Name: O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a cultivar enteroides de intestino neonatal de camundongo para estudar os efeitos do leite materno na proliferação celular intestinal. Este modelo ex vivo auxilia na pesquisa de doenças gastrointestinais.

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MG é apoiada por subsídios, K08DK101608 e R03DK111473 do Hospital o National Institutes of Health, março de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, das crianças Discovery Institute de Washington University e St. Louis infantil e departamento de Pediatria Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL é suportado pelo R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital Discovery Institute de Washington University infantil e St. Louis infantil.

Todos os procedimentos de animais neste estudo foram aprovados pelo também da Universidade de Washington em St. Louis institucional Animal cuidados uso Comité (protocolo 20160187) ou cuidados animais institucionais da Universidade de Pittsburgh e Comissão de utilização (protocolo 14103918). Humano intestino fetal em menos de 24 semanas de gestação foi obtido em conformidade com as diretrizes de aquisição de tecido anatômico Universidade de Pittsburgh após aprovação do Conselho de revisão institucional (protocolo PRO14100537) da Universidade de Pittsburgh saúde ciências banco de tecidos através de um sistema de corretor honesto. Leite materno de identificados ou o leite materno pasteurizado doador foi obtido com uma dispensa de consentimento da Universidade de Pittsburgh Conselho de revisão institucional.
1. a cripta isolamento e estabelecimento de Enteroids de ratos Neonatal ou prematuro intestino humano
<ol><li>Preparação de meios de comunicação Nota: Mídia deve ser preparada no bairro no dia anterior o isolamento da cripta.<ol>
<li>Prepare meios de cultura 1,11 L. Começar com 1 L médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina e adicionar 110 mL soro Fetal bovino (FBS) (10% de concentração final), 11 mL penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) e 1,1 mL insulina estéril (final concentração 0,1%).</li>
		<li>Prepare a mistura de 500 mL de PBS-antibiótico. Começar com 500 mL 1 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 10% FBS e adicionar 5 mL de gentamicina (concentração final 1%), 1 mL de anfotericina B (0,2% de concentração final) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%).</li>
		<li>Prepare 30 mL célula rompimento Media #1. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 600 µ l 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração final 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).</li>
		<li>Prepare 30 mL célula rompimento Media #2. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 300 µ l EDTA de 0,5 M (concentração final 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).</li>
		<li>Prepare meios de cultura de cripta 50ml sem fatores de crescimento. Medir a 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e adicionar 10 mL FBS (20% de concentração final).<ol>
<li>Adicionar 500 µ l penicilina-estreptomicina (concentração final 1%), 500 µ l L-glutamina (concentração final 1%), 500 µ l 100 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final), gentamicina (concentração final 1%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfônico (HEPES) (concentração final 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteína (concentração final 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 suplemento, 1 mL 50 x suplemento isento de soro (por exemplo, B-27) menos vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare meios de cultura de cripta de 1 mL com fatores de crescimento. Primeiro Prepare-se 1 mL da cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. Adicionar 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentração final de 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentração final de 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentração final 500 ng/mL) e 0,5 µ l 100 µ g/mL EGF (concentração final de 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento da cripta
	<ol>
<li>Lugar solubilizado extrato de membrana basal (ver Tabela de materiais) no gelo para descongelar antes de começar. Nota: Mantenha membrana basal em gelo ou irá polimerizar.</li>
