Name: Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo pré-clínico de osteossarcoma em camundongos para estudar a comunicação mediada por vesículas extracelulares entre tumor e células-tronco mesenquimais. Este método permite investigar a progressão tumoral e metástase in vivo.

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S.R. Baglio foi apoiado por uma bolsa pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), co-financiado pela União Europeia. Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação de Horizonte 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 660200 (a S.R. Baglio).

Tecidos adiposo humanos para isolamento de células-tronco mesenquimais foram obtidos do departamento de cirurgia plástica do Hospital Tergooi (Hilversum, Países Baixos), após aprovação pelo Comitê de ética institucional e escritos consentimento informado. GFP-positivo adiposas MSCs foram obtidas do departamento de medicina e Ciências cirúrgicas para crianças e adultos (Universidade de Modena e Reggio Emilia).
Experiências em animais foram realizadas em conformidade com a lei holandesa sobre experimentação animal e o protocolo foi aprovado pelo Comitê em experimentação animal do centro médico de VU University, Amsterdam, Países Baixos.
1. isolamento de vesículas extracelulares secretadas por Tumor.
<ol><li>Preparar empobrecido EV Fetal bovino soro (FBS) por centrifugação FBS a 70.000 x g durante a noite (16 horas), sem freio, a 4 ° C, utilizando um rotor de balde ultra balançando (esperar 1h para desaceleração). Recolha cuidadosamente o sobrenadante (FBS EV-esgotada) sem perturbar o sedimento. Filtre o FBS EV-esgotada com um filtro de 0,22 µm.</li>
	<li>Preparar meio de cultura EV-esgotada, completando médio (IMDM modificado Dulbecco a Iscove) com 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, glutamina 2 mM (1 x P/S/G) e 5% FBS EV-esgotada.</li>
	<li>Sementes de 3 x 106 143 células em frascos de2 175 cm e cultura-los em meio de cultura EV-esgotada em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Quando as células são 80-90% de confluencia (tipicamente após 36 h a 48 h), recolha o sobrenadante de 8 x 175 cm2 frascos (28 mL/frasco) para isolamento de EV.</li>
	<li>Pre-Limpe o sobrenadante celular para remover células e restos celulares por centrifugação diferencial (centrifugação o sobrenadante do spin anterior cada vez), de acordo com o seguinte protocolo:<ol>
<li>Centrifugue o sobrenadante duas vezes a 500 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante duas vezes a 2000 x g, durante 15 min.</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante duas vezes a 10.000 x g, durante 30 min.</li>
		<li>Execute todas as centrifugações a 4 ° C, com máxima aceleração e desaceleração velocidades. Depois de cada passo, cuidadosamente recolha o sobrenadante contendo EV, deixando cerca de 1 mL. Proceda imediatamente para a etapa de 1,5 ou loja o pre-apuradas condicionado médio a-80 ° C até isolamento EV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolar o EVs por centrifugação o meio condicionado previamente limpo uma vez a 70.000 x g, durante 1 h, lento do freio, a 4 ° C em tubos de ultracentrífuga (volume final 38,5 mL/tubo) usando um rotor de balde ultra balançando.</li>
	<li>Cuidadosamente Retire o sobrenadante, deixando cerca de 1 mL por trás, Ressuspender as pelotas EV-contendo o volume restante, piscina-los todos em um tubo se e adicionar tampão fosfato salino (PBS) até o enchimento completo do tubo (volume final 38,5 mL).</li>
	<li>Centrifugar novamente 70.000 x g por 1 h a 4 ° C, sem freio (esperar 1h para desaceleração). Cuidadosamente, remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e deixar 100-200 µ l.</li>
	<li>Ressuspender o EV e ajustar o volume final de 200 µ l com PBS (padronizado para todos os isolamentos-EV). Use a preparação EV imediatamente ou armazenar a-80 ° C até uso22. Nota: EVs podem ser armazenados a 6 meses a-80 ° C.</li>
</ol>2. EV caracterização.
EVs purificados podem ser visualizados por transmissão de microscopia eletrônica (TEM)23.
