Name: Neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a ativar macrófagos com cAMP em co-culturas com neurônios de gânglio da raiz dorsal para promover o crescimento de neuritos. Este método revela interações celulares essenciais para regeneração neural eficaz.

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Este protocolo é suportado por um fundo NRF-2015R1A2A1A01003410 do Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro, República da Coreia.

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e uso Comitê de Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparação de neurônio dissociada DRG adulto
<ol><li>Antes de configurar a cultura, pre-revesti uma placa de 6 com poli-D-lisina e laminina. Incube uma placa de 6 com 0.01% poli-D-lisina a 37° C por 2 h ou a 4° C durante a noite. Em seguida, lave a placa duas vezes com água destilada.</li>
	<li>Incubar a placa com solução de laminina na concentração de 3 µ g/mL para 2 h à temperatura ambiente e em seguida, lavar a placa duas vezes com água destilada. Seca a placa na temperatura de quarto pelo menos por 1 h.</li>
	<li>Eutanásia em um rato em uma câmara de2 CO transparente conectado a um cilindro de gás de2 CO compactado. Faça uma incisão na pele sobrejacente a coluna vertebral com uma lâmina cirúrgica e dissecar os músculos paravertebrais bilateralmente para expor os ossos vertebrais. Remova os ossos vertebrais meticulosamente, usando um rongeur cirúrgico com ponta estreita até os DRGs são totalmente expostos. Nota: Os neurônios adultos DRGs são obtidos de ratos adultos machos C57BL6 com idade entre 8 a 12 semanas de idade.</li>
	<li>Os DRGs bilateralmente remova o S1 todo o caminho até o nível C1 usando iridectomy tesoura e pinça de ponta fina sob um microscópio de dissecação. Tente cortar as raízes inteiramente de DRGs para minimizar a contaminação das células de Schwann ou a fibroblastos.</li>
	<li>Armazene os DRGs dissecados em uma placa de Petri contendo 5 mL de frio Dulbecco modificado águia médio (DMEM) no gelo até que todos os DRGs são coletados de 60 mm. Nota: É fundamental para dissecar os DRGs tão rapidamente quanto possível. A coleção de todos os DRGs de um rato não deve demorar mais de 30 min. 30 min após a eutanásia, parar de colecionar os DRGs e prosseguir para a próxima etapa, mesmo que ainda restam DRGs.</li>
	<li>Transferi os DRGs para um 1,5 mL tubo Eppendorf usando uma ponta de pipeta azul (1000 µ l) com uma ponta de corte. Remova o DMEM após uma rápida volta por alguns segundos, usando uma mini centrífuga. Adicionar 1 mL de DMEM contendo 125 colagenase de XI de tipo U/mL e incubar o tubo para 90 min com uma rotação suave (35-40 rpm), utilizando um agitador de twister em uma incubadora de 37 ° C. Imobilize o tubo no chão abanador usando a fita.</li>
	<li>Descartar a colagenase-contendo DMEM e adicionar 1 mL de DMEM fresco. Espere até os flutuantes DRGs afundam completamente para baixo até o fundo e em seguida, remover o DMEM com os restos de tecido. Repita essa etapa de lavagem pelo menos seis vezes. Nota: Não tente descartar o sobrenadante completamente. Tenha cuidado para não remover qualquer DRGs com DMEM o sobrenadante.</li>
	<li>Transferi os DRGs para um tubo cônico de 15 mL, usando uma ponta de pipeta azul (1000 µ l) com uma ponta de corte. Em seguida Pipetar subindo e descendo suavemente pelo menos 15 vezes utilizando uma ponta azul (1000 µ l) tornar-se uma suspensão homogênea. Evite fazer bolhas e tente não tocar a parte inferior do tubo cônico com a ponta da pipeta.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 239 x g por 3 min e cuidadosamente descartar o sobrenadante com detritos de flutuação. Adicionar 1 mL de Neurobasal suplementado com B27 (2,0% v/v) e ressuspender as células pipetando suavemente e descer de 5 a 10 vezes.</li>
	<li>Passe a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm sobreposto em cima de um tubo cónico de 50 mL. Esperar por 2 min e em seguida despeje Neurobasal 27/B médio para o filtro usando um controlador de pipeta.</li>
	<li>Placa todos recolhidos DRG os neurônios (um total de aproximado de 2 x 106 DRG os neurônios de um rato) em dois poços da placa de 6. Neurônios DRG de um rato adulto cobrem dois poços de uma placa de 6. Em seguida, coloca a placa numa incubadora de CO2 a 37 ° C até o macrófago co culturas.</li>
</ol>2. co-cultura de P rimário macrófagos peritoneais sobre A inserção de cultura de células
Nota: Estabelecer as culturas co 4 h após o chapeamento inicial dos neurônios DRG dissociados
<ol><li>Macrófagos peritoneais primários são preparados a partir de ratos adultos machos C57BL6 com idade entre 8 a 12 semanas de idade. Eutanásia em um animal em uma câmara de2 CO. Faça uma incisão da pele abdominal delicadamente, expor o peritônio e evitar cortar o peritônio para evitar um vazamento do líquido de lavagem.</li>