		<li>Em conformidade com o protocolo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização para os ratos maiores que 14 dias de idade, eutanásia em ratos com dois métodos de eutanásia com o segundo sendo um processo físico para velar a morte. Nota: Para os ratos menos de 14 dias de idade, decapitação é o procedimento padrão, usando a tesoura.</li>
		<li>Usando uma tesoura e pinça, faça uma incisão vertical para baixo da linha média do abdômen, através da pele e peritônio, para todo o comprimento do abdômen. Excisar o intestino do estômago ao ceco com tesoura e remover o mesentério com fórceps. Nota: Duas semanas de idade masculinos e femininos C57BL/6J rato filhotes, cada pesagem g 5.5-7, foram utilizados para isolamento de cripta. Qualquer idade ou tamanho do mouse pode ser usado para a isolação de cripta.</li>
		<li>Para preparar o intestino recém-colhidas para isolamento de cripta, posicione o intestino reto e corte o intestino longitudinalmente ao longo de toda a sua extensão com uma tesoura. Nota: Mouse e intestino humano podem ser preparados da mesma forma.</li>
		<li>Limpa fezes do intestino, agitando suavemente o intestino e para trás em um prato de Petri cheia de PBS-antibiótico mistura usando fórceps.</li>
		<li>Adicione 30 mL de célula rompimento Media #1 para um tubo cónico de 50 mL. Corte o intestino em pedaços de comprimento 0,5 cm diretamente no tubo. Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.</li>
		<li>Enquanto os tecidos são o agitador, obter placas de 24 ou 48-boas para crescer criptas se o enteroids está a ser usado para o isolamento de proteínas, DNA ou RNA. Slides de câmara de 8 poços uso crescer criptas se o enteroids está a ser usado para toda a montam imagem latente confocal.</li>
		<li>No capô, adicione 15 µ l de membrana basal para o fundo de cada poço da placa de 24 ou 48-bem. Se usando slides câmara, adicione 9 µ l da membrana basal à parte inferior de cada câmara. Nota: Ajuste de volume da membrana basal de acordo com o tamanho da placa se necessário.</li>
		<li>Espalhou-se rapidamente a membrana basal com a ponta da pipeta para que a membrana basal forma uma camada fina no fundo do poço. Coloque a placa a 37 ° C numa incubadora por 30 min permitir que a membrana basal polimerizar. Nota: As criptas não irão anexar se membrana basal não é uma fina camada ou membrana basal contém bolhas de ar.</li>
		<li>Depois de 15 min em uma coqueteleira, filtre o tecido através de um filtro de 100 µm. Descarte a fluir.</li>
		<li>Adicione 30 mL de célula rompimento Media #2 para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo.</li>
		<li>Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.</li>
		<li>Depois de 15 min no agitador, filtro tecido através de um filtro de 100 µm. Manter o fluxo através da este passo, no caso de rendimento é baixo em etapas posteriores. Nota: Todo o fluxo através de tubos deve ser mantido no gelo.</li>
		<li>Adicione 15 mL DMEM com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo. Agitar o tubo com a mão para 10 filtro s. através de um filtro de 100 µm e coletar o fluxo através de vigorosamente. Repita até que flua através de contém sem partículas.</li>
		<li>No capô, filtre o fluxo através da etapa anterior em um novo tubo cônico de 50 mL usando 70 µm de filtros para tecido de rato ou 100 µm filtros de tecido humano. Nota: Têm filtros extras no modo de espera e despeje lentamente como filtros vão entupir com detritos.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a x 200 g por 8 min a 4 ° C e lugar diretamente em um balde de gelo no bairro. Remova o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet com total quantidade desejada de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. Nota: As criptas enriquecidas são a camada 'areia' da pelota. Bem, cada um exige 250 µ l de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Estabelecimento de enteroids
	<ol>
<li>A mistura de mídia cripta directamente sobre a membrana basal da placa.</li>
		<li>Verifique criptas com um microscópio para garantir o processo de isolamento foi bem-sucedido. Nota: As células e bolas de células são desejadas. Aproximadamente 100 criptas individuais são banhadas por bem.</li>
		<li>Incube a placa a 37 ° C por 3 h permitir criptas de aderir a membrana basal. Nota: Esta incubação é com cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.</li>
