Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes
2 de janeiro de 2018
Complexidade dos sistemas na vivo torna difícil distinguir entre a ativação e a inibição do receptor do entalhe por trans- e cis-ligantes, respectivamente. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em vitro ensaios de agregação de célula para avaliação qualitativa e semi-quantitativa da vinculação de entalhe de Drosophila Trans-ligantes vs cis-ligantes.
O objetivo geral deste ensaio de agregação é avaliar a ligação do receptor Notch com transligantes e sua inibição por cis-ligantes. Este método pode ajudar a responder a uma pergunta-chave: Como o fator genético ou farmacológico afetará a ligação do receptor Notch ao seu ligante e alterará a sinalização? A principal vantagem desta técnica é que ela permite avaliar a ligação trans e cis do receptor Notch com seu ligante.
Curiosamente, sem envolver o efeito de sobreposição do ligante endógeno. Comece a avaliação girando as células receptoras de sinal e ressuspendendo-as no meio de Schneider. Conte as células manualmente usando um hemacitómetro.
Placa cinco vezes 10 elevado ao quinto S2 e células S2-Notch estáveis em cada poço de uma placa de seis poços, em um mililitro por poço de meio de Schneider. Em seguida, adicione 7,5 microgramas de RNA de fita dupla a cada poço e incube as células a 25 graus Celsius por 24 horas. Adicione 0,7 milimolar de sulfato de cobre para induzir a expressão de Notch e incube as células a 25 graus Celsius por três dias.
Após a incubação, conte as células que enviam sinais manualmente usando um hemacitómetro. E placa cinco vezes 10 elevado à sexta célula estável em cada poço de uma placa de seis poços, em um mililitro por poço de meio de Schneider suplementado. Em seguida, adicione 0,7 milimolar de sulfato de cobre para induzir a expressão de ligantes e incube as células a 25 graus Celsius por três horas.
Colha as células de controle S2 e S2-Notch tratadas com RNA de fita dupla por pipetagem suave. E placa 2,5 vezes 10 elevado à quinta células por poço em uma placa de 24 poços. Adicione cinco vezes 10 às quintas células estáveis de tomate S2-Delta ou S2-Serrate a um volume total de 200 microlitros de meio de Schneider suplementado.
Coloque a placa em um agitador orbital a 150 rpm. Após um minuto, misture o conteúdo de cada poço e retire 20 microlitros para contar o número de agregados. Simultaneamente, tire uma imagem representativa sob um microscópio composto invertido usando ampliação de 10x.
Para visualizar as células, coloque a câmera no microscópio e conecte-se ao software para adquirir a imagem. Contar manualmente os agregados utilizando um hemacitómetro. Coloque o prato no shaker.
Repita a aquisição e contagem da imagem após cinco minutos e 15 minutos de agregação. Realize a quantificação de transligação calculando o número de agregados por mililitro entre as células S2 e as células S2-Delta ou S2-Serrate Tomato como um controle de fundo e o número de agregados por mililitro entre as células S2-Notch e S2-Delta ou S2-Serrate Toto. Prepare as células receptoras de sinal plaqueando cinco vezes 10 elevado à quinta célula S2 em cada poço de uma placa de seis poços, em um mililitro por poço de meio de Schneider suplementado.
Adicione 7,5 microgramas de RNA de fita dupla a cada poço e incube a placa a 25 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, cotransfectar as células tratadas com RNA de fita dupla para uma concentração total de DNA de dois microgramas por poço usando um reagente de transfecção comercial. Incubar as células S2 transfectadas transitoriamente a 25 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, adicione sulfato de cobre 0,7 milimolar para induzir a expressão de Notch e dos ligantes e incube a 25 graus Celsius por três dias. Prepare as células de envio de sinal conforme descrito na seção anterior. E, finalmente, execute a agregação entre as células de envio e recebimento de sinal, conforme descrito anteriormente.
Observou-se um aumento acentuado no número de agregados entre um e cinco minutos. Em seguida, o número de agregados continuou a aumentar até 30 minutos, em um ritmo mais lento. Imagens mostrando a agregação em três pontos de tempo demonstram que as células S2-Notch tratadas com RNA de fita dupla EGFP formaram agregados com células S2-Delta, que aumentam em número com o tempo.
Em contraste, shams e células S2-Notch tratadas com RNA de fita dupla formaram agregados mais rapidamente, e os agregados eram cada vez maiores em número. Indicando que a diminuição dos níveis de shams aumentou a transligação de Notch com Delta. A transfecção de quantidades iguais de construções de expressão Notch e Delta em células S2 diminui drasticamente o número de agregados formados entre essas células e as células S2-Delta.
Além disso, diminuir a quantidade de cis-Delta resulta em um aumento no número de agregados. Indicando que na faixa de razões Notch / cis-Delta usadas nesses ensaios, cis-Delta pode inibir a ligação entre Notch e trans-Delta de maneira dependente da dosagem. A quantificação da agregação relativa mostrou uma inibição comparável da agregação após o tratamento com EGFP e simulações de RNA de fita dupla.
