Name: Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a produzir vetores lentivirais deficientes em integrase para entrega de CRISPR/Cas9 em células HEK-293T. Este protocolo otimizado permite edição gênica eficiente e segura in vitro e in vivo.

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Gostaríamos de agradecer o departamento de neurobiologia, Duke University School of Medicine e gabinete do reitor para a ciência básica, Duke University. Agradecemos também a membros do núcleo do vetor Viral Duke para comentários sobre o manuscrito. Plasmídeo pLenti CRISPRv2 foi presente do Feng Zhang (Broad Institute). O sistema de LV-embalagem, incluindo o psPAX2 de plasmídeos, VSV-G, pMD2.G e pRSV-Rev foi um presente tipo de Didier Trono (EPFL, Suíça). Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido pela Universidade de Carolina do Sul escola de medicina, conceda RDF18080-E202 (Rafaella).

1. cultivo de células HEK-293T e propagação de células para transfeccao
Nota: Rim embrionário humano 293T (HEK-293T) as células são cultivadas em DMEM, mídia de alta glicose suplementada com soro 10% bezerro suplementado com promotores de crescimento e de ferro e 1 x solução de antibiótico antimicótico (100 x de solução contém 10.000 penicilina unidades estreptomicina 10 mg e 25 µ g anfotericina B por mL). A mídia também é complementada com piruvato de sódio 1 x, 1 x mix de aminoácidos não-essenciais e 2 mM L-glutamina (dipeptídeo de estoque 200 mM L-alanil-L-glutamina em 0,85% NaCl). As células são cultivadas em placas de cultura de tecidos de 100mm (área de superfície aproximada de crescimento é 55 cm ²). Uma relação de cultivo sub de 01:10 é usada com sub cultivo a cada 2-3 dias. Tripsina-EDTA 0,05% é usado para a dissociação das células entre passagens. Para manter a consistência entre as experiências, recomendamos testes soros de bezerro quando se muda para um novo lote/lote e monitorar quaisquer alterações no crescimento celular, eficiência de transfeccao e produção de vetores.
<ol><li>Inicie uma nova cultura usando células de baixa passagem (é recomendável não usar células após passagem 15 ou se o crescimento desacelera) por semeadura em uma placa de cultura de tecido de 10 cm. Use DMEM suplementado com 10% de soro para o crescimento da célula. Desenvolvem-se células a 37 ° C com 5% CO2 em uma incubadora de padrão de cultura de tecidos. Use um padrão hemocytometer para contar células para todas as etapas subsequentes.</li>
	<li>Uma vez que as células alcançar 90-95% crescimento confluente, nova propagação em 15 cm placas de cultura de tecidos (abaixo, passos 1.3 - 1.5).</li>
	<li>Para propagar novamente, Aspire mídia da placa confluente e suavemente Enxague com PBS 1x estéril. Células com 2 mL de reagente uma dissociação (por exemplo, do Trypsin-EDTA), incubar a 37 ° C, durante 3-5 min. Adicione 8 mL de mídia contendo soro para inactivar o reagente de dissociação e triture 10 - 15 vezes, com uma pipeta de 10 mL serológico para criar uma única célula suspensão. Ressuspender as células nos meios de cultura para obter uma densidade de célula de aproximadamente 4 x 106 células/mL.</li>
	<li>Para aumentar a aderência ao substrato, pre-revesti as placas de 15cm com 0,2% de gelatina, adicionar 8 mL de gelatina por placa. Espalhe uniformemente em toda a superfície da placa, incubar a temperatura ambiente por 10 min e desviar o líquido.</li>
	<li>Trazer o volume total de cada prato para 25 mL com morna (37 ° C) mídia HEK-293 T (ver nota no passo 1) e as placas de sementes adicionando 2,5 mL de células (total ~ 1 x 107 células/placa). Incube as placas a 37 ° C com 5% CO2 durante a noite ou até que seja alcançada a confluência de 70-80%. Nota: Até seis placas de 15cm pode ser usado para a produção. Ajuste o volume dos meios de comunicação por placa de ~ 20-22 mL ao usar mais do que quatro placas (consulte a etapa 5 do protocolo de justificação).</li>
</ol>2. transfecting HEK-293T células usando um protocolo baseado em fosfato de cálcio
<ol><li>
Reagentes de transfecção
	<ol>
<li>Para preparar 2 x solução tampão BES BBS (50mm BES, 280 mM de NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), combinar 16,36 g de NaCl, 10,65 g de BES (N, N-bis (2-hidroxietil) -2-amino-ácido etanesulfónico) e 0,21 g de Na2HPO4. Adicionar bidestilada H2O (dd-H2O) até 900 mL. Dissolver, titula-se pH 6,95 com 1 M de NaOH e trazer o volume até 1 L. Filter, via unidade de filtro 0.22 µM. Loja a-20 ° C.</li>
		<li>Prepare 1M CaCl2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 µM. Loja a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observe as placas que foram semeadas um dia antes. As células estão prontas para transfeccao quando atingem a confluência de 70-80%.</li>
