Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais

O objetivo geral deste procedimento experimental é desenvolver um modelo pré-clínico de camundongo para estudar o papel da comunicação mediada por vesículas extracelulares entre células-tronco tumorais e mesenquimais. Este método pode ajudar a responder a várias questões-chave no campo da biologia do câncer, como as células-tronco tumorais e mesenquimais se comunicam por meio de vesículas extracelulares e se isso suporta a progressão do câncer. A principal vantagem desta técnica é que ela permite estudar o papel da adaptação das células-tronco mesenquimais por EVs de câncer, na progressão e formação de metástases in vivo.

A implicação desse procedimento se estende à nossa terapia do câncer, porque podemos usar o GSA para interferir na comunicação EV e na sinalização de andrógenos para inibir a progressão do câncer. Além de fornecer informações sobre a comunicação mediada por EV no osteossarcoma, esse método também pode ser aplicado a muitos outros tipos de câncer. De fato, a medula óssea derivada das células-tronco mesenquimais é prontamente recrutada para mais locais onde podem se diferenciar em células de suporte ao câncer.

Comece semeando oito frascos de 175 centímetros quadrados com 3 milhões de células 143B cada. Cultive as células usando meio empobrecido de EV por 36 a 48 horas. Quando as células estiverem 80 a 90% confluentes, colete os sobrenadantes dos oito frascos para isolamento EV.

Em seguida, use a centrifugação diferencial para remover todas as células e detritos celulares do sobrenadante. Isso consiste em centrifugações repetidas a quatro graus Celsius, com aceleração e desaceleração máximas. Após cada etapa de centrifugação, colete o sobrenadante e deixe para trás um mililitro do sobrenadante no tubo de centrifugação.

Agora, carregue um sobrenadante pré-liberado em tubos de ultracentrífuga a 38,5 mililitros por tubo. Em seguida, isole os EVs usando uma ultracentrífuga a 70.000g por uma hora, com uma pausa lenta e a quatro graus Celsius. Após a ultracentrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás cerca de um mililitro.

Em seguida, ressuspenda os pellets contendo EV no volume restante. Junte todas as suspensões. E lave as suspensões agrupadas com PBS.

Encha o tubo até 38,5 mililitros. Em seguida, repita o ciclo de ultracentrifugação, mas não use pausa. O rotor deve parar de girar após cerca de uma hora.

Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e deixe 100 a 200 microlitros de solução. Por fim, ressuspenda o pellet EV e ajuste o volume final para 200 microlitros com PBS. Os EVs podem então ser caracterizados por TEM, marcados com corantes para experimentos de absorção ou usados para educar células-tronco mesenquimais para experimentos in vivo.

É crucial que as MSCs primárias estejam na densidade celular correta antes da exposição aos EVs do câncer. A célula deve ser cerca de 70% confluente para atingir a proporção ideal de EV da célula e também para evitar o crescimento excessivo durante os períodos de educação. Este experimento usa camundongos Athymic Nude-Foxn1nu adultos aclimatados.

Um dia antes do procedimento cirúrgico, forneça paracetamol através da água de beber. No dia da cirurgia, prepare células 143B a 200.000 por microlitro em PBS. 20 minutos antes da cirurgia, forneça buprenorfina ao animal.

Pouco antes da anestesia, carregue uma seringa de 10 microlitros com as células concentradas de 143B. Depois de confirmar a anestesia adequada e aplicar pomada para os olhos, posicione o animal de costas com as patas traseiras voltadas para o operador. Em seguida, prenda uma máscara de anestesia no animal.

Em seguida, flexione o joelho esquerdo e limpe a pele com três esfoliações alternadas de etanol a 70% e iodopovidona e, em seguida, aplique lidocaína a 2% como analgésico local. Agora, faça uma pequena incisão na pele logo abaixo do joelho para expor a tíbia. Em seguida, usando uma broca microtwist de 0,8 millimiter, faça um orifício na tíbia, aproximadamente 2 milímetros abaixo do joelho.