Uma vez que todos os reagentes estejam preparados, este ensaio é simples e pode ser executado em poucas horas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para avaliar a ligação do receptor Notch de Drosophila a ligantes trans e sua inibição por ligantes cis, utilizando ensaios de agregação celular in vitro. O método tem como objetivo esclarecer os efeitos de fatores genéticos ou farmacológicos na sinalização Notch.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Transdução de Sinal
Antecedentes
- A sinalização Notch desempenha um papel crucial em diversos processos biológicos.
- A distinção entre interações com ligantes trans e cis é desafiadora in vivo.
- Ensaios in vitro podem fornecer informações mais claras sobre essas interações.
- Este estudo foca-se na dinâmica de ligação do receptor Notch.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a ligação do receptor Notch com ligantes trans.
- Avaliar a inibição do receptor Notch por ligantes cis.
- Compreender como fatores externos influenciam a sinalização Notch.
Métodos Utilizados
- Ensaios de agregação celular in vitro.
- Contagem manual de células utilizando um hemacitômetro.
- Uso do Meio de Schneider para ressuspensão celular.
- Avaliação qualitativa e semi-quantitativa da ligação de ligantes.
Resultados Principais
- O ensaio distingue efetivamente a ligação de ligantes trans e cis.
- Permite a avaliação de influências genéticas e farmacológicas.
- Os resultados indicam a importância das interações entre ligantes na sinalização Notch.
- O método evita os efeitos confundidores de ligantes endógenos.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é uma ferramenta valiosa para o estudo das interações dos receptores Notch.
- Ele aprimora a compreensão dos mecanismos regulatórios na sinalização Notch.
- Essa abordagem pode ser aplicada para investigar mais a fundo sistemas semelhantes de receptor-ligante.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender o equilíbrio entre transativação e inibição cis na sinalização Notch é essencial para a validação de alvos em vias de desenvolvimento e oncologia. Este ensaio permite a redução de riscos mecanicistas ao isolar eventos de ligação receptor-ligante sem interferência de ligantes endógenos, proporcionando confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. A leitura semi-quantitativa facilita decisões de avançar/não avançar para modificadores que afetam as interações Notch-ligante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a medição da ligação trans-ligante Notch e da inibição por ligantes em cis em um sistema controlado.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos ao distinguir interações de ligantes ativadores de inibitórias.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar como perturbações genéticas ou farmacológicas alteram a dinâmica de ligação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo níveis basais de ligação trans e cis.
- Saída Quantitativa: Mede agregados heterotípicos por mL (>6 células), permitindo avaliação reprodutível e semi-quantitativa da ligação do ligante.
- Escalabilidade: Utiliza placas-padrão de 24 poços e agitação orbital, permitindo adaptação a formatos de maior produtividade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona dados de ligação in vitro a resultados de sinalização in vivo por meio da modelagem de mecanismos de competição entre ligantes.
- Redução de Riscos Mecanística: Esclarece se os fenótipos observados decorrem de alterações na ligação trans ou do aumento da inibição cis.
- Avanço com Base em Avaliação de Riscos: Orienta decisões pré-clínicas ao identificar modificadores que alteram o equilíbrio entre trans e cis em direção à sinalização patológica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo dados de ligação que orientam o desenho de ensaios para triagem de moduladores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao isolar a ligação trans-ligante de Notch de efeitos cis interferentes e ligantes endógenos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis (agregados/mL) que permitem comparação entre condições compostas ou genéticas.
- Análises: Gera dados de agregação ao longo do tempo (1, 5, 15, 30 min) para avaliar a cinética de ligação e a potência de inibição.
- Pesquisa Translacional: Relaciona medições de ligação a desfechos fenotípicos mediante a correlação entre a expressão do ligante cis e a supressão da ligação trans.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar qualquer modificador da via Notch em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na sinalização Notch ao quantificar as contribuições dos ligantes trans versus cis.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação da ligação de ligantes por meio de proporções definidas de células, tempo de agregação e contagem manual.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao identificar precocemente se um modulador potencializa ou inibe a sinalização Notch patogênica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seu efeito no equilíbrio de ligação trans/cis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células de Drosophila, transfeção e indução de ligante por meio de sulfato de cobre.
- Depende da contagem baseada em hemocitômetro e microscopia para visualização e quantificação de agregados.
- Necessita padronização das densidades de semeadura celular e dos tempos de incubação entre preparações de células receptoras e células emissoras de sinal.
- Adaptável a outros pares ligante-receptor, mas exige validação das condições de agregação para cada sistema.
- Limitado a leituras semi-quantitativas; não é adequado para medidas cinéticas ou de afinidade de alta precisão sem automação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Assessment of Binding Between Notch Receptor and Trans-ligands
1:47
Aggregation Between Signal-sending and Signal-receiving Cells
3:11
Evaluation of Inhibition of Binding Between Notch and Trans-ligands by Cis-ligands
4:15
Results: Faithful Analysis of Notch Signaling
5:30
Conclusion