	<li>Aspirar a velha mídia das placas e suavemente adicionar mídia recém-preparado sem soro. Nota: Ver Arquivo complementar 1-plasmídeos para obter detalhes sobre os plasmideos escolhidos e sua preparação.</li>
	<li>Prepare a mistura do plasmídeo, plasmídeos alíquotas os quatro em um tubo cônico de 15 mL. Para uma preparação de prato único de 15 cm, use 37,5 µ g do CRISPR/Cas9-transferência vector (pBK198 ou pBK189), 25 µ g de pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µ g pMD2.G e 6,25 µ g de pREV (Figura 1C).</li>
	<li>Adicione 312,5 µ l 1M CaCl2 à mistura do plasmídeo. Para isso, adicione a 1,25 mL de estéril dd-H20.</li>
	<li>Lentamente (drop-wise), adicione 1,25 mL de solução de x BBS 2 enquanto num Vortex mistura. Incube durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione a mistura de transfeccao gota a gota para cada placa de 15 cm (2,5 mL por placa). Agitar suavemente o frasco as placas e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 2-3 h. Depois disso, adicionar 2,5 mL (10%) soro por placa e continuar incubando durante a noite (12-18 h). Nota: Alguns laboratórios usam 3% CO2 incubadoras para estabilizar o pH de mídia. No entanto, não observamos qualquer diferença na eficiência de transfeccao entre 3% e 5% de CO2. Além disso, o tamanho do CaPO4 precipita é crucial para a eficiência do transfection; a mistura de transfeccao tem de ser limpo antes de sua adição para as células. Se a mistura torna-se nublado durante a incubação, prepare-se fresco 2 x BBS (pH = 6,95).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig2v2.jpg"> Figura 2: concentração de partículas virais usando gradiente protocolo duplo-sacarose. Partículas virais colhidas o sobrenadante (SN) são carregadas em gradiente gradiente de sacarose. soluções de sacarose de 70%, 60%, 30% e 20% são usadas para criar o gradiente. Após centrifugação, as partículas coletadas de fracções de sacarose a 30-60% são carregadas em uma almofada de sacarose 20% mais e precipitadas. O pellet final contendo partículas virais purificadas é resuspended em 1X PBS para uso mais (ver texto para mais detalhes). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. o dia depois do Transfection
<ol><li>Observe as células para garantir que eles estão se aproximando de confluência de 100% neste ponto com pouca ou nenhuma morte celular. Substitua a mídia adicionando-se 25 mL de DMEM fresco + 10% de soro para cada placa. Continue a incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para um adicional 48 h. Nota: Ajuste o volume de mídia na etapa 3.1 se usando mais do que seis placas de 15 cm (ver passo 5.2, nota).</li>
</ol>4. colheita de vírus
<ol><li>Recolha o sobrenadante cuidadosamente todas as placas de cultura de tecido contendo as células transfectadas usando uma pipeta de cultura de tecido estéril 10 mL e piscina em tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Limpe a suspensão por centrifugação a 400-450 x g durante 10 minutos utilizando uma centrífuga do tabletop. Filtre o sobrenadante através de uma unidade de vácuo filtro de 0,45 µm. Nota: O sobrenadante filtrado pode ser armazenado a 4 ° C por até 4 dias antes de prosseguir com a concentração, ou aliquotadas e armazenado a-80 ° C. Uma concentração esperada de IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (não concentrado) virais preparações deve ser ~ 2 x 107 TU/mL (consulte a etapa 6 para determinação de título). No entanto, evite sujeitar os preparativos virais de vários ciclos de gelo-degelo, como cada rodada de congelamento e degelo resulta em uma perda de 10-20% de concentração funcional.</li>
</ol>5. concentração de partículas virais por ultracentrifugação
Nota: Utilizamos um método duplo-sacarose de purificação que envolve duas etapas: uma etapa de gradiente de sacarose e um passo de almofada de sacarose (Figura 2).
<ol><li>Carregar os tubos cónicos ultracentrifugação na seguinte ordem para criar um gradiente de sacarose: 0,5 mL 70% de sacarose (dissolvido 1X PBS), sacarose de 60% de 0,5 mL (dissolvido em DMEM), sacarose 30% de 1 mL (dissolvido em DMEM) e sacarose 20% de 2 mL (dissolvido em 1X PBS).</li>
	<li>
Adicione cuidadosamente o sobrenadante contendo vírus para o gradiente. Como o volume total de sobrenadante de quatro placas de 15 cm de 100 mL, use seis tubos de ultracentrifugação por spin para processar todo o volume do vírus sobrenadante.
	<ol>
<li>Cada tubo de ultracentrifugação utilizado para esta etapa tem uma capacidade volumétrica de até 30 mL (incluindo o volume de sacarose), distribuir o sobrenadante viral igualmente entre tubos, deixando pelo menos 10% headspace para evitar derrame.</li>
