Name: De alta resolução Volume Imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado Microfluidic dispositivos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a medir volumes neuronais in vitro com resolução submicrométrica usando microfluídica PDMS e exclusão de fluorescência. Este método permite analisar dinâmicas de neuritos e crescimento celular em neurociência.

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Os autores querem reconhecer ChiLab, materiais e laboratório Microsystems - Politecnico di Torino - DISAT, na pessoa do Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza e Dr. S L Marasso, pelo seu precioso apoio no processo de desenvolvimento e fabricação de dispositivo. Agradecemos Victor Racine de Quantacell para discussão e suporte no processamento de imagem. Estamos gratos a Isabelle Grandjean e Manon Chartier da instalação de Animal do Institut Curie para sua sustentação para os ratos e Pablo Vargas e Ana-Maria Lennon (Institut Curie) para nos fornecer com os ratos de GFP LifeAct. Estamos gratos à Olivier Thouvenin do Institut Langevin e Clotilde Cadart, Larisa Venkova e Matthieu Piel do Institut Curie - UMR 144, por sua ajuda na compreensão da exclusão da fluorescência método. Finalmente, agradecemos a plataforma tecnológica do Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) pelo seu apoio em microfabrication. Este trabalho foi financiado em parte pelo Europeu pesquisa Conselho Advanced Grant no. 321107 "Violoncelo", Université de PSL (projeto SwithNeuroTrails), d'Avenir ANR Investissement e o Labex IPGG e Equipex.

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</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Imagem de volume de neurônios constitui um desafio para a técnica de FXm devido as longas e finas extensões dessas células. Este protocolo descreve as variantes do mesmo tipo de dispositivo microfluidic dedicado a imagem latente do neurônio.
Ao lado os aspectos do design microfluídicos, a escolha do objetivo é fundamental para a imagem latente de exclusão de fluorescência e implica um trade-off entre resolução lateral e a nitidez da imagem. Tem sido demonstrado em 13 que um at alta, levando a uma profundidade de foco menor do que a altura da câmara não foi prejudicial para a precisão de medição de volume se a imagem foi executada em foco e se é deixada uma margem suficiente entre o contorno do objeto de nterest e os limites da superfície de integração. No entanto, o uso de uma câmara muito maior do que a profundidade de foco prejudica a clareza de imagem devido à difusão de fótons, que suaviza as bordas dos objetos de interesse. A fabricação de uma câmara alta 3 µm reduzida a essa indefinição lateral e forneceu imagens de exclusão fluorescente excepcionalmente bem definidas mesmo usando alta at 40 (0,8) X objetivos Visualizar neuronais ramos com alta resolução lateral.
Chip de montagem é uma etapa crítica, em particular no caso de 3 µm câmaras altas, mas manipulação cuidadosa conforme descrito no ponto 4.1.2 evita o colapso do telhado. A superfície elevada à relação do volume associada a estas câmaras finas também levantou a questão da estabilidade da concentração de dextrano ao longo do tempo. Temos verificado que a superfície absorção do Dextran após uma noite de incubação foi insignificante: depois de substituir o Dextran pela PBS, a diferença de intensidade entre o pilar e o plano de fundo foi cerca de 1 por 1000 do contraste entre a intensidade inicial Estas duas regiões na presença de dextrano. Note-se que os neurônios podem aderir na lamela inferior e o telhado de PDMS. Este efeito desaparece quando usando estampadas lamelas (ou seja, quando nós não incubar adesivas moléculas dentro da câmara PDMS), como o revestimento, portanto, é estritamente localizado na parte inferior da câmara.
Além de sua morfologia desafiador, os neurônios são bastante adequados para FXm devido ao fato de que dentre a grande limitação do método, ou seja, endocitose de dextrano, é muito limitado nestas células. Nós escolhemos um 10 kDa formulação para suprimir a longo alcance (horas) qualquer fenômeno visível endocitose.
Em conclusão, a simplicidade conceitual do FXm é equilibrada por um conjunto de questões experimentais que foram resolvidos pelo presente protocolo, como nanométrica aspereza PDMS e altura de câmara micrométrica ou correcção de fundo para corrigir o desnível de o teto de PDMS entre pilares. No entanto, o uso de uma câmara estreita microfluidic confinar o meio fluorescente produz alguns condicionalismos específicos, como a necessidade de pilares de apoio, que reduz a superfície eficaz disponível para adesão celular, ou a necessidade de excluir a soma da central Câmara de observar neuronais extensões com a maior clareza, o que restringe as regiões da célula acessível à observação de alta resolução. Uma possível evolução desse método seria para se livrar deste confinamento físico, a ser substituído por um óptico. O novo desenvolvimento da microscopia de luz folha pode ser combinado vantajosamente com FXm no futuro.

