Name: Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a realizar rastreamento de RNAi de alto rendimento para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação viral e potencializam a terapia com vírus oncolíticos em linhagens tumorais.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de Ontário para pesquisa do câncer, a Fundação do Canadá para a inovação, o Ottawa Regional Cancer Foundation e o Instituto de pesquisa do Terry Fox. K.J.A. foi apoiado por uma bolsa graduação Canadá Vanier, um Instituto canadense de saúde pesquisa-mestrado Award e uma bolsa de pós-graduação de Ontário.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós apresentamos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos. Isso foi testado com sucesso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, mas, como foi observado, pode ser adaptado para uso com outros vírus Oncolíticos ou outros vírus geralmente para identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus. O protocolo de triagem também é projetado para identificar genes que...

Rastreio com throughput alto todo o genoma RNAi tem provado para ser uma ferramenta inestimável para revelando insights biológicas em diversas áreas de estudo, incluindo biologia de vírus. Ao longo da última década ou assim, numerosos grupos comprometeram-se baseada em célula em grande escala RNAi triagem para extensivamente identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus (revisado em1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, um grande número dessas telas foram realizado em células cancerosas e diversas com vírus que são candidatos de vírus Oncolíticos atual incluindo vaccinia vírus8,9,10 , De vírus mixoma11, herpes simplex vírus12, estomatite vesicular vírus13,14e Marabá vírus15. Embora o foco da maioria desses estudos foi na identificação de fatores do hospedeiro que influenciam a algum aspecto da replicação do vírus e não na identificação de alvos bioterapêutico para reforçar a terapia de vírus Oncolíticos, dados valiosos poderiam ser extraídos esses conjuntos de dados em Neste contexto. É claro que o potencial poderoso para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos não foi totalmente explorado.
Uma infinidade de plataformas de vírus Oncolíticos... estão a ser testadas em estudos pré-clínicos e clínicos incluindo herpes simplex vírus, reovírus e vaccinia vírus, que têm tido sucesso demonstrável em experimentações clínicas do tarde-estágio. Para a maioria destas plataformas, esforços tem sido direcionados para alterar a genoma do vírus para melhorar a terapia. Por exemplo, para aumentar a especificidade do tumor, genes de vírus específicos foram excluídos ou uma mutação para restringir significativamente a replicação viral em células normais, mas não em células tumorais. Em alguns casos, transgenes foram adicionados como GM-CSF (fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos) para potencializar a resposta imune ou NIS (iodeto de sódio symporter) para permitir que vivo em imagem e absorção celular radioiodide para terapêutica fins. No entanto, tem havido muito pouco trabalho focado em genes do hospedeiro/tumor a manipular e explorar o impacto dos genes do hospedeiro/tumor na replicação de vírus Oncolíticos. Com o advento da tecnologia de rastreio com throughput alto, agora é possível sondar interações hospedeiro-vírus à escala do genoma e a decifrar as oportunidades para manipular o genoma do hospedeiro para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos (revisado em16, 17,,18).
Nós relatamos o primeiro estudo demonstrando prova de conceito para a utilização da elevado-produção genética de rastreio para identificar alvos de anfitrião que podem ser manipulados para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos. Para descobrir genes de anfitrião que modulam Marabá vírus oncolysis, um Rhabdovírus Oncolíticos atualmente está sendo testado em fase I e ensaios II, realizamos telas de RNAi todo o genoma em três linhas de células de tumor diferente em duplicado com um siRNA (RNA de interferência curto) biblioteca de direcionamento de genes 18.12015. Caminho análise de acertos identificados nas telas revelou enriquecimento de membros das vias resposta stress ER (retículo endoplasmático). Nós selecionamos 10 sucessos dentro destes caminhos para validação secundário usando siRNA com sequências alvos diferentes da tela principal. Como parte da validação do terciária, foi realizado um experimento de resgate com IRE1α (inositol-requerendo alfa de enzima 1) para confirmar que o hit foi no alvo. In vitro e em vivo testando usando um inibidor de pequena molécula de IRE1α resultaram em eficácia Oncolíticos dramaticamente melhorada.
Workenhe et al . 12 também conduziu a uma tela de RNAi genoma-larga usando um pool particulas de Lentivirus shRNA (curto grampo do RNA) biblioteca visando 16.056 genes para identificar fatores do hospedeiro restringindo o vírus humano herpes simplex tipo 1 (HSV-1) mutante mediada por KM100 oncolysis da mama. células cancerosas. Na tela principal, eles identificaram 343 genes o nocaute de que levam ao aprimorado citotoxidade de células infectadas KM100 sobre células infectadas por simulação; Eles selecionaram 24 destes genes para validação secundária. Fora os 24 genes, 8 genes foram confirmados na tela secundária com um deles sendo SRSF2 (arginina e serina-rich splicing factor 2), que foi posteriormente confirmada usando um experimento genético de resgate durante a validação terciária. O grupo passou a identificar um DNA topoisomerase inibidor de quimioterápicos que reduziu a fosforilação de SRSF2 e mostrou que o tratamento de combinação de HSV-1 KM100 com essa pista de inibidor de sobrevivência prolongada dos ratos de tumor-rolamento do TUBO.
Nos estudos acima mencionados, seguiu-se um fluxo de trabalho semelhante. Cada um começou com uma tela de RNAi genoma-largo principal seguida por uma tela secundária em um seleto número de sucessos identificados na tela principal. Este foi seguido por estudos de validação terciária, que incluía confirmando que o acerto no alvo realizando genética resgatar experimentos in vitro com final validação executada manipulando o alvo gene produto em vivo. Neste artigo, nós primeiro fornecer um protocolo geral para o desenvolvimento e validação de um ensaio de siRNA-rastreio de alto rendimento, que envolve determinar as condições ideais de transfeccao, quantidade de vírus e comprimento de infecção. Oferecemos também um protocolo detalhado para a realização de uma primária, uma tela de siRNA de alto rendimento, bem como uma descrição geral do método para executar validação de tela secundária e terciária validação.