		<li>Ajuste o volume de cultura de ~ 20-22 mL por placa ao usar mais do que quatro placas de 15cm para cada experimento, para que o volume final do líquido sobrenadante viral em pool facilmente pode ser acomodado dentro de seis tubos de ultracentrifugação.</li>
		<li>Preenchimento ultracentrifugação tubos pelo menos três quartos de sua capacidade de volume total, caso contrário ruptura de tubos pode ocorrer durante a centrifugação, resultando em possível perda de amostra e/ou equipamento de danos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Equilibrar os tubos com 1X PBS e centrifugar as amostras a 70.000 x g durante 2 h a 17 ° C (ver Tabela de materiais para obter detalhes do rotor). Nota: Para evitar o rompimento da camada de sacarose durante a aceleração, defina o se lentamente acelerar o rotor até 200 rpm durante o primeiro 3 min do spin. Da mesma forma, defina o se para desacelerar lentamente o rotor de 200 rpm para 0 rpm mais 3 min no final do spin.</li>
	<li>Cuidadosamente colete frações de 30-60% de sacarose em tubos limpos (Figura 2). Adicionar 1 frio x PBS para as frações em pool e levar o volume a 100 mL; Misture pipetando subindo e descendo várias vezes.</li>
	<li>Prossiga para a etapa de coxim de sacarose por camadas cuidadosamente a preparação viral em uma almofada de sacarose. Para isso, adicione 4 mL de sacarose 20% (em 1X PBS) para o tubo, seguido de ~ 20-25 mL da solução de viral por tubo. Se os tubos estão a menos de três quartos completo, top-up com PBS 1x estéril.</li>
	<li>Cuidadosamente, equilibrar e centrifugar as amostras a 70.000 x g durante 2 h a 17 ° C, como antes. Decantar o sobrenadante e permitir que o restante liquido seja invertendo-se os tubos em papel toalha.</li>
	<li>Aspire as gotas restantes a fim de remover todo o líquido da pelota. Neste passo, os pellets contendo vírus devem ser pouco visíveis como pequenas manchas translúcidas.</li>
	<li>Resuspenda pelotas adicionando 70 µ l de PBS 1x para o primeiro tubo e completamente pipetagem da suspensão, posteriormente transferindo a suspensão para o próximo tubo e mistura como antes, continuando até que todas as pelotas são resuspended.</li>
	<li>Lave os tubos com um adicional 50 µ l de frio 1X PBS e mistura como antes. Certifique-se que o volume combinado da suspensão final é ~ 120 µ l e aparece ligeiramente leitoso; limpá-la por centrifugação a 10.000 x g, durante 30 s na microcentrifuga do tabletop.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco, fazer 10 alíquotas µ l e armazená-los a-80 ° C. Nota: Evite realizar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento nas amostras de Lentivirus. Exceto quando a centrifugação é necessária, esforços devem ser feitos para realizar as etapas restantes em capas de cultura de tecidos, ou designados quartos de cultura de tecidos utilizando medidas de biossegurança adequadas (ver discussão).</li>
</ol>6. estimativa da concentração Viral
<ol><li>
p24 -enzima-lig da imunoabsorção método de ensaio (ELISA) Nota: O ensaio é realizado utilizando placas de 96 poços de ligação de alta como de acordo com as instruções do programa de vacina de AIDS NIH para HIV-1 p24 ensaio de captura de antígeno Kit (veja a Tabela de materiais) com modificações29.<ol>
<li>No dia seguinte, lavar os poços três vezes com 200 µ l 0,05% Tween 20 em PBS frio (solução de PBS-T). Cubra o prato com 100 µ l de anticorpo monoclonal anti-p24 a uma diluição de 1:1500 em PBS 1x e incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Para eliminar a ligação não-específica, bloquear a placa com 200 µ l 1% BSA em PBS; lavar três vezes com 200 µ l 0,05% Tween 20 em PBS frio (solução de PBS-T) pelo menos 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>
Preparar amostras: Para preparações de vetor concentrado, diluir 1 µ l da amostra 100-fold adicionando µ l 89 de dd-H20 e 10 µ l de Triton X-100 (concentração final de 10%). Para as preparações não concentrado, prepare dez vezes amostras diluídas (adicionar 80 µ l de dd-H20 e 10 µ l de Triton X-100 (concentração final de 10%) a 10 µ l da amostra). Nota: As amostras podem ser armazenadas a-20 º C a este passo por um longo período de tempo para uso posterior.</li>
		<li>Prepare padrões de HIV-1, aplicando uma diluição serial 2 vezes (com uma partida concentração 5 ng/mL).</li>
		<li>Diluir o concentrado de amostras (a partir de ações pré-diluído 1: 100) em RPMI 1640 suplementado com 0,2% Tween 20 e 1% de BSA para estabelecer 01:10, 000, 01:50, 000 e diluições de 1:250,000. Diluir as amostras não concentrado (de 01:10 pré-diluído estoques) em RPMI 1640 suplementado com 0,2% Tween 20 e 1% de BSA para estabelecer diluições de 1: 500, 1:2500 e 1:12,500.</li>