O conhecimento preciso do volume celular tem atraído maior atenção nos últimos anos, impulsionada pelo problema da homeostase de tamanho de célula em microorganismos unicelulares 1 e, mais geralmente, em células mitóticas 2. No entanto, a questão do volume das células é pertinente também para células pós mitóticas, para o qual os neurônios constituem um exemplo paradigmático.
Volume é de fato uma importante assinatura de eventos fisiológicos e patológicos em diferentes escalas e pontos de tempo na vida neuronal, da deformação de axonal transitória associada à atividade elétrica (escala de milissegundos) 3 para o irreversível neuronal inchaço ocorrendo durante a fase assintomática da Neurodegenerativas Doenças (ao longo de anos em humanos) 4. No entanto, a maior alteração de volume ocorre em uma escala de tempo intermediário de dias ou semanas (dependendo do organismo considerado) durante o crescimento neuronal. A prolongada e complexa morfologia de neurônios levanta questões de múltiplos, entre os quais a regulação do tamanho da célula. Diâmetro e comprimento axonal são na verdade firmemente regulado na vivo, com valores específicos para cada tipo neuronal 5,6.
Estas questões, complexos de abordar na vivo, também podem ser abordadas de uma forma simplificada in vitro. Com esse objetivo, um método dedicado à medição de volume rápido suficiente para acompanhar a dinâmica de crescimento (ou seja, em uma escala de tempo de minutos) e compatível com a observação ao longo de horas ou dias é necessária. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para proporcionar um acesso directo ou indirecto ao volume celular in vitro. Célula de reconstrução de imagem latente confocal é um deles, mas este método implica a rotulagem e repetidas exposições à luz ao mesmo tempo mostrando uma resolução axial limitada de cerca de 500 nm 7. Note que estes dois últimos inconvenientes são parcialmente superados por um método mais sofisticado e mais recente chamado retículo microscopia de luz-folha 8. Microscopia de força atômica tem sido usado 9 , mas este método de varredura é por essência lenta e tediosa. Além disso, o contato físico com a célula requer pode interferir com a medição Considerando a extrema suavidade dos neurônios 10. Método indireto usando impedância ou ressonância têm sido empregadas para 11tipos de célula diferente, mas são insuficientes para estendido adesivas células como os neurônios.
Um dos métodos mais promissores baseia-se na medida do volume excluído das células em uma câmara de perto com um corante fluorescente. O método de exclusão de fluorescência (FXm) é simples no seu princípio, pois requer sem rotulagem e é apropriado para a imagem latente ótica rápido, a longo prazo, de populações de células com uma resolução axial potencialmente sub óptica. Mais precisamente, a resolução em z depende da intensidade de fluorescência máxima na cultura câmara (ou seja, na região desprovida de células) dividida pela faixa dinâmica da câmera, embora várias fontes de ruído limitam esta resolução final. Este método tem sido muito poderoso a seguir o volume da migração de células aderentes 12 ou para estudar a mudança de volume durante a mitose de células de mamíferos, como exaustivamente descrito em 13. No entanto, os neurônios constituem um desafio metodológico para FXm considerando sua extensa ramificação em processos sub micrométricas.
Apresentamos aqui um método que conduz para a fabricação das câmaras de FXm suaves acesso com alta precisão o volume e altura de ramificações neuronais e estruturas dinâmicas envolvidas em crescimento neuronal, como cones de crescimento.
Câmaras devem ter alturas semelhantes que o objeto para medir a fim de otimizar a resolução axial. Portanto, nós projetamos dispositivos diferentes do FXm caracterizados por câmaras de medição central de três alturas diferentes. O mais fino (3 µm de altura) dedica-se à medição do axônio: esta baixa altura exclui a soma, que permanecem na próximo câmara intermediária alta 15 µm. Câmaras de centrais mais espessas (10 a 12 µm) são suficientemente altas para acompanhar o crescimento de células inteiras. O dispositivo também inclui dois reservatórios localizados em ambos os lados da câmara central. Quatro furos de injeção (IH), portanto, são implementados e são designados como segue: a entrada e saída servem para introduzir as suspensões celulares no chip, Considerando que os dois outros alimentam os reservatórios.
Temos a primeira calibração fabricados lamelas para medições de altura, usando estruturas de fotorresiste da geometria conhecida. Nós então ter fotografado livre neurônios crescentes, mas também morfologicamente restrito neurônios em micropatterns de adesão.