		<li>Remova lentamente a mídia e criptas em excesso que falharam ao conectar usando uma pipeta de P-200. Nota: Não perturbe a membrana basal como criptas anexadas podem tornar-se desalojado.</li>
		<li>Lentamente, adicione 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento para cada poço. Nota: Para 24-, 48-bem placas, ou câmara desliza, 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento é suficiente.</li>
		<li>Substitua os meios de comunicação a cada 2 dias com fresco cripta meios de cultura com fatores de crescimento durante 5 dias antes de tratamentos para permitir o crescimento e o acessório ideal.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mouse recolha de leite materno
<ol><li>Separe uma barragem de C57BL/6J lactante no pós-parto 7-12 dias seus filhotes para 6 h antes da ordenha.</li>
	<li>Anestesiar a barragem lactante com isoflurano através de um cone de nariz e administrar uma injeção subcutânea de ocitocina em 0,15 UI/kg de peso. Espere 3 minutos antes de tentar o procedimento de ordenha.</li>
	<li>Limpar os tetos com etanol a 70% antes do procedimento de ordenha e deixe secar.</li>
	<li>Extrai leite de tetinas, um de cada vez usando uma bomba de mama humano elétrico com tubo de silicone de tamanho para caber as tetinas de rato em um tubo de coleta de 5 mL. Nota: As bombas de mama ideal tem duas configurações, um para a velocidade e outro para a sucção. É melhor começar com o menor configurações de cada um e aumentar ambos lentamente até leite é extraído. Idealmente, o rendimento total será ~ 500 µ l - 1 mL de leite materno de rato por barragem lactante.</li>
	<li>O leite materno imediatamente alíquota e loja a-80 ° C. Nota: Evite congelar/descongelar ciclos.</li>
	<li>Tratar enteroids no dia 5 com 50 µ l/mL de leite materno de rato por mL de meio de cultura de cripta com fatores de crescimento por 24 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. toda montagem coloração de Enteroids
<ol><li>
Preparação dos reagentes
	<ol>
<li>Prepare-se 16 mL 1X PBS por 8 poços.</li>
		<li>Prepare o paraformaldeído 4% de 2 mL (PFA) em 1X PBS por 8 poços.</li>
		<li>Prepare-se 2 mL 0,1% Triton X-100 em PBS 1x por 8 poços.</li>
		<li>Preparar 24 mL PBS Tween (PBST é 0.1% Tween 20 em 1X PBS) por 8 poços.</li>
		<li>Preparar o soro de burro normal de 10% 2 mL (NDS) em 0,1% PBST (10% NDS/PBST) por 8 poços.</li>
		<li>Preparar 4 mL 1% NDS em 0,1% PBST (1% NDS/PBST) por 8 poços.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 1 de coloração
	<ol>
<li>Aspire o tratamentos e lavar enteroids com PBS. Adicionar 250 µ l 4% PFA por bem. Coloque no rotator para 1-2 h a 4 ° C. Remover 4% PFA com pipeta.</li>
		<li>Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotator durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT). Nota: É possível armazenar a placa por 1-2 dias a 4 ° C, se necessário.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l/poço 0.1% Triton X-100. Incubar durante 1 h em RT. Remove 0,1% Triton X-100 com pipeta.</li>
		<li>Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotador por 15 min no RT</li>
		<li>Adicionar 250 µ l/poço 10% NDS/PBST. Incubar durante 45 min no RT. Remove 10% NDS/PBST com pipeta.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l/poço primário anticorpo, 1/250 diluídos em 1% NDS/PBST e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: A diluição de anticorpo ideal varia de acordo com o fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 2 de coloração
	<ol>
<li>Lave pelo menos 5 vezes para 4-5 h com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator a 4 ° C entre cada lavagem.</li>
		<li>Adicione 250 µ l/poço secundário anticorpo, diluído 1/1.000 em 1% NDS/PBST. Embrulhe o prato em folha e incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 3 de coloração
	<ol>
<li>Adicione 250 µ l/poço nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 min. Nota: Manter a placa no escuro.</li>
		<li>Lavar 6 vezes com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator durante 10 minutos a 4 ° C entre cada lavagem.</li>
		<li>Monte lamela na câmara deslize com meios de montagem.</li>
		<li>Captar imagens com um microscópio confocal objetivo de 40x e igualmente processar em um editor de gráficos raster (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