		<li>Aplicação das amostras da placa em triplica e incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>No dia seguinte, lavar os poços seis vezes e incubar a 37 ° C por 4 h com 100 anticorpo anti-p24 polyclonal µ l, diluído 1: 1000 em RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% de BSA e soro normal do rato de 2% (NMS).</li>
		<li>Lave seis vezes como acima e incubar a 37 ° C, durante 1 h com peroxidase de rábano de anticabra coelho 1:10,000 IgG diluído em RPMI 1640 suplementado com soro de cabra normal de 5%, 2% NMS, BSA de 0,25% e 0,01% Tween 20.</li>
		<li>Lave a placa, como acima e incubar com substrato de peroxidase TMB em temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Pare a reação adicionando-se 100 µ l de 1 N HCL. Medir a absorvância da amostra a 450 nm, utilizando a absorvância da placa leitor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medição da intensidade de repórter fluorescentes
	<ol>
<li>Método de FACS Nota: A medida da depleção de sinal GFP nas células pode ser estimada com precisão, medindo a intensidade média de fluorescência das células transduzidas através de citometria de fluxo. Refira por favor o papel recente 28 para análise de dados de FACS, apresentação e interpretação. O protocolo é descrito da seguinte maneira.<ol>
<li>Faça uma diluição serial dez vezes da preparação (a partir de 10-1 a 10-5) da preparação viral em 1X PBS.</li>
			<li>Sementes de aproximadamente 5 x 105 293T células em cada poço de uma placa de 6 em um volume final de 2ml por bem. Adicionar 10 µ l de cada diluição viral para as células e incubar as células a 37 ° C por 48 h.</li>
			<li>Colheita de células para análise de FACS como segue: Adicionar 200 µ l de solução de tripsina-EDTA 0,05% e incubar as células a 37 ° C por 5 min. adicionar 2 mL de uma mídia DMEM completa e coletar amostras em tubos cônico de 15 mL.</li>
			<li>Células de pelotas por centrifugação a 400 x g a 4 ° C e resuspenda o pellet em 500 µ l de PBS 1x frio.</li>
			<li>Para fixação, adicionar um volume igual de solução de formaldeído de 4% para essa suspensão e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
			<li>Células fixas de pelotas e ressuspender em 1 mL de 1X PBS. Analisar a expressão de GFP, usando um instrumento de FACS, conforme descrito em Ortinski et al . 28 brevemente, use a seguinte fórmula para determinar o título funcional do vírus: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56915/56915eq1.jpg"> Nota: Aqui Tg = número de células GFP-positivo contado; TN = número total de células contadas; N = número total de células transfectadas; V = volume (em µ l) usado para a transdução. Por exemplo: se 1 x 106 células foram transfectadas com 10 µ l de vírus, 2 x 104 células foram contados e 5 x 103 eram GFP-positivo, com base na equação acima o título funcional seria: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56915/56915eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Contagem de células GFP-positivo<ol>
<li>Calcule a multiplicidade de infecção (MOI) usada para a transdução. Teste uma gama ampla de MOIs (1-10), com o aumento da MOIs, resultando em uma maior eficiência de transdução.</li>
			<li>Antes de transfeccao, sementes de uma placa de 6 com aproximadamente 3-4 x 105 células por poço. Uma vez que alcança as células > transduce de confluência de 90% (normalmente dentro de 24 h), com o vírus purificado a MOIs pré-determinado.</li>
			<li>Incube a placa a 37 ° C com 5% CO2 em uma padrão cultura de tecidos e células de monitor em intervalos regulares para 1-7 dias para mudanças no sinal GFP.</li>
			<li>Contar o número de células GFP-positivo com um microscópio fluorescente (plano 4 X objetivo, N.D. 0.1, ampliação de 40 X) equipado com um conjunto de filtro GFP (excitação de comprimento de onda-470 nm, emissão de onda-525 nm), usando o ingênuo células (un-transduzidas) para definir a população de células GFP-negativo e positivas.</li>
			<li>Estime o título final ajustando para o fator de diluição e o volume, usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56915/56915eq3.jpg"> Nota: Aqui, N = número de células GFP-positivo, D = factor de diluição, M = fator de ampliação (geralmente 20 X), V = volume de vírus usada por transdução. Por exemplo, para 20 células GFP-positivo (N), contadas a uma diluição de 10-4 (01:10, 000) em uma amostra de 10 µ l (V) a 20 X ampliação (M) (D) resultaria em um título funcional de (20 x 104) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL. (* para ajustar-se por mL)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Patente da USC-499-P (1175) foi arquivado pela Universidade da Carolina do Sul em relação ao trabalho descrito neste manuscrito.