<table><tbody><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Para realizar</td></tr> o <tr><td>alinhador de máscara DRIE MJB4 Fotolitografia</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Alinhador de máscara</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Fotolitografia associada ao limpador de plasma DRIE</td></tr><tr><td></td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de células</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 37 &deg; C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubadora</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Forno entre 65 e 80 &deg; C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfilômetro mecânico</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Perfilômetro óptico</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Diâmetro 200 mm</td></tr><tr><td>Sonicador de banho ultrassônico</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Volume do banho: 0,8 litro</td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Máscaras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Dados suplementares</td></tr><tr><td>Su8 Máscara 1</td><td></td><td></td><td>Dados suplementares</td></tr><tr><td>Su8 Máscara 2</td><td></td><td></td><td>Dados suplementares</td></tr><tr><td>Su8 Máscara 3</td><td></td><td></td><td>Dados suplementares</td></tr><tr><td>Calibração S1805 listras</td><td>Dados suplementares</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Pequeno equipamento de laboratório</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Furador de 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (referência dos EUA)</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi ou lâmina</td><td></td><td></td><td></td>de barbear</tr><tr><td>Espátula plana de aço inoxidável de 9" com colher</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Para desmoldar PDMS</td></tr><tr><td>Manuseamento de bolachas de lábio superior</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Fórceps - Standard / Dumoxel</td><td>Para manipular lamínulas de vidro</td></tr><tr><td>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm lamínulas de vidro</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistentes e reveladores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 fotorresistentes positivos</td><td>Microquímicos GmbH</td><td></td><td>Antes do processo DRIE, espessuras 1,8 e micro; m</td></tr><tr><td>AZ 351B desenvolvedor</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Para desenvolver fotorresistente AZ 1518 positivo</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA desenvolvedor</td><td>Technic</td><td></td><td>Para desenvolver fotorresistente negativo SU-8</td></tr><tr><td>Microposit S1805 resistir</td><td>Chimie Serviços</td><td></td> Técnicos <td>Fotorresistente positivo usado para obter 0,5&micro; m estruturas de altura</td></tr><tr><td>MF 26A desenvolvedor</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Para desenvolver fotorresistente S1805 positivo</td></tr><tr><td><forte>Consumíveis de laboratório</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico descartável 3 mL</td><td>LifeTechnologies - Placas de Petri ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 20 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes quadrados</td><td></td> transparentes <td></td> VWR 115-2148 <td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Filme de parafina de plástico</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-Metacriloxipropil)triclorosilano</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td></td> PDMS e agente de cura Sylgard 184 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poli-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>3-metacriloxipropil-trimetoxissilano</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>ácido</td> <td>acéticoSigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugado com Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion a 488 nm</td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugado com Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprtion a 647 nm</td></tr><tr><td>Meio de cultura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pirovato de Sódio GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal sem vermelho de fenol</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotina em Matlab para normalização de fundo</td><td>Contato com a Quantacell</td><td>Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Para selecionar ROI específico para análise de imagens</td></tr><tr><td>Routine</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Dados suplementares</td></tr><tr><td>Routine</td><td>Matlab</td><td></td><td>Dados suplementares</td></tr></tbody></table>

de alta resolução volume imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado microfluidic dispositivos

