De alta resolução Volume Imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado Microfluidic dispositivos

O objetivo geral deste procedimento é permitir a medição de campo completo do volume neuronal in vitro com resolução axial submicrométrica necessária para a análise de neuritos em estruturas dinâmicas implicadas no crescimento neuronal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência celular sobre a dinâmica das mudanças de volume na escala subsididal durante o não crescimento ou degeneração do axônio. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece resolução axial submicrométrica combinada com observação de ajuste total e escala de tempo para horas ou dias.

Para iniciar o procedimento, desmolde o bloco PDMS sob uma capa química, derramando isopropanol sobre ele. Em seguida, coloque-o na bancada de aço inoxidável do exaustor. Corte ao redor do wafer de silicone e desmolde a réplica do PDMS.

Em seguida, corte ao redor do chip e deixe uma margem de dois milímetros usando um bisturi ou uma lâmina de barbear. Perfure a entrada pressionando o perfurador de 1,5 milímetro de diâmetro com firmeza e acione-o para cortar e esculpir o orifício da entrada. Faça o mesmo nas quatro zonas dedicadas do chip onde o líquido será injetado.

Em seguida, limpe o chip colando e descascando a fita adesiva no lado microestruturado. Polvilhe isopropanol em ambos os lados. Em seguida, seque o cavaco com nitrogênio pressurizado usando uma pistola de ar comprimido.

Neste procedimento, coloque cada lamínula em um revestidor giratório localizado em um ambiente de sala limpa. Aplique uma gota do fotorresistente positivo para cobrir cerca de 75% da lamínula e gire a 4000 rpm por 30 segundos para atingir uma espessura final de 0,45 micrômetro. Coloque as lamínulas em uma placa de aquecimento com temperatura de superfície de 115 graus Celsius por um minuto.

Usando um alinhador de máscara, exponha cada lamínula a um comprimento de onda de 435 nanômetros através da máscara dedicada de acordo com os parâmetros do fabricante. Em seguida, prepare dois pratos cristalizadores de vidro, um contendo o revelador sem diluição e o outro contendo água deionizada. Mergulhe as lamínulas uma a uma no revelador por um minuto, mexendo contínua e suavemente o prato de cristalização.

Em seguida, mergulhe o wafer em água deionizada por cerca de cinco segundos. Transfira o wafer para um papel absorvente e seque-o com nitrogênio pressurizado usando uma pistola de ar comprimido. Coloque o chip PDMS e o prato de vidro no qual ele será colado na câmara de plasma para ativação da superfície.

Em seguida, deposite uma gota de água em uma lâmina de vidro de microscópio retangular grossa e cole a lamínula na lâmina de vidro por capilaridade. Sob um microscópio, marque a localização das listras fotorresistentes na parte traseira da lâmina de vidro. Coloque a lamínula de vidro estampada no suporte da máscara do alinhador da máscara.

Confie na marca feita para centralizar os objetos de referência fotorresistentes. Para aumentar o contraste óptico, coloque um wafer de silício sob o chip PDMS. O wafer de silício deve permanecer firmemente preso ao mandril durante o processo de alinhamento.

Em seguida, coloque o chip PDMS no suporte de substrato móvel do alinhador de máscara. Em seguida, levante o mandril o suficiente para visualizar o chip e o conjunto de listras fotorresistentes localizadas na lamínula, mantendo-se atrás do contato mecânico. Execute o alinhamento e obtenha contato mecânico entre o cavaco e a lamínula levantando o mandril até que a superfície dos pilares PDMS toque a lamínula de vidro.

Depois disso, abaixe o mandril. Remova a lamínula colada ao chip do suporte da máscara. Em seguida, coloque o dispositivo em uma placa de Petri de 35 milímetros e transfira tudo para o forno por cinco a dez minutos para aumentar a força de ligação.

Trinta minutos após a colagem, coloque uma ponta de pipeta de dez microlitros cheia de solução de PLO na entrada. Em seguida, carregue o líquido até formar uma gota por cima. Repita a mesma operação na saída e nos reservatórios.

Em seguida, adicione PBS na placa de Petri ao redor do chip. Sele a placa de Petri com uma película de parafina e incube à temperatura ambiente com um mínimo de cinco horas. Em seguida, pressione um cone de ponta de dez microlitros levemente em cada orifício de injeção e aspire o excesso de líquido.

Em seguida, substitua o PLO, bem como o PBS ao redor do chip pelo meio de cultura. Em seguida, coloque o chip na incubadora regulada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que os neurônios semeiem com um tempo mínimo de incubação de cinco horas. Neste procedimento, retire o meio de cultura do chip.

Colete dois a três microlitros da solução de células recém-ressuspensas e injete-a na entrada. Repita imediatamente a mesma operação na tomada. Injetar aproximadamente o mesmo volume de meio de cultura em cada reservatório.

Observe rapidamente o chip sob o microscópio para verificar a densidade das células. A ordem de grandeza da densidade celular ideal corresponde a cerca de cinco a dez células dentro da superfície quadrada delimitada por quatro pilares. Repita o procedimento de injeção de 0,5 a 1 microlitro de suspensão celular para atingir a densidade celular desejada.

Para a aquisição de imagens, substitua o meio de cultura pelo meio de imagem. Em seguida, coloque o chip sob um microscópio de epifluorescência. Adquira imagens de células de imagens sucessivas únicas a múltiplas no caso de experimentos de lapso de tempo.

Aqui estão as observações representativas de uma faixa fotorresistente de calibração e neurônios. Imagens de maior ampliação e seções transversais desses objetos são exibidas à direita. Os neuritos representativos e uma câmara central de três micrômetros de altura são mostrados aqui.

O volume da fatia de neurite pode ser calculado em função da largura do neurite. E aqui estão os cones de crescimento representativos e uma câmara central de três micrômetros de altura. Suas subestruturas emergem claramente de um ruído de fundo óptico de cerca de 20 nanômetros.

Observações de lapso de tempo de neurônios de ação de vida semeados em uma câmara de 12 micrômetros de altura para seguir o ciclo de encolhimento e reativação do cone de crescimento dentro de uma escala de tempo de algumas dezenas de minutos. Ao tentar este procedimento, é importante ter acesso a um equipamento de gravação de íons profundos para fabricar a lama de silicone. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como alinhar uma lamínula de vidro estruturada com um chip PDMS.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser aplicada de forma reprodutível à quantificação da neurologia em 3D. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da farmacologia explorarem o efeito de vários medicamentos com calibre real, todos em forma de cone fechado. Não se esqueça de que trabalhar com neurônios primários requer muito cuidado para evitar contaminação e estilhaços.

Seja sempre gentil e rápido ao trocar a mídia para limitar o tempo que eles passam fora da incubadora.