IDLVs começaram a emergir como o veículo de escolha para na vivo gene-edição, especialmente no contexto de doenças genéticas, devido em grande parte para o baixo risco de mutagênese associado a estes vetores, em comparação com a integração de plataformas de entrega22 , 28. no manuscrito atual, nós procuramos detalhar o protocolo associado com a produção do sistema melhorada para a IDLV-CRISPR/Cas9 tudo-em-um que foi recentemente desenvolvido em nosso lab...

Edição de gene preciso constitui a pedra angular das grandes avanços biomédicos que envolvem o desenvolvimento de novas estratégias para combater doenças genéticas. Na vanguarda das tecnologias de edição de gene é o método baseando-se no uso do cabrilhantado regularly -eunterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que foi inicialmente identificado como um componente da imunidade bacteriana contra a invasão de material genético viral (revisto em referências1,2). Uma grande vantagem do sistema CRISPR/Cas9 sobre outras ferramentas de edição de gene, como nucleases dedo de zinco (ZFNs) e as nucleases efetoras como ativador da transcrição (TALENs) (revistas em referência3), é a relativa simplicidade de design do plasmídeo e construção de componentes CRISPR — um recurso que tem alimentado a expansão do gene-edição de alguns laboratórios especializados para uma comunidade de pesquisa muito mais ampla. Além disso, a simplicidade de programação CRISPR/Cas9 e sua capacidade de reconhecimento do alvo multiplexado alimentaram ainda mais sua popularidade como uma tecnologia de baixo custo e fácil de usar. Entre os vários métodos disponíveis para pesquisadores entregar tais componentes de edição de gene para as células, vetores virais continuam a ser de longe o sistema mais popular e eficiente.
Vetores de Lentivirus (LVs) têm emergido como o veículo de escolha para entregar os componentes do CRISPR/Cas9 sistema na vivo para diversas aplicações4,5,6,7. Vários recursos chaves fazem LVs uma escolha popular para este processo, incluindo a sua capacidade de infectar células de divisão e não dividindo, baixa imunogenicidade e mínima toxicidade celular (revisto em referência8). Como resultado, a terapia gênica mediada por LV tem sido empregada em tratamentos de doenças infecciosas, tais como o HBV, HIV-1 e HSV-1, bem como na correção de defeitos subjacentes humanas doenças hereditárias, como fibrose cística e degeneração macular neo-vascular 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Além disso, a LVs foram efetivamente modificados para realizar a edição de gene multiplex em distinta loci genômicos usando um vetor único sistema12.
No entanto, a propriedade inerente de LVs para integrar o genoma do hospedeiro pode ser mutagênico e frequentemente desfavorecem sua utilidade como veículos de entrega do transgene, especialmente em situações clínicas. Além disso, desde que integrado estàvel LVs expressam seus transgenes níveis elevados sustentavelmente, este sistema é suficientemente adaptados para a entrega de componentes de edição de gene como CRISPR/Cas9; superexpressão de RNA Cas9-guia (gRNA) e proteínas similares, tais como ZFNs, estão associados com níveis elevados de efeitos fora do alvo, que incluem mutações indesejáveis13,14,15,16 , 17 e que potencialmente pode melhorar a citotoxicidade18. Portanto, para obter precisão edição de gene com efeitos mínimos fora do alvo, é imperativo para design de sistemas que permitem a expressão transiente de gene editando componentes.
Nos últimos anos, uma variedade de plataformas de entrega foram desenvolvidos para expressar transitoriamente CRISPR/Cas9 em células16,19,20,21 (revisto em referência22). Estes incluem métodos que dependem diretamente introduzir Cas9 purificado, juntamente com as guia apropriada RNAs em células, que foi mostrado para ser mais eficaz no gene alvo-edição em comparação com a transfeccao mediada por plasmídeo16. Estudos têm demonstrado que ribonucleoprotein (RNP) complexos consistindo de guia RNA/Cas9 partículas são rapidamente virou depois da mediação de clivagem de DNA em seus alvos, sugerindo que a expressão a curto prazo desses componentes é suficiente para alcançar gene robusto edição16. É concebível, não-integração de plataformas de vetor viral como vetores de vírus adeno-associado (AAVs) podem fornecer uma alternativa viável para entregar máquinas edição de gene em células. Infelizmente, capsids AAV possuem capacidade de embalagem significativamente menor do que o LVs (< 5KB), que dificulta severamente sua capacidade para empacotar o toolkit CRISPR multi-componentes dentro de um único vetor (revisto em referência8). É interessante notar que a adição de compostos que inibem a histona deacetilases (por exemplo, o butirato de sódio23) ou impedir o ciclo celular (por exemplo, cafeína24) foram mostrados para aumentar a concentração de particulas de Lentivirus. Apesar dos progressos recentes, os sistemas de expressão transiente desenvolvidos até agora ainda são impedidos por várias deficiências, tais como a baixa eficiência da produção, que levam a reduzida concentração viral e transdução de baixa eficiência dos vírus gerados através de tais abordagens25.
Vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) representam um grande avanço no desenvolvimento de veículos de entrega de gene, como eles combinam a capacidade de empacotamento de VLS com o benefício adicionado de AAV-como manutenção epissomal nas células. Esses recursos ajudam IDLVs largamente contornar as principais questões associadas com a integração de vetores, vis-à-vis a superexpressão contínua do potencial genotóxico de elementos e mutagenicidade mediada por integração. Foi previamente demonstrado que IDLVs podem ser modificadas com êxito para melhorar a expressão de gene epissomal26,27. Com relação à entrega de mediada por IDLV CRISPR/Cas9, títulos de baixa produção e menor expressão dos genomas episome-suportado em relação a sistemas de Lentivirus integrase-proficiente limita sua utilidade como ferramentas de bona fide para a entrega de genoma-edição construções de transgénicas. Recentemente demonstramos que tanto a expressão do transgene e títulos virais associados à produção de IDLV são significativamente melhorados através da inclusão de binding sites para o fator de transcrição Sp1 dentro da gaveta de expressão viral28. Os IDLVs modificados robustamente suportado gene mediada por CRISPR edição tanto in vitro (em células HEK-293T) e na vivo (no pós mitóticas neurônios), enquanto a indução de mutações de fora do alvo mínimas comparadas com o correspondente mediada por ICLV sistemas de28. Em geral, desenvolvemos um romance, compacto, tudo-em-um kit de ferramentas CRISPR executados em uma plataforma IDLV e descritas as várias vantagens de usar esse veículo entrega para edição avançada do gene.