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume é um parâmetro importante referentes às características fisiológicas e patológicas dos neurônios em escalas de tempo diferentes. Os neurônios são células bastante singular sobre suas morfologias ramificadas estendidas e consequentemente aumentar vários desafios metodológicos para a medição do volume. No caso particular de em vitro crescimento neuronal, a metodologia escolhida deve incluir a resolução axial sub micrométrica, combinada com a observação de campo integral em escalas de tempo de minutos a horas ou dias. Ao contrário de outros métodos, como a reconstrução de forma celular usando a imagem latente confocal, eletricamente com base em medições ou microscopia de força atômica, o método de exclusão de fluorescência recentemente desenvolvido (FXm) tem o potencial para atender a esses desafios. No entanto, apesar de ser simples em seu princípio, implementação de um FXm de alta resolução para os neurônios requer vários ajustes e uma metodologia dedicada. Apresentamos aqui um método baseado na combinação de exclusão de fluorescência, dispositivos microfluídicos de múltiplos compartimentos de baixa rugosidade e finalmente micropatterning para alcançar em vitro medições de volume neuronal local. A alta resolução fornecida pelo dispositivo nos permitiu medir o volume local de processos neuronais (neuritos) e o volume de algumas estruturas específicas envolvidas no crescimento neuronal, tais como cones de crescimento (GCs).