Evite perfurar ambos os córtices da tíbia. Prossiga injetando lentamente um microlitro de células no orifício por cerca de cinco segundos. Em seguida, feche o orifício com uma gota de cola de tecido para evitar o refluxo da suspensão.

Complete a cirurgia fechando a pele com suturas e uma gota de cola de tecido. Deixe o animal se recuperar com aquecimento e trate-o com paracetamol por 24 horas. Dois dias depois, use uma seringa de insulina de 0,5 milímetro para injetar as MSCs na veia da cauda.

A administração correta durante uma injeção na veia da cauda pode ser confirmada visualmente. Se aparecer uma área branca ou se encontrar resistência, injete novamente numa área acima do local de injeção anterior. Em seguida, duas vezes por semana, acompanhe o crescimento do tumor usando bioluminescência.

Injete os camundongos com D-luciferina por meio de uma seringa de insulina e, 10 minutos depois, meça o fluxo de fótons gerado pelas células tumorais usando um sistema de imagem. Quando o diâmetro do tumor de um animal se tornar maior que 15 milímetros, ou sua perda de peso exceder 15%, eutanasiar o animal e coletar todos os tecidos relevantes. 10 minutos antes da eutanásia, injete D-luciferina, como feito antes da imagem.

Após a eutanásia, colete os pulmões, fígado, baço e rins, usando tesouras e pinças esterilizadas. Lave o sangue dos órgãos usando PBS e organize-os em uma placa de Petri para obter imagens. Usando um sistema de imagem de bioluminescência, documente ambos os lados dos órgãos.

Uma vez tiradas as imagens, fixe imediatamente os órgãos para análise histológica futura. Para processar os documentos fotográficos, basta aplicar o limite manual e contar o número de nódulos em cada foto. Certifique-se de usar o mesmo limite para cada foto e documentar os tecidos de todas as direções, especialmente os pulmões.

Após descalcificar a tíbia do camundongo, prossiga com a desidratação e a incorporação de parafina. Em seguida, use um micrótomo para preparar seções de parafina de seis mícrons e colete as seções em lâminas de vidro. Depois que as lâminas secarem, guarde-as durante a noite em temperatura ambiente.

No dia seguinte, execute uma recuperação de antígeno mediada por calor, usando tampão citrato. Em seguida, core os tecidos com anticorpo anti-GFP em um a 900 e siga com uma contracoloração DAPI. Finalmente, documente as seções de tecido corado usando microscopia de fluorescência.

A pureza dos EVs isolados foi confirmada por microscopia eletrônica. As preparações continham vesículas entre 40 e 100 nanômetros de diâmetro. Para avaliar se os EVs de câncer interagem com as MSCs, os EVs foram marcados com um corante ligante lipofílico fluorescente verde e incubados durante a noite com MSCs.

A aceitação eficiente de EV pelas MSCs foi assim confirmada. Uma propriedade imunomoduladora de EVs em MSCs foi confirmada usando um imunoensaio de citocina multiplex baseado em B. Os EVs tumorais causaram aumento da produção de IL-8 e IL-6 em MSCs, em comparação com EVs de controle de fibroblastos humanos.

Em seguida, em um modelo ortotópico de camundongo xenoenxerto de osteossarcoma, camundongos tratados com MSCs educadas em EV mostraram ter crescimento tumoral acelerado. Quatro dias após a injeção sistêmica de MSCs que expressam GFP, células que expressam GFP foram detectadas na medula óssea e no tecido tumoral, demonstrando MSC homing ao local do tumor. Imagens ex vivo de vários órgãos destacaram a formação de nódulos pulmonares.

Em última análise, os camundongos que receberam MSCs educadas em EV tiveram mais metástases pulmonares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como educar células estromais com EVs de câncer ex vivo e estudar os efeitos de células estromais educadas in vivo usando modelos de camundongos pré-clínicos. Uma vez dominado, esse procedimento pode ser realizado em quatro semanas, desde que haja EVs de câncer suficientes disponíveis.

Ao tentar este procedimento, é importante planejar com antecedência e obter uma purificação reprodutível das vesículas extracelulares do câncer, bem como usar células-tronco mesenquimais de proliferação de baixa passagem.