<ol><li>Preps Mix EV com um volume igual de paraformaldeído 4% em tampão fosfato.</li>
	<li>Casaco 200 mesh Formvar-carbono revestido grades TEM de níquel com 5 µ l de suspensão de EV por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Fixar as amostras de EV nas grades TEM com glutaraldeído de 1% em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,0), contraste com oxalato de uranilo (pH 7.0) e incorporar em uma mistura de 4% de uranilo acetato e 2% metil celulose em proporção de 1:9 no gelo.</li>
	<li>Retire grades com loops de aço inoxidável e secar o excesso de líquido com papel de filtro para garantir uma espessura apropriada do filme metil celulose.</li>
	<li>Após a secagem, examinar grades com um microscópio eletrônico de transmissão e capturar imagens com uma câmera digital, juntamente com o software de imagem correspondente.</li>
</ol>3. educação do MSCs pelo tumor derivado EVs.
<ol><li>Preparar o meio de cultura MSC completando alfa-mínima média essencial (alfa-MEM) com 4% EV empobrecido humana plaquetas lisado (hPL)24, heparina (10 U/mL) e 1 x P/S/G. Nota: EV-esgotada hPL é obtido seguindo o procedimento descrito na seção 1.1.</li>
	<li>Semente de 1.4 x 106 adiposo-derivado MSCs por balão2 de 75 cm e cultura-los EV empobrecido MSC-meio de cultura numa incubadora a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Quando células alcançar 70% confluência, adicionar 143 osteossarcoma - ou controlar fibroblastos humanos (hf)-EVs, 10 µ l EV preparação/cm2 do frasco de cultura. Incubar 24 horas e adicionar a mesma quantidade de EVs para mais 6 horas. Nota: Fibroblastos humanos são cultivados em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) 10% FBS e EVs são isolados, conforme descrito na seção 1.</li>
	<li>Recolher o sobrenadante MSC, centrifugar 1 x 500 x g por 5 min a 4 ° C (com aceleração máxima e ajustes de velocidade de desaceleração), transfira para um tubo novo e armazenar o sobrenadante apurado a-80 ° C para permitir a análise futura de citocina (secção 5).</li>
	<li>In vivo experimentos (secção 6), educar GFP-positivo MSCs25 conforme descrito nas seções 3.1 a 3.3, coletar as células e Resuspenda-los em PBS em uma concentração final de 106 células por 100 µ l. manter as células no gelo até injeção.</li>
</ol>4. ensaio de internalização EV.
Para visualizar a captação de EV por MSCs, rotule EVs com um corante verde-fluorescente vinculador (GFLD) (comercialmente disponível) seguindo o protocolo do fabricante:
<ol><li>Brevemente, adicione 180 µ l de diluente para a preparação de EV de 200 µ l. Diluir 1 µ l de corante GFLD em 50 µ l de diluente e adicionar 20 µ l de corante diluído para a preparação de EV diluída.</li>
	<li>Delicadamente misture pipetando e incubar durante 3 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de 0.1% BSA em PBS, transferir para tubos de centrífuga-ultra e encher o tubo com PBS (volume final 38,5 mL/tubo).</li>
	<li>Centrifugar 1 x a 70.000 x g, durante 1 h a 4 ° C, sem freio (esperar 1h para desaceleração). Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender o rotulado EV-em um volume final de 200 µ l (ajustar o volume com PBS).</li>
	<li>Adicionar o EVs etiquetado para a cultura MSC ou armazená-los a-80 ° C. Após a incubação durante a noite, avaliar a internalização de vesículas por microscopia de fluorescência e fluxo cytometry7.</li>
</ol>5. avaliação do perfil de expressão de citocinas MSC.
<ol><li>Para a quantificação de multiplex de interleucina-8 (IL-8), interleucina-1 β (IL-1 β), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), fator de necrose tumoral (TNF) e níveis de proteína interleucina - 12p 70 (IL - 12p 70) no MSC condicionado médio (ver passo 3.4), use um matriz de grânulo de cytometric comercialmente disponíveis (CBA) por citocinas inflamatórias humanas, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Brevemente, misturar os grânulos de captura anticorpo conjugado e adicioná-los a todos os tubos de ensaio. Adicione as diluições padrão de citocinas ou as amostras médias condicionadas aos tubos.</li>
	<li>Adicionar o reagente de detecção e incubar 3 horas no RT</li>
	<li>Lave os grânulos com a solução de lavagem fornecido. Medir as amostras usando um citômetro de fluxo e analisar os dados de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>6. geração de um modelo de Mouse de transplante ortotópico de osteossarcoma.