O resultado do processo de fabricação descrito nas seções 1 e 2 é ilustrado pelas imagens da figura 1A-1B e a curva da Figura 1. A tabela da Figura 1 exibe os valores de rugosidade de duas diferentes áreas representativas de PDMS chip, ou seja, na região central e a câmara intermediária alta próxima de 20 µm. Obteve-se uma diminuição da rugosidade por um fator de cerca de 7 usando gravado da bolacha de Si em vez de fotorresiste SU-8. Em seguida, FXm primeiro foi aplicado em uma faixa de fotorresiste da geometria conhecida (Figura 2A) dentro de uma câmara de alta de 10 µm. Após processamento de imagem e intensidade para conversão de altura (ver gráfico da Figura 2B), perfis de FXm realizadas em cortes transversais ao longo desta faixa (Figura 2) fornecem os perfis de altura desejada (Figura 2D). Figura 2D mostra a comparação entre perfis obtidos usando profilometry mecânico e métodos FXm. Estes perfis, incluindo o valor de borda e planalto, são muito semelhantes, validando o método. Observe que a dispersão dos dados FXm não é representativa da resolução final do método, como novo avaliada na Figura 3 e Figura 4, mas resultados da baixa intensidade empregadas para evitar um possível efeito de muito fraco autofluorescência do fotorresiste no canal da GFP.
Em seguida, observamos neuritos em 3 µm e 10 µm alta câmaras (Figura 3). O desvio padrão de ruído de fundo é de cerca de 18 nm após a intensidade para correção de conversão e fundo de altura. Este valor é ligeiramente maior do que o física rugosidade das superfícies PDMS fundidas em superfícies de silício (12 nm, consulte a tabela da Figura 1) mas muito mais baixo do que a rugosidade medida em PDMS obtidos de moldes de SU-8. Esses resultados destacam o valor acrescentado da perfuração de poços em wafers de silício, em vez de abrir buracos em SU-8 fotorresiste para lançar pilares. Um valor tão baixo permite que um sinal elevado à relação de ruído e imagens muito claras em volume como o exibido na Figura 3A. Como um exemplo dos dados que podem ser obtidos de tais imagens, nós calculado o volume de 1,6 µm (ou seja, 10 pixels) de axônio grande fatia (ver o gráfico da Figura 3B). Usando em uma primeira aproximação um ajuste linear destes dados dá um valor de altura média axônio de cerca de 400 nm, para ser comparado com , por exemplo, o 500 nm diâmetro axonal encontrado em 10 dias velhos filhotes dentro do corpo caloso 5. Também combinamos FXm com micropatterns de adesão consiste em série confinou 2 µm e 6 µm de listras largas de 30 µm de comprimento. Nosso objetivo foi estudar a influência da largura do axônio na sua forma 3D. A Figura 3 mostra uma representação 3D em cor falsa de uma neurônio toda imagem obtida em uma câmara de alta de 10 µm. Neuritos estão se espalhando em 2 µm e 6 µm de listras largas, Considerando que a soma está localizado na extremidade da faixa maior. Perfis de altura foram divididos em três seções diferentes de cruz. Em coerência com o gráfico apresentado na Figura 3A, a superfície integrado sobre o aumento de seções transversais com a largura do axônio (Figura 3D).
Enfocamos também estruturas 3D de crescimento cone (GC). Figura 4 A-B exibe dois diferentes GC perfis obtidos em uma câmara de alta 3 µm, que destacam sua estrutura ramificada de sub. Além disso, foram realizadas experiências de lapso de tempo para acompanhar a dinâmica do volume de GCs em uma câmara de alta 12 µm. A Figura 4 mostra um ciclo de encolhimento e reativação de um GC determinado dentro de uma escala de tempo de algumas dezenas de minutos. Graças à utilização de GFP-lifeact ratos, cones de crescimento foram localizados no comprimento de onda de emissão de GFP (510 nm) de sua concentração elevada de actina. A superfície identificada no comprimento de onda foi usada para integrar-se ao longo do comprimento de onda de emissão de dextran em 647 nm para calcular o volume de GC. Figura 4 mostra finalmente a distribuição do volume de GC em pontos diferentes de tempo e local em três diferentes neurônios, centrados em um valor de cerca de 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figura 1: câmaras FXm PDMS. (A) esquemas das quatro etapas principais diferentes de microfabrication levando ao molde final. A localização da entrada, saída e reservatórios são indicados. Escala de bares: 1 mm. (B) imagem da câmara de PDMS FXm obtida usando um perfilômetro óptico. Esta imagem mostra a câmara central contendo 3 fileiras de 10 µm altos pilares e as câmaras intermédias de 20, 50 e 90 µm de altura. Barra de escala: 500 µm. (C) vista transversal do chip ao longo de duas linhas tracejadas desenhado em (B). Amarelo/ouro: seção transversal ao longo de pilares, azuis: secção transversal entre pilares. (D) significa valores de rugosidade do PDMS medido em 50 × 50 µm2 áreas moldadas em silicone e sobre a câmara intermediária alta de 20 µm SU-8 (veja as setas para a localização dessas áreas). Valores médios foram obtidos de medições de três áreas diferentes. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figura 2: calibração de FXm método usando uma faixa de fotorresiste como o objeto de interesse. (A) imagem de GFP-fluorescência de uma câmara de alta de 10 µm tirada repleta de 10.000 dextrano MW absorvente em 488 nm a 1 mg/mL. (B: plano de fundo, p: pilar). Observação com um objectivo de ND X 0.8 40 seco. Barra de escala: lei 50 µm. (B) calibração Linear obtida a intensidade média dos dois retângulos coloridos mostrado no perfil de intensidade da fluorescência (C) obtido ao nível da linha tracejada azul exibido em (A), cruzando o fotorresiste listra (0,45 µm alta positiva fotorresiste). (D) comparação dos perfis obtidos de mecânico perfilômetro (pontos pretos) e FXm depois de intensidade para conversão da altura dos dados de (B) (pontos azuis). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figura 3: imagem de volume de axônio. (A) axônio estendendo-se para a câmara alta central de 3 µm de soma, localizado na câmara intermédia em seguida 15 µm. Imagem executada usando 10.000 dextrano MW absorvente em 488 nm e uma 40 X, at 0.8 secar o objectivo. O baixo-relevo obtidos após o uso de rotina de redução de fundo destaca os dois neuritos e escolhido para plotar o gráfico à direita. Escala de barras:de 30 µm. (B) axônio fatia de volume em função da largura do axônio obtidos a partir do 22 perfis (média de 10 pixels, ou seja, em um 1,6 µm "fatia do axônio") mostrados em (A). A linha sólida representa um ajuste linear de inclinação 0,4 µm passa a origem. (C) imagem em falsa cor de um neurônio estampado em uma faixa adesiva feita de sucessivas de 2 µm e 6 µm de largura tocos (representados em branco). As medições foram feitas em uma câmara alta de 10 µm, cheia de 10.000 dextrano MW absorvente em 647 nm e usando um at 40 x 0.8 secar o objectivo. (D) perfis de altura correspondente para as linhas tracejadas coloridas mostradas em (C), mantendo o mesmo código de cor. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figura 4: imagem de cone de crescimento dinâmico e estático. (A-B) Perfis de altura de cone de crescimento obtidas em uma câmara de alta 3 µm após intensidade para conversão de altura ao longo das linhas amarelas exibido em imagens associadas. Observação realizada utilizando um preenchimento com 10.000 dextrano MW absorvente em 488 nm e uma 40 X, at 0.8 secar o objectivo. (C) imagem de neurônio toda em uma câmara de alta 12 µm repleto de 10.000 dextrano MW absorvente em 647 nm. As observações foram feitas em dois canais fluorescentes: GFP para localização de cone de crescimento (linhas tracejadas para amarelas) e CY5 para calcular o volume de GC da exclusão de fluorescência. A superfície incluída por linhas tracejadas amarelas foi usada para calcular o volume de GC. O gráfico mostra a variação do volume de GC com o tempo e morfologias associadas em ambos GFP e CY5 canais em dois pontos representativos de tempo diferentes. Todos os dados foram adquiridos usando um at 40 x 0.8 secar objectivo todos os bares de escala de 3 min.: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>1:8 µm camada de máscara</td>
			<td>Máscara de 02:30 µm camada</td>
			<td>Máscara 03:40 µm camada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000RPM</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos mole</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energia de exposição</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos de pós-exposição</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desenvolvimento</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil Asse (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: fotolitos etapas executadas para construir um dispositivo que contém uma câmara central de 12 μm de altura. Alturas das câmaras intermediárias: 20, 50 e 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Máscara 01:10 µm de camada</td>
			<td>Máscara de 02:30 µm camada</td>
			<td>Máscara 03:40 µm camada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos mole</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energia de exposição</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos de pós-exposição</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desenvolvimento</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil Asse (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: fotolitos etapas executadas para construir um dispositivo que contém uma câmara central de 10 μm de altura. Alturas das câmaras intermediárias: 20, 50 e 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Máscara 01:12 µm de camada</td>
			<td>Máscara 02:32 µm camada</td>
			<td>Máscara 03:40 µm camada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos mole</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de exposição</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos de pós-exposição</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desenvolvimento</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil Asse (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: fotolitos etapas executadas para construir um dispositivo que contém uma câmara central de 3 μm de altura. Alturas das câmaras intermediárias: 18, 50 e 90 µm.
Dados complementares 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Visão esquemática das máscaras usadas para fabricar o dispositivo PDMS (máscara DRIE e máscaras 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados adicionais 2: arquivo "masks_neuron_volume_chips.dxf". Arquivos eletrônicos que permite fabricar a máscara DRIE e máscaras 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados suplementares 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Arquivos eletrônicos que permite fabricar a máscara utilizada para os fotolitos de fotorresiste listras. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados adicionais 4: arquivo conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados suplementares 5: arquivo importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Volume é um parâmetro importante sobre células características fisiológicas e patológicas. Nós descrevemos um método de exclusão fluorescente permitindo a medição de campo integral em vitro neuronal volume com sub micrométrica resolução axial, necessária para a análise de neuritos e estruturas dinâmicas implicadas em crescimento neuronal.