	<li>Punção do peritônio, utilizando uma seringa com uma agulha 22g e injetar 10 mL de gelado salin tampão fosfato (PBS) na cavidade peritoneal. Massageie suavemente o peritônio para 1-2 min. Em seguida, retire a agulha e esprema a PBS através do local de punção da agulha e coletar o fluido de lavagem em um tubo cónico de 50 mL. Nota: Antes de usar, coloque a seringa no gelo para manter a frieza da PBS.</li>
	<li>Centrifugue o fluido de lavagem a 239 x g durante 10 minutos a 4 ° C para os componentes celulares de Pelotas. Resuspenda o pellet com 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) para 3 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de célula novamente 239 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Resuspenda o pellet com 3 mL de PBS e centrifugar a suspensão celular novamente para remover qualquer restantes do lysis RBC. Nota: Certifique-se de que o tampão de Lise RBC é completamente removido. Caso contrário, restante do lysis RBC pode ser tóxico para os macrófagos culturas.</li>
	<li>Ressuspender as células peletizadas em 1 mL de meio de Neurobasal/B-27. Placa de metade de todos os macrófagos coletados (um total de 3 × 106 a 6 x 106 células) em uma cultura celular de inserir com a área efetiva de 4,2 cm2, que é colocado em cima do poço de DRG dissociada. Nota: Durante o período de co-cultura, macrófagos são cultivados em meio de cultura de neurônio Neurobasal/B-27. Sobrevivência adequada dos macrófagos sob essa condição foi confirmada.</li>
</ol>3. tratamento de Db-acampamento e coleção de macrófago CM
Nota: Iniciar o tratamento de db-acampamento 4 h após as culturas de macrófagos neurônio co.
<ol><li>Adicione 2 µ l de solução de db-acampamento de 100 µM para as culturas de macrófagos neurônio co. Adicione o mesmo volume de PBS para um experimento de controle.</li>
	<li>Após 24h, preencha um vazio bem com 1 mL de meio de cultura de macrófagos na mesma placa de 6. Transferi a inserção de cultura celular em culturas de co o neurônio-macrófago para o bem vazio com meio de cultura de macrófagos. Manter as células sob a mesma condição para 72 h sem alterar o meio. Nota: Nós adicionamos apenas 1 mL de meio de cultura de macrófagos durante a coleta de CM para fazer concentrada CM. Durante a coleta de CM, se necessário, nós adicionamos mais para cobrir completamente os macrófagos dentro a inserção.</li>
	<li>Depois de 72 h, centrifugar o macrófago CM a 239 x g por 5 min remover os componentes celulares. Passe o sobrenadante através de um filtro de 0,2 µm para remover quaisquer restos celulares restantes. Armazene o coletados CM a-70 ° C até o uso.</li>
</ol>4. o axônio consequência ensaio com coletados CM
<ol><li>Antes de configurar uma cultura adulta separada do neurônio DRG, pre-revesti um slide de câmara de 8 poços seguindo o mesmo procedimento descrito em 1.1 e 1.2.</li>
	<li>Obter Neurobasal suplementado com B27 dissociada adulto DRG neurônios usando os mesmos métodos descritos de 1.3 a 1,10. Placa de 5 x 104 células por poço para o slide de câmara de 8 poços revestidos.</li>
	<li>Coloque o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C por 2 h, permitindo que as células anexar a parte inferior. Em seguida, substituir o meio de cultura com o descongeladas CM que é pré-aquecido a 37 ° C. Nota: Tenha cuidado para não tocar o fundo do slide 8 poços Câmara ao remover o meio de cultura e adicionando o CM coletado.</li>
	<li>15 h após o chapeamento inicial, remover o meio e lave as células com PBS uma vez. Em seguida, adicionar 200 µ l de solução de paraformaldeído 4% gelada nos poços e incube as celulas com a solução de paraformaldeído por 20 min a 4 ° C Nota: A cultura do neurônio DRG para ensaio de consequência natural do axônio deve ser precisamente restrita às 15 h. Sob esta condição, não há nenhuma consequência axônio apreciável.</li>
	<li>Lave tres vezes com PBS gelado e então executar o bloqueio com 10% soro de cabra normal (NGS) com 0,1% Triton-X por 30 min. Incube as celulas fixas com solução de anticorpo primário (anti-Tuj-1), diluída com 10% NGS (em uma concentração de 1 µ g/mL) para 4h no quarto temperatura ou durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave tres vezes com PBS e então incubar as células com solução de anticorpo secundário (cabra-anti rato) por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave duas vezes com PBS e montar o slide de cultura com uma lamela (24 × 50mm) usando a solução de montagem.</li>
	<li>Com imagens usando um microscópio de fluorescência para visualizar a consequência natural do axônio.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Existem várias etapas críticas para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que os neurônios de rato DRG e macrófagos peritoneais são preparados frescos e saudáveis. Nós experimentamos o axônio reduzida atividade de consequência natural do CM quando a dissecação de todos os DRGs levou mais de 30 min. Além disso, a contaminação dos componentes do sangue em macrófagos peritoneais também levou a uma diminuição da atividade de consequência natural do axônio no CM. Lavagem completa para eliciar interação...