<ol><li>Permitir que os ratos Athymic nu-Foxn1nu seis semanas de idade, do sexo feminino, se adapte pelo menos uma semana antes de iniciar os procedimentos experimentais.</li>
	<li>Um dia antes do procedimento cirúrgico e como analgesia peri-operatório adicione paracetamol para a água potável. Diluir a "solução de paracetamol para crianças" (ver Tabela de materiais) com água para se obter uma concentração final de 2 mg/mL. Com base em um consumo médio de água de 150 mL/kg/dia, e um peso médio de 20 g, esta dose é suficiente para chegar a uma dosagem de 6 mg/rato/dia (300 mg/kg/dia).</li>
	<li>Continue o tratamento analgésico até 24 horas após a operação, ou mais, se os animais apresentam sinais de dor.</li>
	<li>No dia do procedimento cirúrgico, coletar luciferase-positivo (Fluc) 143 células cultivadas (anteriormente geradas pelo Lentivirus transdução) por centrifugação a 300 x g por 10 min e ressuspender as células em uma concentração de 2 x 105 células / µ l em PBS. Manter a suspensão de células no gelo até 6 horas.</li>
	<li>Equipamento cirúrgico de autoclave. Preparar e limpar a área de trabalho e coloque a tesoura esterilizada e pinça em folhas estéreis. 20 min antes do procedimento cirúrgico (etapa 6,8), injetar os animais por via subcutânea com buprenorfina (0,05 mg/kg, diluída em soro fisiológico a 0,9%) como analgésico, usando seringas de insulina 0,5 mL (agulha de 29).</li>
	<li>Antes só anestesiar cada animal, encher uma seringa de 10 µ l com pelo menos 1 µ l de suspensão de células de concentrado (Fluc) 143 (consulte a etapa 6.4).</li>
	<li>Anestesia o animal com anestesia de inalação de isoflurano (2-3% de oxigênio). Verificar o nível de anestesia pelo dedo do pé-beliscar o animal. Quando o animal não reage para beliscar, ou seja, que é profundamente anestesiada, aplica a pomada sobre os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.</li>
	<li>Posicione o animal em suas costas com a cabeça em uma máscara de anestesia e com as pernas em direção ao operador. Flexione o joelho esquerdo. Limpe a pele com álcool 70% e aplicar a lidocaína (2%) com uma ponta de algodão 3 vezes como analgésico local.</li>
	<li>Use uma faca cirúrgica estéril para fazer uma pequena incisão (cerca de 5 mm) na pele logo abaixo do joelho para expor a tíbia. Perfure um furo na tíbia, aproximadamente 2 mm abaixo do joelho, usando uma broca de torção micro de 0,8 mm. Tenha cuidado para não perfurar a ambos os córtices de tíbia.</li>
	<li>Injete a suspensão de células de 1 µ l (cerca de 2 x 105 células) lentamente (em aproximadamente 5 segundos) no orifício usando uma agulha de calibre 26. Feche o buraco com uma gota de cola de tecido para evitar o refluxo da suspensão.</li>
	<li>Feche a pele com suturas monofilamento e uma gota de cola de tecido. Deixe o animal recuperar em um ambiente aquecido (uso uma lâmpada de calor). Não abandone animais até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Somente depois que os animais são totalmente recuperados da anestesia, devolvê-los para suas próprias gaiolas.</li>
	<li>Dois dias após a inoculação do tumor, injetar EV educado ou MSCs ingênuo GFP-positivo (106 células em 100 µ l de PBS, consulte a etapa 3.5) por via intravenosa com uma seringa de insulina 0,5 mL na veia da cauda dos ratos.</li>
	<li>Acompanhar o crescimento do tumor por bioluminescência26 de imagem duas vezes por semana. Para este fim, injetar o i.p. de ratos com 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) com uma seringa de insulina. Dez minutos após a injeção, posicione os animais na bioluminescência sistema de imagem e medir o fluxo de fótons gerado pelas células do tumor.</li>
	<li>Além disso, medir o diâmetro do osso-tumor primário com um paquímetro. O volume do tumor (em mm3) estima-se pela largura x comprimento2 x 0.5.</li>