De alta resolução Volume Imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado Microfluidic dispositivos

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a medição de campo completo do volume neuronal in vitro com resolução axial submicrométrica necessária para a análise de neuritos em estruturas dinâmicas implicadas no crescimento neuronal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência celular sobre a dinâmica das mudanças de volume na escala subsididal durante o não crescimento ou degeneração do axônio. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece resolução axial submicrométrica combinada com observação de ajuste total e escala de tempo para horas ou dias.Para iniciar o procedimento, desmolde o bloco PDMS sob uma capa química, derramando isopropanol sobre ele. Em seguida, coloque-o na bancada de aço inoxidável do exaustor. Corte ao redor do wafer de silicone e desmolde a réplica do PDMS.Em seguida, corte ao redor do chip e deixe uma margem de dois milímetros usando um bisturi ou uma lâmina de barbear. Perfure a entrada pressionando o perfurador de 1,5 milímetro de diâmetro com firmeza e acione-o para cortar e esculpir o orifício da entrada. Faça o mesmo nas quatro zonas dedicadas do chip onde o líquido será injetado.Em seguida, limpe o chip colando e descascando a fita adesiva no lado microestruturado. Polvilhe isopropanol em ambos os lados. Em seguida, seque o cavaco com nitrogênio pressurizado usando uma pistola de ar comprimido.Neste procedimento, coloque cada lamínula em um revestidor giratório localizado em um ambiente de sala limpa. Aplique uma gota do fotorresistente positivo para cobrir cerca de 75% da lamínula e gire a 4000 rpm por 30 segundos para atingir uma espessura final de 0,45 micrômetro. Coloque as lamínulas em uma placa de aquecimento com temperatura de superfície de 115 graus Celsius por um minuto.Usando um alinhador de máscara, exponha cada lamínula a um comprimento de onda de 435 nanômetros através da máscara dedicada de acordo com os parâmetros do fabricante. Em seguida, prepare dois pratos cristalizadores de vidro, um contendo o revelador sem diluição e o outro contendo água deionizada. Mergulhe as lamínulas uma a uma no revelador por um minuto, mexendo contínua e suavemente o prato de cristalização.Em seguida, mergulhe o wafer em água deionizada por cerca de cinco segundos. Transfira o wafer para um papel absorvente e seque-o com nitrogênio pressurizado usando uma pistola de ar comprimido. Coloque o chip PDMS e o prato de vidro no qual ele será colado na câmara de plasma para ativação da superfície.Em seguida, deposite uma gota de água em uma lâmina de vidro de microscópio retangular grossa e cole a lamínula na lâmina de vidro por capilaridade. Sob um microscópio, marque a localização das listras fotorresistentes na parte traseira da lâmina de vidro. Coloque a lamínula de vidro estampada no suporte da máscara do alinhador da máscara.Confie na marca feita para centralizar os objetos de referência fotorresistentes. Para aumentar o contraste óptico, coloque um wafer de silício sob o chip PDMS. O wafer de silício deve permanecer firmemente preso ao mandril durante o processo de alinhamento.Em seguida, coloque o chip PDMS no suporte de substrato móvel do alinhador de máscara. Em seguida, levante o mandril o suficiente para visualizar o chip e o conjunto de listras fotorresistentes localizadas na lamínula, mantendo-se atrás do contato mecânico. Execute o alinhamento e obtenha contato mecânico entre o cavaco e a lamínula levantando o mandril até que a superfície dos pilares PDMS toque a lamínula de vidro.Depois disso, abaixe o mandril. Remova a lamínula colada ao chip do suporte da máscara. Em seguida, coloque o dispositivo em uma placa de Petri de 35 milímetros e transfira tudo para o forno por cinco a dez minutos para aumentar a força de ligação.Trinta minutos após a colagem, coloque uma ponta de pipeta de dez microlitros cheia de solução de PLO na entrada. Em seguida, carregue o líquido até formar uma gota por cima. Repita a mesma operação na saída e nos reservatórios.Em