Diversos estudos têm buscado melhorar a regeneração de axônio CNS após as lesões da medula espinhal ou cérebro. Reações inflamatórias, inevitavelmente, que acompanham as lesões no sistema nervoso, tradicionalmente são pensadas para participar em processos patológicos secundários, levando a resultados deletérios1,2. Com efeito, metilprednisolona que pode suprimir reações inflamatórias é a única terapia aprovada para de lesão medular aguda3. No entanto, estudos mais recentes forneceram evidências que macrófagos, um tipo de células inflamatórias representativo, podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso4,5,6. Por exemplo, infiltração de macrófagos que seguindo uma lente lesão produzir pro-regenerativa as moléculas para promover a regeneração de neurônios ganglionares da retina7,8. Além disso, transplantados neurônios DRG aumentaram o crescimento do axônio na região onde os macrófagos foram activados por ZnPPIX9. Além disso, os macrófagos, no local da lesão podem criar um meio de crescimento-permissivo por nervos periféricos feridos10.
Nosso trabalho também forneceu fortes evidências que os macrófagos podem contribuir para a capacidade de regeneração do axônio nos neurônios adjacentes. Temos demonstrado que a ativação de macrófagos no gânglio da raiz dorsal (DRG) foram essenciais na reforçada capacidade regenerativa de DRG neurônios sensoriais seguindo um pré-condicionamento periférica nervo lesão11. Pesquisa semelhante foi relatada independentemente de outro laboratório12. Também mostramos que a injeção intraganglionic de dibutyryl do AMP cíclico (cAMP-db), que é uma molécula bem conhecida para aumentar a capacidade de regeneração do axônio13, induziu a ativação de macrófagos. A desativação de macrófagos aboliu os efeitos da db-acampamento na atividade de consequência natural do axônio. Trabalhos posteriores identificaram induzida por lesão expressão CCL2 nos neurônios como um sinal para estimular macrófagos com fenótipo regenerativos pro14,15.
Com base em resultados experimentais acima, nós estabelecemos um modelo in vitro assemelhando-se a eventos moleculares que ocorrem nos DRGs seguindo um pré-condicionamento lesão modelo11,14. Neste modelo, db-cAMP é aplicado para as culturas co neurônio-macrófago provocando intercelular de sinalização que leva à ativação de macrófagos com um fenótipo pro-regenerativa. Aqui, descrevemos protocolos detalhados, pelo qual podemos gerar os macrófagos que secretam fatores moleculares promovendo consequência axônio (Figura 1). Este modelo experimental ilustra um conceito que macrófagos podem ser estimulados ou induzidos a apoiar a regeneração do axônio após as lesões ao sistema nervoso. Nosso modelo também será útil no estudo de mecanismos de sinalização intercelular que leva à ativação de macrófagos pro-regenerativa.

