Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

O objetivo geral deste protocolo é identificar alvos hospedeiros que podem ser manipulados para melhorar a terapia com vírus oncolíticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia com vírus oncolíticos, como quais fatores específicos do hospedeiro e vias celulares modulam a replicação do vírus oncolítico. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite identificar alvos do hospedeiro que podem ser manipulados para melhorar a terapia com vírus oncolíticos de maneira abrangente e imparcial.

Este protocolo também pode ser utilizado para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação do vírus em geral. Depois de desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento de acordo com o protocolo de texto, remova um lote de placas de microtitulação do freezer e deixe-as descongelar por 20 a 30 minutos. Enquanto isso, encha duas garrafas com etanol a 70% e, em seguida, encha dois tubos cônicos de 50mL com PBS e um com água destilada.

Mergulhe o tubo dispensador de líquido em uma garrafa de etanol 70% e coloque um pedaço de fita adesiva ao redor do tubo para marcar o ponto abaixo do qual o tubo pode ser considerado estéril. Use aproximadamente 25mL de etanol a 70% para preparar a tubulação. Despeje etanol adicional na garrafa para repor o volume perdido e, em seguida, deixe o tubo descansar no etanol por no mínimo cinco minutos.

Depois de preparar a coifa de cultura de células, centrifugue as placas seladas e os endurecimentos a 1026 vezes G em temperatura ambiente por dois minutos. Em seguida, remova as vedações das placas. Em seguida, pipete a quantidade necessária de reagente de transfecção nos tubos cônicos que contêm o diluente de reagente de transfecção pré-aquecido.

Comece a tripsinizar as células aspirando o meio de cada placa. Use nove mL de PBS para enxaguar as células e, em seguida, pipetar três mL de tripsina por placa. Incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos.

Em seguida, use 22mL de meio para ressuspender as células pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Combine a suspensão celular de cada placa de cultura de tecidos em um frasco estéril e misture a suspensão celular invertendo o frasco. Em seguida, pipete um mL de aliquats na suspensão celular em dois tubos de microcentrífugas separados.

Remova a amostra de cada tubo de microcentrífuga e conte as células. Em seguida, calcule o volume de suspensão celular necessário para a densidade necessária e prepare uma suspensão celular diluída suficiente para dispensar em um lote de placas. Enquanto as células estão sendo preparadas, esvazie o tubo do dispensador de líquido de etanol.

Use aproximadamente 25mL de PBS para preparar o tubo e, em seguida, esvazie o tubo. Certifique-se de que a parte do tubo que será imersa no reagente de transfecção e, posteriormente, na suspensão celular, seja mantida estéril. Separe as placas que podem ser feitas com segurança com um tubo cônico de solução reagente de transfecção.

Pipete as soluções reagentes de transfecção para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, use a solução para preparar a tubulação antes de dispensar 5 microlitros por poço. Centrifugar as placas a 1026 vezes G à temperatura ambiente durante um minuto.

Em seguida, incubar as placas à temperatura ambiente durante o tempo prescrito para o reagente de transfecção que está sendo usado. Durante a incubação, esvazie o tubo da solução reagente de transfecção e coloque-o em um tubo cônico cheio de 50mL contendo PBS. Em seguida, use aproximadamente 25mL de PBS para enxaguar o tubo, preparando-o e esvaziando-o.

Misture o frasco contendo a suspensão celular, coloque o tubo na suspensão e prepare o tubo o suficiente para ver se cada ponta está sendo dispensada corretamente. Dispense 30 microlitros por poço da suspensão celular em todas as placas. Esvazie a suspensão celular do tubo e, em seguida, enxágue o tubo com aproximadamente 25mL de PBS seguido de aproximadamente 50mL de água destilada.

Deixe as placas em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos a partir do momento da semeadura celular. Em seguida, incube as placas em uma incubadora não perturbada para o comprimento desejado de silenciamento de genes. Para economizar tempo, no dia anterior à infecção das células, pipete em frascos estéreis a quantidade exata de meio necessária para infectar cada lote de placas, incluindo meio para poços não infectados.

Aqueça o meio a 37 graus Celsius e, em seguida, encha duas garrafas com etanol a 70%, dois tubos cônicos de 50mL com PBS e um com água destilada. Esterilize a tubulação com etanol a 70%, conforme demonstrado anteriormente. Enquanto o tubo está parado no etanol, primeiro vortex o vírus e, em seguida, pipeta o volume preciso de vírus necessário para o frasco de meio de infecção.

Em seguida, enxágue o tubo usando 25mL de PBS para prepará-lo e esvazie-o. Depois de remover as placas da incubadora, coloque-as na capa de cultura de tecidos. Use o meio para preparar a tubulação e, em seguida, dispense 40 microlitros de meio nos poços de controle não infectados.

Esvazie o tubo do meio e use 25mL de PBS para enxaguá-lo. Depois de misturar o vírus, coloque o tubo no frasco que contém o vírus, dispense 40 microlitros de vírus nas placas. Centrifugue as placas a 400 vezes G em temperatura ambiente por 30 minutos.

Incube as placas pelo período de tempo previamente determinado. No dia anterior à fixação, prepare um frasco de solução fixadora contendo quatro por cento de formaldeído e PBS para cada lote de placas, mas omita a coloração de Hoechst. Guarde a solução no armário inflamável, longe da luz.

No dia seguinte, use etanol a 70% e PBS para enxaguar o tubo, conforme demonstrado anteriormente. Dispense 30 microlitros da solução em todas as placas e coloque as placas na incubadora por 30 minutos. Após a incubação, aplique as vedações nas placas e armazene-as a quatro graus Celsius protegidas da luz.

Realize imagens e análises de acordo com o protocolo de texto. Aqui são mostradas 786 células O coradas com Hoechst 33342 após uma incubação de 72 horas apenas com diluente reagente de transfecção. Reagente e diluente de transfecção, siRNA não direcionado e com siRNA direcionado a PLK1.

O gráfico de sobrevivência visto aqui indica que 22% das células transfectadas com siRNA PLK1 sobreviveram e 94% das células transfectadas com siRNA não alvo sobreviveram. Este gráfico mostra os resultados do curso ao vivo de 786 células O infectadas com o vírus vaccinia oncolítico expressando GFP aumentada em vários MOIs. Imagens representativas de células infectadas em um MOI de 0,05 ao longo de um curso de tempo real são mostradas aqui.

Um período de incubação de 21 horas permitiria detectar aumentos e diminuições na propagação, pois o ponto de tempo está dentro de uma faixa linear. Após triagens de RNAi em todo o genoma em três linhagens de células tumorais, 1008 ocorrências comuns a pelo menos duas das três linhas de células cancerígenas foram identificadas usando o método MAD. 10 acertos dentro das vias UPR e ERAD foram selecionados para validação secundária via siRNA com diferentes sequências de direcionamento.

Ao dispensar reagentes, é fundamental que você tenha o lote correto de placas, tenha selecionado o volume correto para dispensação e que a tubulação tenha sido preenchida com o reagente correto e esteja sempre totalmente submersa no reagente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir uma triagem de RNAi de alto rendimento para identificar alvos do hospedeiro que podem ser manipulados para aprimorar a terapia com vírus oncolíticos ou para identificar fatores do hospedeiro que modulam a replicação do vírus em geral.