Carteira: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em alvos hospedeiros validados em múltiplos modelos de câncer.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura celular, transfeção e manipulação líquida de alto rendimento.
- Depende do acesso a bibliotecas de RNAi, reagentes de transfeção e plataformas de imagem para leitura da replicação viral.
- Necessita padronização entre equipes das condições do ensaio, manipulação de reagentes e protocolos de análise de dados.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes linhagens celulares tumorais e cepas virais para garantir a relevância do ensaio.
- As limitações práticas incluem toxicidade dos reagentes, efeitos fora do alvo e a necessidade de validação ortogonal para confirmar a especificidade dos alvos positivos.