<table><tbody><tr><td>Inserção de cultura de células membrana PET transparente 0.4&mu; tamanho do poro de m</td><td>Corning, membrana transparente do ANIMAL DE ESTIMAÇÃO do falcão</td><td>353090</td><td>com 0.4-&mu; tamanho do poro m, para placa de 6 poços</td></tr><tr><td>70-&mu; m filtro de células de nylon</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Corrediça de cultura de 8 poços</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>com uma aplicação uniforme de Poli-D-Lisina</td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Contendo 1% de glutamax e 1% de suplemento de penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>B-27, sem soro</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>solução extracelular</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina Bromidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 3', 5'-monofosfato cíclico, N6,O2'-dibutiril-, sal de sódio</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% Soro de Cabra Normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti &beta; III tubulina (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Anticorpo monoclonal</td></tr> de <tr><td>camundongo Anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-rato</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células CO2</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td> <td>de dissecaçãoCarl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de torção</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Ferramentas de Belas Ciências)</td><td>16021-14</td><td>Tesoura fina de aço inoxidável, 14cm, curvada, única ação comum</td></tr><tr><td>- carboneto de tungstênio & ToughCut</td><td>FST (Ferramentas de Belas Ciências)</td><td>14558-11</td><td>afiada, serrilhada</td></tr><tr><td>Dumont #7 Fórceps</td><td>FST (Ferramentas de Belas Ciências)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curvado</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas</td><td>FST (Ferramentas de Belas Ciências)</td><td>15000-00</td><td>reta, 3mm de ponta, afiada</td></tr><tr><td>Micro-Centrífuga Qualitron DW-41 Micro-Centrífuga</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41 Tensão de</td><td>entrada: 115VAC</td></tr></tbody></table>

neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Há fortes evidências de que os macrófagos podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso. Aqui, descrevemos um protocolo em que os macrófagos são induzidos a produzir condicionado médio (CM) que promove o crescimento do axônio. Neurônios do gânglio (DRG) adulto raízes dorsais são agudamente dissociados e chapeados. Depois que os neurônios estão conectados estàvel, macrófagos peritoneais são cultivados co em uma inserção de cultura celular sobreposta sobre o mesmo bem. Dibutyryl que amp cíclico (cAMP-db) é aplicado às culturas co por 24 h, após o qual a cultura de pilha inserir contendo os macrófagos é movido para outro poço para coletar CM por 72 h. O CM de co culturas tratadas com db-cAMP, quando aplicado a uma cultura de neurônio DRG adulta separada, apresenta atividade de consequência natural do axônio robusto. O CM obtido a partir das culturas db-cAMP-tratados, consistindo de um único tipo de células sozinho, ou neurônio DRG ou macrófago peritoneal, não apresentam atividade de consequência axônio. Isso indica que a interação entre os neurônios e macrófagos é indispensável para a ativação de macrófagos secretando fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio em centímetros. Assim, nosso paradigma de co-cultura também será útil para estudar a sinalização intercelular na interação neurônio-macrófago para estimular os macrófagos para ser dotado de um fenótipo pro-regenerativa.

Descreveremos um protocolo que pode gerar os macrófagos capazes de secretar fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio. O macrófago CM obtido a partir da co culturas tratadas com db-acampamento resultou em consequência do axônio robusto quando aplicado a uma cultura separada de neurônio DRG (Figura 2A). Em comparação, CM obtido a partir das culturas co tratada com PBS não induzir axônio consequência em nossa duração de cultura 15-h (<...

O protocolo atual apresenta procedimentos experimentais para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidade de libertar moleculares fatores que promovem o crescimento do axônio. Tratamento de acampamento para as culturas de macrófagos neurônio co induz os macrófagos para produzir meio condicionado que possui atividade de consequência natural do axônio forte.

Neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar macrófagos que possam secretar fatores moleculares que promovam o crescimento de neuritos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os neurônios e macrófagos interagem uns com os outros para ativar o fenótipo macrofágico pró-regenerativo para promover uma excelente regeneração. A principal vantagem desta técnica é que usamos o AMP cíclico, uma molécula de soro de adenosina, que é muito mais enzimas fisiológicas usadas em estudos anteriores para estimular macrófagos com o fenótipo pró-regenerativo.Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando descobrimos que a ativação de macrófagos é essencial no aumento da capacidade de crescimento do áxion, e eles podem produzir excelentes neurônios após precaução na lesão permanente do lobo. Antes de configurar a cultura, pré-codifique uma placa de seis poços com licina poli-D e laminina. Em seguida, incube a placa de seis poços com licina poli-D 0,01 a 37 graus Celsius por duas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite.Depois disso, lave o prato duas vezes com água destilada. Em seguida, incubar a placa com solução de laminina a uma concentração de três microgramas por mililitro durante duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave o prato duas vezes com água destilada e seque o prato em temperatura ambiente por pelo menos uma hora.Agora, incise a pele que cobre a coluna vertebral de um camundongo sacrificado com uma lâmina cirúrgica e disseque o par de músculos vertebrais bilateralmente para expor os ossos vertebrais. Remova os ossos vertebrais meticulosamente usando um rongeur cirúrgico de ponta estreita até que o DRG esteja totalmente exposto. Sob um microscópio de dissecação, remova o DRG bilateralmente de S1 até o nível C1 usando tesoura de iridectomia e pinça de ponta fina.Transfira o DRG para um tubo eppendorf de 1.5 mililitro usando uma ponta de pipeta azul com uma extremidade cortada. Em seguida, remova o DMEM após uma centrifugação rápida por vários segundos usando uma minicentrífuga. Adicione um mililitro de DMEM contendo 125 unidades por mililitro de colágeno tipo 11 e incube o tubo por 90 minutos com uma rotação suave usando um agitador twister a 37 graus Celsius.Em seguida, descarte a colagenase contendo DMEM e adicione um mililitro de DMEM fresco. Transfira o DRG para um tubo cônico de 15 mililitros usando uma ponta de pipeta azul com uma extremidade cortada. Em seguida, pipete para cima e para baixo suavemente pelo menos 15 vezes para fazer uma suspensão celular homogênea.Centrifugar o tubo a 239 G durante três minutos e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante com detritos flutuantes. Adicione um mililitro de meio neurobasilar suplementado com B27 e ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo cinco a dez vezes. Em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 micrômetros sobreposto sobre um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, coloque todos os neurônios DRG coletados em dois poços da placa de seis poços. Para preparar macrófagos peritoneais primários de um camundongo adulto, faça uma incisão delicada na pele abdominal para expor o peritônio e evite cortar o peritônio para evitar vazamento de fluido de lavagem. Em seguida, perfure o peritônio usando uma seringa com uma agulha de calibre 22 e injete 10 mililitros de PBS gelado na cavidade peritoneal.Massageie suavemente o peritônio por um a dois minutos. Em seguida, retire a agulha e esprema o PBS através do local da punção da agulha e colete o fluido de lavagem em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue o fluido de lavagem a 239 g por 10 minutos a quatro graus Celsius para granular os componentes celulares.Em seguida, ressuspenda o pellet com três mililitros do tampão de lise dos glóbulos vermelhos por três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar novamente a suspensão celular a 239 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda as células peletizadas em um mililitro de meio neurobasil B27.Placa metade de todos os macrófagos coletados em um inserto de cultura de células com a área efetiva de 4,2 centímetros quadrados, que é colocado no topo do poço de DRG dissociado. Quatro horas após o neurogênio macrófago ter sido co-cultivado, adicione dois microlitros de solução de 100 micromolares DB cíclico amp às co-culturas de neurônios macrófagos. Após 24 horas, encher um alvéolo vazio com um mililitro de meio de cultura de macrófagos na mesma placa de seis poços.Transfira a inserção da cultura