	<li>Nota: Pontos de extremidade humanos são definidos como diâmetro do tumor > perda de peso ou 15 mm > 15%.</li>
</ol>7. a avaliação do número de nódulo pulmonar
<ol><li>Quando um dos animais atinge o ponto de extremidade humano definido na etapa 6.14 (em aproximadamente 3-4 semanas), encerrar o experimento e coletar e analisar todos os tecidos pertinentes.</li>
	<li>Dez minutos antes da eutanásia, injetar 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) com uma seringa de insulina de 0,5 mL.</li>
	<li>Anestesiar os animais com anestesia por inalação de isoflurano (consulte a etapa 6,7). Confirme a profundidade de anestesia pela ausência de reações do mouse para beliscar por ponto-e-dedo do pé. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical27.</li>
	<li>Recolha os pulmões, fígado, baço e rins usando uma pinça e tesoura esterilizada. Lave os órgãos em PBS para remover vestígios de sangue e colocá-los em um prato de Petri.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri com os órgãos na bioluminescência sistema de imagem. Medir o sinal de bioluminescência em ambos os lados dos órgãos. Imediatamente após a medição, mergulhe os órgãos em formol a 4% para fixa-los (24-72 horas, a RT) para futura análise histológica.</li>
	<li>Processe as imagens obtidas com software de imagem apropriado pela limiarização manual. Conte o número de nódulos pulmonares em cada foto. Conte o número total de nódulos pulmonares em ambos os lados dos pulmões.</li>
</ol>8. histológica análise
<ol><li>Para a análise histológica dos tecidos pulmonares:<ol>
<li>Incorporar os órgãos fixada em formol em parafina e preparar 6 µm slides de tecido.</li>
		<li>Deparaffinate tecido pulmonar desliza e executar a recuperação do antígeno fervendo-os por 15 min em 0,01 M de tampão citrato (pH 6).</li>
		<li>Incube as lâminas na horizontal em temperatura ambiente com 1:150 de anticorpo (200 µ g/mL) diluído anti-humano vimentina no anticorpo-diluente (comercialmente disponível) e, posteriormente, com o anticorpo secundário, HRP-etiquetada (0,5 mg/mL, diluição 1: 500). Mancha os tecidos com 3'-diaminobenzidine (DAB) e coloração de hematoxilina contador.</li>
		<li>Observe os slides de tecido manchado usando microscópio óptico acoplado à câmera correspondente e software de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para avaliar a presença de GFP-positivo MSCs em tíbias de rato:<ol>
<li>Descalcificar as tíbias em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Atualize o buffer de EDTA todos os dias até que os ossos tornam-se flexíveis (cerca de 1 semana).</li>
		<li>Desidratar tíbias e nos infiltrar com parafina. Incorpore as tíbias (incluindo tecido osteossarcoma) em blocos de parafina.</li>
		<li>Use um micrótomo para preparar 6 µm cortes de parafina. Coloca as seções de parafina em lâminas de vidro. Após a secagem, armazene slides durante a noite em temperatura ambiente.</li>
		<li>Executar recuperação de antígeno mediada por calor usando tampão citrato (ver 8.1.2) e manchar os tecidos com anticorpo anti-GFP (anti-soro inteiro) em uma diluição de 1:900 no anticorpo-diluente. Counterstain os tecidos com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>Observe os slides de tecido com um microscópio de fluorescência, juntamente com o software de imagem correspondente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Vesículas extracelulares secretadas por tumor (EVs) podem alterar a fisiologia das células mesenquimais locais e distantes para gerar um ambiente de apoio-tumor. Aqui descrevemos a geração de um modelo de mouse pré-clínicos de osteossarcoma que permite que a dissecação das interações entre células tumorais mediada por EV e tronco mesenquimal cells (MSCs) na vivo. Nós mostramos que injeção sistêmica de tumor humano MSCs EV-educado em camundongos rolamento xenografts osteossarcoma fortemente promove a formação de ...