Os autores têm nada para divulgar e sem conflitos de interesse.

O epitélio intestinal é composto de muitos subtipos celulares que são responsáveis por fornecer a defesa do hospedeiro contra patógenos, mantendo a integridade de barreira do intestino e podem ser rompidos na patogênese de diversas doenças. Enquanto modelos animais podem recapitular algumas facetas da doença, o modelo ex vivo de enteroids derivado do intestino de ratos e humanos fornece uma plataforma para testar os efeitos de vários tratamentos. A importância do modelo de enteroid permite que os pesquisadores d...

Enterocolite necrosante (NEC) é a principal causa de morte por doença gastrintestinal em recém-nascidos prematuros, afetando quase 1 em cada 10 bebés nascidos antes de 29 semanas de gestação,1,2,3. Metade dos infantes com o progresso da NEC para a forma mais grave, onde a sobrevivência é apenas 10-30%4,5. Nos Estados Unidos, uma estimativa de USD 2 bilhões por ano são gastos para tratamento de lactentes com NEC6,7, no entanto, a taxa de sobrevivência, nem terapia tem mudado ao longo dos últimos 30 anos. A patogênese da NEC é caracterizada por lesões intestinais e deficientes auditivos da mucosa cura8,9,10,11, no entanto, as vias de sinalização levando a uma exacerbada resposta inflamatória e mecanismos para reverter a inflamação permanecem incompletamente compreendidos.
A administração de leite materno foi encontrada para ser a estratégia apenas proteção contra NEC para prematuros. Mostramos anteriormente que o leite materno protege contra o desenvolvimento da NEC através da inibição do receptor tipo toll receptor imune inata 4 (TLR4) no epitélio intestinal através do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) sinalização via11. Suplementação do leite materno para uma fórmula de NEC experimental atenuado a resposta inflamatória, vista no NEC, como demonstrado por inibição da apoptose enterócito e restauração do enterócito proliferação de uma forma que era dependente de crescimento epidérmico factor (EGF) e EGFR11. Em outro estudo, foi demonstrado que o nitrato, outro componente do leite materno, contribui para sua natureza protetora, modulando a perfusão intestinal, em comparação com a fórmula infantil, que é desprovido de nitrato e pode contribuir para o aumento da frequência do NEC em Fórmula alimentados infantes12,13. Outros compostos presentes no leite materno que foram mostrados para ser envolvido na proteção contra NEC incluem oligossacarídeos do leite humano, L-arginina, glutamina e lactoferrina14,15,16, 17,18,19. Estes elementos benéficos do leite materno revelam a necessidade de seu uso na prevenção da NEC, mas também salientam a importância de se estudar os mecanismos, sinalização de caminhos e efeitos celulares envolveram em como o leite materno é mediar a proteção contra NEC .
Em ordem para um estudo mais aprofundado as propriedades protetoras do leite materno em um modelo do rato da NEC, desenvolvemos uma técnica de novela, fácil de usar por que mouse leite materno pode ser extraído de uma barragem anestesiada usando um elétrico materno bomba11,12 . Esta estratégia de aquisição de leite materno de rato é vantajosa, não só porque as bombas de mama humano são prontamente disponível e eficiente na aquisição de leite materno, mas também porque este método permite análises de leite materno espécie-específicos. Como resultado, nós podemos comparar os efeitos do leite materno de rato com os do leite materno humano bem como pasteurizado o leite humano doador de um banco de leite em modelos espécie-específicos. Esta técnica permite o estudo dos componentes do leite materno em relação à sua contribuição para a prevenção da NEC. Outros investigadores têm desenvolvido métodos de extração de leite materno, no entanto, essas técnicas são manuais e geralmente exigem mais do que um laboratório membro20,21,22. Aqui apresenta-se uma técnica fácil que pode ser utilizada, modificando uma bombinha elétrica humana para coletar leite de um rato. Esta técnica também pode ser aplicada a outras espécies.
Para interrogar adequadamente as vias de sinalização envolvidas com NEC, sistemas modelo são necessários para avaliar todos os tipos de célula diferente, conhecidos por ser afetados no processo de doença. Aqui, vamos discutir um tal sistema de modelo - enteroids - e o seu estabelecimento de rato e o intestino delgado humano. Enteroids intestinais humanas (HIEs), em particular, fornecer promessa significativa, porque eles oferecem um inovador, geneticamente diversos ex vivo modelo humano para auxiliar no estudo de processos fisiopatológicos que ocorrem no trato gastrointestinal 23. Enteroids foram encontrados para ser cultivadas a longo prazo e pode ser congelados para posterior utilização23, e ao contrário de Organoids Intestinal humana (HIOs), cujas culturas são desenvolvidas a partir de células-tronco pluripotentes inducible, enteroids são gerados a partir de células-tronco dentro de criptas intestinais isoladas24. Enteroids exigem menos manutenção, pode ser infectado rapidamente25e pode ser facilmente estabelecido desde criptas intestinais são mais diferenciadas que HIOs23. Portanto, HIEs oferecem muitas vantagens sobre as técnicas existentes, porque eles podem ser desenvolvidos para exibem propriedades de composição e funcionais específicas da região o epitélio gastrointestinal humano23. O uso de enteroids é uma opção altamente eficaz quando precisar de um modelo humano do intestino, com aderência às limitações específicas da região e a facilidade de uso. Aqui vamos demonstrar a técnica de isolar e manutenção primária células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids de camundongos e humanos prematuros.