Aqui, o protocolo de produção do sistema de IDLV-CRISPR/Cas9 é descrito, incluindo as diversas etapas envolvidas em assembly, purificação, concentração e titulação da IDLVs, bem como estratégias para validar a eficácia de gene-edição destes vetores. Este protocolo é facilmente escalável para atender as necessidades de diferentes investigadores e é projetado para gerar com êxito vetores de LV, com uma concentração na faixa de 1 x 1010 transducing unidades (TU) / mL. Os vetores gerados através deste protocolo podem ser utilizados para infectar eficientemente vários diferentes tipos de células, incluindo células-tronco embrionárias difícil-para-transduce, células hematopoiéticas (células T e macrófagos) e culta e vivo em- neurônios injetados. Além disso, o protocolo é igualmente adequado para a produção de vetores de Lentivirus integrase-competente em quantidades semelhantes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> Figura 1: embalagem de IDLV. (a) esquema do tipo selvagem integrase proteína (b) o plasmídeo modificado foi derivado de psPAX2 (ver métodos, construção de plasmídeo para detalhes). Imagem de gel de agarose representante dos clones selecionados para clones mutantes integrase. Preparado usando um isolamento de DNA plasmídeo padrão mini kit de amostras de DNA foram analisadas por digestão com EcoRV e SphI. O clone digerido corretamente (número 5, caixa vermelha tracejada) verificou-se ainda mais por sequenciamento direto (Sanger) para a substituição de D64E em INT. A fita de empacotamento deficiente integrase foi nomeada pBK43. (c) diagrama esquemático do protocolo do transfection transiente empregadas para gerar vetores de IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando 293T células transfectadas com VSV-G, embalagens e fitas do transgene (Sp1-CRISPR/Cas9 tudo-em-um plasmídeo). Partículas virais que brote para fora da membrana celular contêm o RNA completo do vetor (expressado o transgene cassete). A segunda geração do sistema de embalagem-IDLV foi usada, que inclui as proteínas reguladoras Tat e expressão de Rev. Rev é complementada ainda mais de uma gaveta separada (RSV-REV-plasmídeo). Abrev: vírus de repetição, VSV-G, estomatite vesicular LTR-Long-terminal G-proteína, promotor de pCMV-citomegalovírus; Promotor de Rous sarcoma vírus (RSV); RRE-(elemento de resposta Rev). Outros elementos reguladores na gaveta a expressão incluem locais Sp1-obrigatórios, elemento Rev Response (RRE), marmota hepatite vírus Posttranscriptional regulamentar elemento (WPRE), um promotor de 1 α fator núcleo-alongamento (EFS-NC), a embalagem de vetor elemento ψ (psi), promotor de citomegalovírus (CMV) humano e humano U6 promotor. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa Allegra 25R</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>xMark Microplate Leitor de placas de absorbância</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&mu; m unidade de filtro, 500mL</td><td>Corning</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrifugação de fundo cônico</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores de tubo cônico</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti rotor de caçamba oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubos de centrífuga cônicos</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL cônicos tubos de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 poços de alta ligação</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células tratadas com TC de 150 mm com grade de 20 mm</td><td>Placa de cultura tratada com 353025</td><td></td><td></td></tr> TC <tr><td>de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; Unidade de filtro M, 1L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de cultura de tecidos, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de cultura de tecidos, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de cultura de tecidos, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro com lamínulas</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes de cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rim embrionário humano 293T (HEK 293T) células</td><td></td><td></td> ATCC CRL-3216 <td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, meio de alta glicose</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>Solução antibiótica, 100X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido não essencial (NEAA)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mídia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>BES (N, N-bis (ácido 2-hidroxietil) -2-amino-etanossulfônico)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - Gelatina BES</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>p24 Reagentes ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-p24 anticorpo</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Padrões de HIV-1</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>Policlonal coelho anti-p24 anticorpo</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase</td><td>IgG Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>Concentração de trabalho 1:1500</td></tr><tr><td>Soro de camundongo normal, Estéril, 500mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra, Estéril, 10mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Concentração de trabalho 1:1000</td></tr><tr><td>Substrato de peroxidase TMB</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>Concentração de trabalho 1:10.000</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Plasmídeos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Enzimas de restrição</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para a produção de lentivirus vetores integrase deficiente crispr/cas9-mediada gene nocaute em dividir células