O microambiente do tumor participa activamente na maioria, se não todos, os aspectos da progressão tumorigênese e câncer, incluindo a formação de metástases e o desenvolvimento de resistência à terapêutica1. Isto sublinha a necessidade de modelos de rato de câncer ortotópico pré-clínicos que permitem a dissecação das interações complexas tumor-estroma ocorrendo no nicho de tumor.
Entre os muitos componentes celulares do microambiente do tumor, as células-tronco mesenquimais (MSCs) contribuem muito para a progressão do cancro em vários tipos de câncer, como câncer de mama, câncer de próstata, tumores cerebrais, mieloma múltiplo e osteossarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs são células tronco que residem em vários tecidos fetais e adultos, incluindo a medula óssea, tecido adiposo, placenta, sangue de cordão umbilical e outros8,9. Em resposta a sinais inflamatórios gerado pelo câncer, MSCs migram para localizações tumorais, incorporam o microambiente do tumor em, finalmente, se diferenciar em células de câncer-suporte10. Estas MSCs câncer associadas fornecem fatores essenciais (ou seja, fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas e mediadores imunossupressoras) para progressão do tumor agindo em células tumorais e no estroma circundante2, 3 , 11 , 12 , 13. enquanto os efeitos de tumor-promoção do MSCs associada a câncer têm sido investigados em vários modelos de câncer, os mecanismos pelos quais células tumorais reprogram MSCs para dar forma a um nicho de câncer-promoção são mal compreendidos. Aqui descrevemos a geração de um modelo de transplante ortotópico especificamente, permite o estudo da interação entre as células de câncer de osso e MSCs pro-oncogenicidade através de vesículas extracelulares (EVs).
Sve é mediadores cruciais da comunicação intercelular entre tumor e células estromais14. SVE carrega biomoléculas funcionais da célula de origem, incluindo proteínas, lípidos e RNAs regulatórios. Uma vez lançado no espaço extracelular, essas vesículas podem ser absorvidas por células circundantes ou levadas para locais distantes através do sangue ou a circulação linfática e podem influenciar profundamente o comportamento de célula de destino. 15 , 16 , 17 por exemplo, absorção de câncer EVs por fibroblastos do estroma pode resultar na diferenciação de Miofibroblasto apoiando a angiogênese e acelerando o tumor crescimento na vivo18,19, internalização por endotelial as células podem estimular a angiogênese do tumor e aumentar a permeabilidade vascular16,20, e interação com células do sistema imune pode levar à supressão da resposta de imune antitumoral21.
Nós recentemente demonstrado, usando um modelo do rato de transplante ortotópico bioluminescentes de osteossarcoma, que células tumorais liberam quantidades elevadas de EVs que solicitam MSCs para adquirir um fenótipo oncogenicidade-pro e pro-metastático. Este efeito é devido a uma mudança dramática no perfil de expressão de citocinas MSC (referido como "Educação da MSC") e pode ser prevenido pela administração do anticorpo terapêutico do receptor de interleucina-6 (IL-6R)7. Nosso trabalho demonstrou que o câncer EVs são moduladores cruciais do comportamento do MSC, proporcionando assim uma justificativa para abordagens microambiente-alvo deter a progressão do osteossarcoma. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para investigar o tumor mediada por EV-MSC interação na vivo. Este modelo destina-se a: 1) especificamente definir as alterações de câncer induzido por EV de comportamento MSC no microambiente do tumor, 2) avaliar como essa interação contribui para o crescimento do tumor ósseo e formação de metástases e 3) estudo se interferir com o crosstalk mediada por EV em vivo impede a progressão do câncer.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW32Ti</td><td>Beckman</td><td>369650</td><td>Referido no manuscrito como rotor de balde ultra-oscilante</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>Ou similar TEM</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Nikon</td><td>DMX 1200F</td><td>Ou câmera semelhante</td></tr><tr><td>Software de imagem TEM&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>Ou similar Microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Software de imagem FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R-80</td><td></td></tr> <tr><td>Freezer</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>Ou citômetro de fluxo semelhante</td></tr><tr><td>Broca</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>Com broca de 0,8 mm</td></tr><tr><td>HSS micro brocas helicoidais, 0,8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>0,8 mm broca</td></tr><tr><td>Câmera IVIS</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>Referido no manuscrito como câmera de bioluminescência. Xenogen agora faz parte do software de imagem Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen agora faz parte do Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 &micro; L Seringa</td><td>Hamilton</td><td>Neuros Modelo 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>Agulha: Agulha Hamilton RN para Seringa, 26 Gauge, Pointstyle AS, comprimento personalizado 2 cm</td><td>Hamilton</td><td>n.a.Caliper</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Astell</td><td>n.a.Heat</td><td></td></tr> <tr><td>Lamp</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>Lisado de plaquetas</td> n.a.n.a.IMDM <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>meio</td><td>Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>alfa-MEM