seguida, adicione PBS na placa de Petri ao redor do chip. Sele a placa de Petri com uma película de parafina e incube à temperatura ambiente com um mínimo de cinco horas. Em seguida, pressione um cone de ponta de dez microlitros levemente em cada orifício de injeção e aspire o excesso de líquido.Em seguida, substitua o PLO, bem como o PBS ao redor do chip pelo meio de cultura. Em seguida, coloque o chip na incubadora regulada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que os neurônios semeiem com um tempo mínimo de incubação de cinco horas. Neste procedimento, retire o meio de cultura do chip.Colete dois a três microlitros da solução de células recém-ressuspensas e injete-a na entrada. Repita imediatamente a mesma operação na tomada. Injetar aproximadamente o mesmo volume de meio de cultura em cada reservatório.Observe rapidamente o chip sob o microscópio para verificar a densidade das células. A ordem de grandeza da densidade celular ideal corresponde a cerca de cinco a dez células dentro da superfície quadrada delimitada por quatro pilares. Repita o procedimento de injeção de 0,5 a 1 microlitro de suspensão celular para atingir a densidade celular desejada.Para a aquisição de imagens, substitua o meio de cultura pelo meio de imagem. Em seguida, coloque o chip sob um microscópio de epifluorescência. Adquira imagens de células de imagens sucessivas únicas a múltiplas no caso de experimentos de lapso de tempo.Aqui estão as observações representativas de uma faixa fotorresistente de calibração e neurônios. Imagens de maior ampliação e seções transversais desses objetos são exibidas à direita. Os neuritos representativos e uma câmara central de três micrômetros de altura são mostrados aqui.O volume da fatia de neurite pode ser calculado em função da largura do neurite. E aqui estão os cones de crescimento representativos e uma câmara central de três micrômetros de altura. Suas subestruturas emergem claramente de um ruído de fundo óptico de cerca de 20 nanômetros.Observações de lapso de tempo de neurônios de ação de vida semeados em uma câmara de 12 micrômetros de altura para seguir o ciclo de encolhimento e reativação do cone de crescimento dentro de uma escala de tempo de algumas dezenas de minutos. Ao tentar este procedimento, é importante ter acesso a um equipamento de gravação de íons profundos para fabricar a lama de silicone. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como alinhar uma lamínula de vidro estruturada com um chip PDMS.Uma vez dominada, esta técnica pode ser aplicada de forma reprodutível à quantificação da neurologia em 3D. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da farmacologia explorarem o efeito de vários medicamentos com calibre real, todos em forma de cone fechado. Não se esqueça de que trabalhar com neurônios primários requer muito cuidado para evitar contaminação e estilhaços.Seja sempre gentil e rápido ao trocar a mídia para limitar o tempo que eles passam fora da incubadora.

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo...

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato - encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

Este protocolo descreve o uso de chips de plástico para cultura e compartimentar os neurônios primários de murino. Esses chips são preassembled, fácil de usar e compatível com alta resolução, ao vivo e a imagem latente de fluorescência. Este protocolo descreve como neurônios hippocampal do rato dentro estes chips da placa e executar imunocoloração, axotomy e isolamento fluídico.

Uso de Chips microfluídicos plástico pré-montados para compartimentar os neurônios primários de murino

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Aprenda a medir volumes neuronais in vitro com resolução submicrométrica usando microfluídica PDMS e exclusão de fluorescência. Este método permite analisar dinâmicas de neuritos e crescimento celular em neurociência.

De alta resolução Volume Imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado Microfluidic dispositivos (Vídeo) | JoVE Journal

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