celular na co-cultura de neurônios macrófagos para o poço vazio com meio de cultura de macrófagos. Após 72 horas, centrifugar o meio condicionado de macrófagos a 239 vezes g durante cinco minutos para remover os componentes celulares. Passe o sobrenadante por um filtro de 0,2 micrômetro para remover quaisquer detritos celulares restantes.Neste procedimento, pré-revestir uma lâmina de câmara de oito poços com licina poli-D e laminina. Em seguida, obtenha os neurônios DRG adultos dissociados e o meio neuromanjericão, suplementados com B27 usando os mesmos métodos descritos anteriormente. Placa cinco vezes 10 às quatro células por poço em uma lâmina de câmara de oito poços pré-revestida.Em seguida, coloque a lâmina da câmara em uma incubadora de 37 graus Celsius por duas horas, permitindo que as células se prendam ao fundo. Em seguida, substitua o meio de cultura pelo meio descongelado e condicionado que é pré-aquecido a 37 graus Celsius. 15 horas após o revestimento inicial, remova o meio e lave as células com PBS uma vez, em seguida, adicione 200 microlitros de solução gelada de paraformaldeído a 4% aos poços e incube as células com a solução de paraformaldeído por 20 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, incubar as células fixas com solução de anticorpo primário diluída com soro de cabra normal a 10% por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Depois, tire imagens usando um microscópio de fluorescência para visualizar o crescimento de neuritos. O meio condicionado por macrófagos obtido das co-culturas tratadas com DB AMP cíclico resultou em crescimento robusto de neuritos quando aplicado a uma cultura de neurônios DRG separada.Em comparação, o meio condicionado obtido das co-culturas tratadas com PBS não induziu o crescimento de neuritos. Quando o AMP cíclico DB é tratado na cultura apenas com macrófagos, o meio condicionado não foi eficaz no suporte ao crescimento de neuritos. Isso sugere que a interação neurônio-macrófago é indispensável para estimular os macrófagos a serem dotados de uma capacidade pró-regenerativa.Também testamos o meio condicionado obtido a partir de cultura apenas de neurônios tratados com AMP cíclico DB e não encontramos crescimento de neuritos. É importante lembrar que os neurônios e microplacas devem ser preparados frescos e saudáveis. Experimentamos diminuição da atividade de crescimento de neuritos do meio constante quando a dissecção durou muito tempo ou os macrófagos do peritônio foram contaminados com componentes sanguíneos.Neste protocolo, os neurônios DRG dissociados foram separados fiscalmente dos macrófagos no inserto da cultura de células. Portanto, nosso sistema de co-cultura permitirá a identificação de fatores celulares responsáveis pela sinalização intercelular que medeiam a ativação de macrófagos totalmente regenerativos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Este vídeo mostra a co-cultura de neurônios e macrófagos do gânglio da raiz dorsal murina. Os neurônios são semeados em uma placa revestida, enquanto os macrófagos são coletados de um camundongo sacrificado, tratados e adicionados ao inserto de cultura. O tratamento com db-cAMP ativa os neurônios e leva os macrófagos a adotar um fenótipo pró-regenerativo para apoiar o crescimento neuronal.

Desenvolvendo uma cocultura de neurônios e macrófagos in vitro

Este vídeo demonstra um ensaio para promover o crescimento de projeções de neurônios conhecidas como crescimento de neuritos usando o meio condicionado por macrófagos. Co-cultive neurônios e macrófagos com cAMP e colha o meio condicionado derivado de macrófagos. O crescimento dos neurônios com o meio condicionado promove crescimentos de neurites. Essas conseqüências são marcadas com fluorescência e visualizadas usando um microscópio de fluorescência.

Usando um meio condicionado por macrófagos para promover extensões de neurônios

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

Em organismos multicelulares, os fatores solúveis secretados provocam respostas de diferentes tipos de células como resultado da sinalização parácrina. Os sistemas de co-cultura de inserção oferecem uma maneira simples de avaliar as mudanças mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Aprenda a ativar macrófagos com cAMP em co-culturas com neurônios de gânglio da raiz dorsal para promover o crescimento de neuritos. Este método revela interações celulares essenciais para regeneração neural eficaz.

Neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade

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