meio</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM meio</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>caneta / estreptococo / glutamina</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>heparina</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td><forte>Células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adiposo MSCs deriverd</td> <td>n.a.n.a.GFP-positivas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MSCs</td> n.a.n.a.fibroblastos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>humanos</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Células 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Células FLUC-143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>Transduzido</td></tr><tr><td><forte>Descartáveis</forte></td> Frascos de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cultura 175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de congelamento</td><td>Thermoscientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>Tubos ultra-claros</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Referidos no manuscrito como tubos de ultra-centrífuga</td></tr><tr><td>0,22 &micro; filtro m</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200 mesh Grades de níquel revestidas de carbono</td><td>Formvar EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas de insulina de 0,5 mL com agulha 29G</td><td>Terumo</td><td>U-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro&nbsp;</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes/kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Alfa Aeser</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Braun</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeído</td><td>EMS (Ciências da Microscopia Eletrônica)</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>oxalato de uranila</td><td>EMS (Microscopia Eletrônica) Ciências)</td> <td>22510</td><td></td></tr><tr><td>acetato de urany</td><td>EMS (Ciências da Microscopia Eletrônica)</td> <td>22400</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulose</td><td>EMS (Ciências da Microscopia Eletrônica)</td> <td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>Referido no manuscrito como GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - kit de citocinas inflamatórias humanas</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído 37%</td> <td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>lâminas cirúrgicas de aço carbono</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>Referido no manuscrito como faca cirúrgica</td></tr><tr><td>anticorpo de vimentina humana</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Clone V9</td></tr><tr><td>Diluente de anticorpo</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>HRP marcado anticorpo IgG de camundongo Life</td><td>Technologies</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-buffer</td> n.a.n.a.Tampão <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de citrato</td> <td>n.a.n.a.rabbit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anticorpo policlonal anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>n.a.Ab290</td><td></td></tr> <tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paracetamol, xarope de 120 mg / 5 ml</td><td>Bayer</td><td>n.a.Sinaspril</td><td>, solução de paracetamol para crianças</td></tr><tr><td>Isoflurano 1000 mg/g</td><td>Vumc farmácia</td><td>n.a.cloridrato</td><td></td></tr> de <tr><td>buprenofina, 0,3 mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td> n.a.lidocaína-HCL <td></td><td></td></tr><tr><td>2%</td><td>Vumc farmácia</td><td>n.a.70</td><td></td></tr><tr><td>% etanol</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Cola para tecidos</td><td>Derma+Flex, cianoacrilato médico formulado</td><td>Vygon</td><td>LB604060</td></tr><tr><td>Colírios: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml</td><td>Bausch+Lomb</td><td>n.a.D-luciferina</td><td></td></tr><tr><td>, sal de potássio</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Thermo scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>Alças de aço inoxidável&nbsp;</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Mice experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&nbsp; fêmea, 6 semanas na chegada, estado bacteriano conforme FELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.Paper-pulp</td><td></td></tr> <tr><td>smart home (enriquecimento de gaiola)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.Alpha-dri</td><td></td></tr> <tr><td>material de cama</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a. </td><td></td></tr><tr><td>Comida para ratos: Teklad global 18% de proteína dieta para roedores</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td> <td>(ou similar)</td></tr> <tr><td>Pinças</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td> <td>(ou similar)</td></tr></tbody></table>

um modelo de mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre tumor e as células-tronco mesenquimais

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Dentro o microambiente do tumor, residentes ou recrutadas tronco células mesenquimais (MSCs) contribuir para a progressão maligna em vários tipos de câncer. Sob a influência dos sinais ambientais específicos, essas células-tronco adultas pode liberar mediadores parácrina, levando ao crescimento acelerado do tumor e metástases. Definir o crosstalk entre tumor e MSCs é de primordial importância para compreender os mecanismos subjacentes a progressão do câncer e identificar novos alvos para intervenção terapêutica.