<table><tbody><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L de Glicose e L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulina)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM / F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hidroxietilpiperazina-N-2-Etano Ácido Sulfônico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Suplemento Menos Vitamina A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x Inibidor de ROCK Y-27632, Dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo Recombinante Wnt3a Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinante R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico Murino Recombinante (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fator de Crescimento Matriz de Membrana Basal Reduzida</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Placa de Petri de Cultura de Células</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td> Placa <td></td></tr><tr><td>de Cultura de Células de 24 Poços</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>Célula de 48 Poços Placa de Cultura</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Deslizamento de Câmara Nunc Lab-Tek II de 8 Poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M Filtro de Células Estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de Células Estéreis M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído (PFA)Ciências de</td> <td>Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Burro Normal Soro (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura do Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G Agulha de 1,5 Polegada</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxitocina</td> Bomba de Mama Elétrica Dupla Humana <td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Ensaio de Fundo Redondo de 5 mL</td><td>Rolhas de Borracha 352058</td><td></td><td></td>Corning</tr><tr><td></td><td>Frey</td><td>Scientific 560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Humano Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

o leite materno aumenta o crescimento de enteroids: um modelo ex vivo da proliferação celular

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Enteroids intestinais pequenos humanos derivam das criptas e quando cultivadas em um nicho de células-tronco contêm todos os tipos de células epiteliais. A capacidade de estabelecer sistemas de enteroid humana ex vivo cultura são importantes fisiopatologia intestinal modelo e estudar a resposta celular particular envolvido. Nos últimos anos, enteroids de camundongos e humanos estão sendo cultivadas, passadas e bancados afastado para uso futuro em vários laboratórios em todo o mundo. Esta plataforma de enteroid pode ser usada para testar os efeitos de vários tratamentos e drogas e os efeitos que são exercidos sobre diferentes tipos de células no intestino. Aqui, um protocolo para o estabelecimento principal células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids derivado de ratos Neonatais e intestino humano prematuro é fornecido. Além disso, este sistema de cultura de enteroid foi utilizado para testar os efeitos do leite materno espécie-específicos. O leite materno do mouse pode ser obtido com eficiência usando uma bomba de mama humano modificado e leite expressa do mouse pode ser usado para mais experiências de pesquisa. Podemos agora demonstrar os efeitos de mouse expressado, humano, e o leite materno doador sobre o crescimento e a proliferação de enteroids derivado de ratos neonatais ou prematuro intestino humano.

Primeiro procuramos investigar se expressou o leite materno ou leite pasteurizado doador teve um efeito na pequena enteroids intestinal. Na verdade, leite materno e leite materno de doadores aumentaram o crescimento de prematuro humana derivada enteroids (figura 1B) e rato neonatal (figura 1A).
Desde que o leite materno humano aumentou o crescimento de pequenas enteroid...

Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de cultura de enteroid de rato neonatal ou intestino humano prematuro, bem como um método eficiente para coletar leite de ratos.