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Particulas de Lentivirus vetores são uma escolha ideal para a entrega de componentes de edição de gene de células devido à sua capacidade para estàvel transducing uma ampla variedade de células e mediando a altos níveis de expressão gênica. No entanto, sua capacidade de integrar o genoma celular do hospedeiro aumenta o risco de mutagenicidade insercional e assim gera preocupações de segurança e limita o seu uso em situações clínicas. Além disso, a expressão persistente de gene-editando componentes entregues por estes aumentos de integração-competente Lentivirus vetores (ICLVs) a probabilidade de promíscuo gene alvejar. Como alternativa, foi desenvolvida uma nova geração de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) que aborda muitas dessas preocupações. Aqui o protocolo de produção de uma nova e melhorada plataforma IDLV para edição de genes mediada por CRISPR e lista as etapas envolvidas na purificação e concentração de tais vetores é descrita e sua transdução e gene-edição eficiência usando HEK-293T demonstrou-se células. Este protocolo é facilmente escalável e pode ser usado para gerar IDLVs foram capazes de transducing células in vitro e in vivo. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a produção de ICLVs.

Validação da nocaute-eficiência dos vetores de IDLV-CRISPR/Cas9 Usamos as células GFP-expressando 293T como um modelo para validar a eficiência de nocaute de gene CRISPR/Cas9-mediada. Células GFP + foram geradas pela transdução de células HEK-293T com pLenti-GFP (vBK201a) em um MOI de 0.5 (Figura 3b, painel de "no-virus"). A fita de sgRNA-para-GFP/Cas9 tudo-em-um vetor foi empacotada em partículas IDLV ou ICLV e a eficiência da produção fo...