<table><tbody><tr><td>Consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA biblioteca</td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning placa de 384 poços</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon placa de 384 poços</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water Sigma</td><td></td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Controle Negativo siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SiRNA não direcionado Pool # 2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / GLICOSE ALTA</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução HEPES (1M)</td> <td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina 100X</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modificado</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio Resazurin</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído (37% em peso)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de 500 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>Filme</tr> de <tr><td>vedação adesivo 430282 para microplacas</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>Folha de selagem a quente destacável</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Dispenser</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Catálogo Número</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (dispensador de líquidos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT leitor de placas</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx Braço Robótico</td><td>Análise e Automação de Pico (anteriormente Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Automatizada Cytomat Série 24C</td> Estação de Trabalho Automatizada <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Carrossel</td><td>de Placas Análise e Automação de Pico (anteriormente Peak Robotics)</td><td>Selador</td> de placas N/A <td></td></tr><tr><td>Alps 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

rastreio de rnai todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus oncolíticos terapia

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Tecnologia de rastreio do elevado-throughput todo o genoma RNAi (RNA de interferência) foi amplamente utilizada para descobrir os fatores do hospedeiro que afetam a replicação do vírus. Aqui apresentamos a aplicação desta tecnologia para descobrir destinos de host que modulam especificamente a replicação do vírus de Marabá, um Rhabdovírus Oncolíticos e vírus vaccinia, com o objetivo de reforçar a terapia. Enquanto o protocolo foi testado para uso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, esta abordagem é aplicável a outros vírus Oncolíticos e também pode ser utilizada para identificar alvos de anfitrião que modulam a replicação do vírus em células de mamíferos em geral. Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio para a seleção de RNAi da elevado-produção em células de mamíferos, as considerações-chave e as etapas de preparação importantes para a realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária e um guia passo a passo para realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária; Além disso, ele amplamente descreve os métodos para a realização de estudos terciários de validação e validação de ecrã secundário. O benefício do elevado-throughput RNAi triagem é que permite que um de catalogar, de forma ampla e imparcial, fatores do hospedeiro que modulam a qualquer aspecto da replicação do vírus para o qual se pode desenvolver um ensaio em vitro como infectividade, estourou o tamanho, e citotoxicidade. Tem o poder para descobrir bioterapêutico metas imprevistas, com base no conhecimento atual.

Uma visão geral do fluxo de trabalho para identificar alvos de anfitrião para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos é apresentada na Figura 1.
Conforme ilustrado na Figura 1, o primeiro passo fundamental para a condução de uma tela de RNAi elevado-throughput é desenvolvimento de ensaio. Figura 2A fornece um layout de placa de amostra para...

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

O objetivo geral deste protocolo é identificar alvos hospedeiros que podem ser manipulados para melhorar a terapia com vírus oncolíticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia com vírus oncolíticos, como quais fatores específicos do hospedeiro e vias celulares modulam a replicação do vírus oncolítico. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite identificar alvos do hospedeiro que podem ser manipulados para melhorar a terapia com vírus oncolíticos de maneira abrangente e imparcial.Este protocolo também pode ser utilizado para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação do vírus em geral. Depois de desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento de acordo com o protocolo de texto, remova um lote de placas de microtitulação do freezer e deixe-as descongelar por 20 a 30 minutos. Enquanto isso, encha duas garrafas com etanol a 70% e, em seguida, encha dois tubos cônicos de 50mL com PBS e um com água destilada.Mergulhe o tubo dispensador de líquido em uma garrafa de etanol 70% e coloque um pedaço de fita adesiva ao redor do tubo para marcar o ponto abaixo do qual o tubo pode ser considerado estéril. Use aproximadamente 25mL d

genome-wide-rnai-screening-to-identify-host-factors-that-modulate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Novos fatores hospedeiro envolvidos na infecção viral podem ser identificados através de células baseado em perda de todo o genoma da função de triagem RNAi.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

Aqui usamos uma biblioteca LentiPlex humanos agrupados e tradicionais métodos de seqüenciamento de genes para identificar alvos promover a sobrevivência celular. Demonstramos como configurar e deconvolute uma tela LentiPlex e validar os resultados.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Apresentamos um protocolo para demonstrar um sistema de transferência de gene somática romance utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato para estudar a função dos genes em metástase. Os retrovírus aviária são entregues intracardiacally para garantir a transferência de genes em lesões pré-malignas, não-invasivas de células β do pâncreas em ratos adultos.

Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela RIP-Tag; RIP-tva modelo murino

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).

Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

A mutagênese insercional é uma ferramenta essencial na genética direta para identificar elementos genômicos funcionais. Aqui, descrevemos a Tela baseada em inserção para elementos funcionais e transcritos (InSET), um método para detectar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus.

Identificação de locais de integração de lentivírus funcionalmente relevantes em uma biblioteca de células de mutagênese insercional

Aprenda a realizar rastreamento de RNAi de alto rendimento para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação viral e potencializam a terapia com vírus oncolíticos em linhagens tumorais.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

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