O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar tripas em miniatura, chamadas enteróides, em laboratório. Os enteróides são tratados com leite materno de camundongo extraído em laboratório para elucidar os efeitos do leite materno na proliferação in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas a várias doenças gastrointestinais, como enterocolite necrosante, que afeta bebês prematuros.A principal vantagem dessa técnica é que os enteróides requerem pouca manutenção, podem ser estabelecidos rapidamente e exibem muitas das propriedades funcionais do epitélio gastrointestinal. Esta técnica de estabelecimento de enteróides é um modelo altamente eficaz do intestino delgado humano. Embora esse método possa fornecer informações sobre o intestino delgado, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos em outras regiões do trato gastrointestinal.Para começar, descongele o extrato de membrana basal solubilizado no gelo. Em seguida, use uma tesoura e uma pinça para fazer uma incisão vertical em toda a linha média abdominal de um camundongo sacrificado. Usando uma pinça, excise o intestino delgado e remova o mesentério.Para preparar o intestino delgado para o isolamento da cripta e a criação enteróide, posicione o intestino reto e use uma tesoura para cortar longitudinalmente ao longo de todo o seu comprimento. Remova todas as fezes sacudindo suavemente o intestino com uma pinça em uma placa de Petri cheia de mistura de antibióticos PBS. Em seguida, adicione 30 mililitros de meio de ruptura celular número um a um tubo cônico de 50 mililitros.Coloque segmentos de meio centímetro do intestino no tubo e coloque-o em um balde de gelo em uma coqueteleira. Em um capô, adicione 9 microlitros de membrana basal ao fundo de cada poço em uma lâmina de câmara de oito poços. Espalhe rapidamente a membrana com uma ponta de pipeta e deixe a membrana basal polimerizar em uma incubadora.É importante espalhar rapidamente a membrana basal para que forme uma camada fina no fundo do poço. As criptas não se fixarão se houver bolhas de ar presentes ou se a membrana do basal for muito espessa. Depois de agitar o tubo cônico, use um filtro de 100 micrômetros para filtrar o tecido da membrana e descartar o fluxo.Adicione 30 mililitros de meio de ruptura celular número dois a um novo tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, adicione o tecido intestinal ao tubo. Depois de agitar o tubo por 15 minutos, filtre o tecido através de um filtro de 100 micrômetros. Mantenha o fluxo desta etapa.Adicione 15 mililitros de TMEM com 4,5 gramas por litro de glicose e L-glutamina a um novo tubo cônico. Remova o tecido do filtro de 100 micrômetros e adicione-o ao novo tubo cônico. Em seguida, agite manualmente o tubo por 10 segundos e filtre através de um filtro de 100 micrômetros.No capô, use um filtro de 70 micrômetros para filtrar o tecido em um novo tubo cônico. Depois de centrifugar o tubo por 8 minutos, coloque-o em um balde de gelo no exaustor. Use uma pipeta para remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet formado.Ressuspenda o pellet com uma quantidade adequada de meios de cultura de cripta sem fatores de crescimento. Depois de incubar a lâmina da câmara por 30 minutos, coloque a mistura de meio de cripta diretamente na membrana basal e incube a 37 graus Celsius por 3 horas enquanto as criptas aderem. Após o período de incubação, use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente qualquer meio e criptas soltas.Outra etapa crítica é certificar-se de remover lentamente a mídia e o excesso de criptas que não conseguiram se conectar usando uma pipeta P200. Não perturbe a membrana do embasamento, pois as criptas anexadas podem se desalojar. Adicione lentamente 250 microlitros de meios de cultura de cripta com fatores de crescimento a cada poço.Anestesiar uma mãe lactante com isoflurano administrado via cone nasal e administrar a dose apropriada de ocitocina subcutânea. Limpe os tetos com etanol a 70% e deixe-os secar antes de iniciar o procedimento de ordenha. Usando uma bomba tira leite humana elétrica equipada com tubos de silicone dimensionados para caber em camundongos e um tubo de 5 mililitros, extraia o leite das tetinas uma de cada vez.Por fim, alíquota do leite imediatamente e armazene a 80 graus Celsius negativos. Trate os enteróides no quinto dia com leite materno de camundongo armazenado por 24 horas a 37 graus Celsius. No primeiro dia de coloração, use PBS para remover tratamentos experimentais e lavar os enteróides.Adicione 250 microlitros de 4% de PFA a cada poço e coloque a lâmina em um rotador por 1 a 2 horas a 4 graus Celsius. Use uma pipeta para remover o PFA e, em seguida, lave suavemente cada poço quatro vezes com 250 microlitros de PBS. Coloque a corrediça da câmara em um rotador por 10 minutos em temperatura ambiente.Adicione 250 microlitros de 0,1% Triton X-100 a cada poço e incube por 1 hora em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o Triton X-100 com uma pipeta e lave quatro vezes com 250 microlitros de PBS em cada poço. Coloque a corrediça em um rotador por 15 minutos em temperatura ambiente.Adicione 250 microlitros de 10% NDS / PBST a cada poço e incube por 45 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o NDS/PBST com uma pipeta. Por fim, adicione 250 microlitros de anticorpo primário diluído a cada poço e incube durante a noite a 4 graus Celsius.No segundo dia de coloração, lave cada poço pelo menos cinco vezes com 250 microlitros de PBST e coloque a lâmina em um rotador a 4 graus Celsius entre cada lavagem. Adicione 250 microlitros de anticorpo secundário diluído em 1% NDS / PBST a cada poço. Enrole a lâmina em papel alumínio e incube durante a noite a 4 graus Celsius.No último dia de coloração, adicione 250 microlitros de DAPI corado com energia nuclear a cada poço e deixe-o descansar por 15 minutos. Em seguida, lave cada poço seis vezes com 250 microlitros de PBST. Coloque a corrediça em um rotador por 10 minutos a 4 graus Celsius entre cada lavagem.Por fim, prepare a lâmina para imagens microscópicas montando uma lamínula na lâmina da câmara com mídia de montagem e deixando-a secar por 24 horas. Neste estudo, enteróides do intestino delgado derivados de camundongos neonatais foram tratados com leite materno coletado de camundongos lactantes. Conforme mostrado nesta figura, o leite materno de camundongo aumentou a proliferação em enteróides de camundongos.Para investigar os efeitos específicos da espécie do leite materno, o leite materno humano e o leite materno doado pasteurizado também foram aplicados aos enteróides de camundongos. Conforme mostrado nesta figura, o leite materno humano e pasteurizado de doadores aumentou a proliferação de enteróides de camundongos. Ao tentar este procedimento, é importante manter as criptas no gelo durante as etapas de isolamento.Execute lenta e suavemente todos os métodos após os enteróides estarem em cultura. Após este procedimento, outros métodos, como tratamentos com células imunológicas, microbiota ou vários medicamentos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais para recapitular melhor o microambiente do intestino. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar, tratar e realizar imunofluorescência nos enteróides.Além disso, você deve ser capaz de extrair com eficiência o leite materno de um camundongo lactante. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos humanos e fluidos corporais pode ser extremamente perigoso, e equipamentos de proteção individual devem sempre ser usados durante a realização desses procedimentos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.

Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Este protocolo fornece ferramentas in vitro experimentais para avaliar a transformação das células mamárias humanas. São descritas etapas detalhadas para a taxa de proliferação celular de acompanhamento, capacidade de crescimento independente de ancoragem e distribuição de linhagens celulares em culturas 3D com matriz de membrana de porão.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Este protocolo detalha o estabelecimento de enteróides, um modelo intestinal tridimensional, a partir do tecido intestinal fetal. Imagens imunofluorescentes de biomarcadores epiteliais foram utilizadas para caracterização do modelo. A exposição apical de lipopolissacarídeos, uma endotoxina bacteriana, utilizando a técnica de microinjeção induziu a permeabilidade epitelial de forma dose-dependente medida pelo vazamento de dextrano fluorescente.

Testando a permeabilidade epitelial em enteroides derivados de tecido fetal

Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

O presente estudo relata um protocolo mais fácil, que economiza tempo e é econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias (HMECs) a partir de pequenas quantidades de tecido mamário. Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários, tanto para aplicações laboratoriais quanto clínicas.

Isolamento e Cultura de Células Epiteliais Mamárias Humanas Primárias

Aprenda a cultivar enteroides de intestino neonatal de camundongo para estudar os efeitos do leite materno na proliferação celular intestinal. Este modelo ex vivo auxilia na pesquisa de doenças gastrointestinais.

O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular

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