Descrevemos a estratégia de produção de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) como veículos para a entrega CRISPR/Cas9 para as células. Com uma capacidade de mediar a edição de gene rápido e robusto nas células, IDLVs apresentar um mais seguro e plataforma de vector igualmente eficazes para a entrega do gene comparado com vetores integrase-competentes.

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever a produção e as aplicações potenciais de vetores lentivirais otimizados deficientes em integrase, capazes de entregar transgenes CRISPR/Cas9 a células in vivo e in vitro para edição gênica rápida e eficiente. O CRISPR/Cas é uma plataforma altamente eficaz para edição e manipulação gênica. A seguir, apresenta-se um esboço do protocolo para a produção de vetores lentivirais deficientes em integrase, altamente concentrados e otimizados, para a entrega eficiente de ferramentas de edição gênica CRISPR/Cas.A técnica demonstrou ser muito eficiente em células cultivadas e em neurônios pós-mitóticos. Semeie as células HEK-293T um dia antes da transfeção para que a confluência atinja entre 70 e 80% no dia seguinte. Antes da transfeção, aspire o meio antigo das placas de cultura e adicione meio recém-preparado sem soro.Em um tubo cônico de 15 mililitros, adicione os quatro plasmídeos para preparar uma mistura de plasmídeos para transfeção em uma placa de 15 centímetros. Em seguida, adicione 312,5 microlitros de cloreto de cálcio um molar à mistura de plasmídeos e ajuste o volume para 1,25 mililitro com água estéril bidestilada. Continue adicionando

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.

Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9

O protocolo descreve como gerar myoblasts knock-out usando CRISPR/Cas9, desde o design de guide-RNAs até a clonagem celular e caracterização dos clones knock-out.

Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus

À medida que os protocolos relacionados ao CRISPR se tornam cada vez mais úteis e acessíveis, complicações e obstáculos ainda podem surgir em condições experimentais específicas. Este protocolo descreve a criação de uma linha de células humanas nocaute serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK1/RIP1) que interage com o receptor usando CRISPR/Cas9 e destaca os possíveis desafios encontrados durante esse processo.

Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Aprenda a produzir vetores lentivirais deficientes em integrase para entrega de CRISPR/Cas9 em células HEK-293T. Este protocolo otimizado permite edição gênica eficiente e segura in vitro e in vivo.

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

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