As células cancerosas produzem quantidades elevadas de vesículas extracelulares (EVs), que podem afetar profundamente o comportamento das células alvo no microambiente do tumor ou em locais distantes. Tumor EVs Coloque biomoléculas funcionais, incluindo inflamatórias RNAs e proteínas (onco), que podem educar as células do estroma para melhorar o comportamento metastático de células cancerígenas ou para participar na formação pré-metastático nicho. Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de mouse de câncer pré-clínicos que permite a avaliação específica do crosstalk EV-negociada entre o tumor e as células-tronco mesenquimais. Primeiro, descrevemos a purificação e caracterização de tumor-secretada EVs e a avaliação da internalização de EV por MSCs. Então fazemos uso de um imunoensaio baseado no grânulo multiplex para avaliar a alteração do perfil de expressão de citocinas do MSC induzida pelo câncer EVs. Finalmente, podemos ilustrar a geração de um modelo de mouse de transplante ortotópico bioluminescentes de osteossarcoma que recapitula a interação de tumor-MSC e mostrar a contribuição da EV-educado MSCs para formação de crescimento e a metástase do tumor.
Nosso modelo fornece a oportunidade de definir como câncer EVs moldam um ambiente de suporte a tumor e para avaliar se o bloqueio da comunicação mediada por EV entre tumor e MSCs impede a progressão do câncer.

Neste estudo, nós exploramos a capacidade de osteossarcoma-secretada EVs para educar MSCs para um fenótipo de oncogenicidade-pro e pro-metastático. Vamos mostrar que células de osteossarcoma liberam exossomo como EVs que são internalizados por MSCs. Nós medido a alteração do perfil de expressão do cytokine MSC induzida pelo câncer EVs e avaliado o efeito dos MSCs EV-educado no crescimento do tumor e a formação de metástases. A representação geral do estudo design é ilustrada na <strong cl...

Injeção direta de câncer-derivado de vesículas extracelulares (EVs) leva a reprogramação da medula óssea, apoiando a progressão do tumor; no entanto, que as células mediam este efeito é claro. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para investigar mediada por EV células-tronco mesenquimais de tumor (MSC) interações na vivo, revelando um papel crucial para MSCs EV-educado em metástase.

Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é desenvolver um modelo pré-clínico de camundongo para estudar o papel da comunicação mediada por vesículas extracelulares entre células-tronco tumorais e mesenquimais. Este método pode ajudar a responder a várias questões-chave no campo da biologia do câncer, como as células-tronco tumorais e mesenquimais se comunicam por meio de vesículas extracelulares e se isso suporta a progressão do câncer. A principal vantagem desta técnica é que ela permite estudar o papel da adaptação das células-tronco mesenquimais por EVs de câncer, na progressão e formação de metástases in vivo.A implicação desse procedimento se estende à nossa terapia do câncer, porque podemos usar o GSA para interferir na comunicação EV e na sinalização de andrógenos para inibir a progressão do câncer. Além de fornecer informações sobre a comunicação mediada por EV no osteossarcoma, esse método também pode ser aplicado a muitos outros tipos de câncer. De fato, a medula óssea derivada das células-tronco mesenquimais é prontamente recrutada para mais locais onde podem se diferenciar em células de suporte ao câncer.Comece semeando oito frascos de 175 centímetros quadrados

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Este vídeo apresenta o procedimento cirúrgico para ressecção tumoral guiada por imagem e implantação de um bio-andaime semeado com células-tronco mesenquimais geneticamente modificadas ou MSCs expressando ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral ou TRAIL. Essas MSCs terapêuticas têm potencial no tratamento de tumores cerebrais.

Ressecção tumoral guiada por fluorescência e implantação de andaime semeado por MSC em modelo murino: um procedimento cirúrgico para entregar células-tronco mesenquimais terapêuticas na cavidade de ressecção de tumor cerebral em modelo de camundongo

Este manuscrito descreve o desenvolvimento de um modelo animal que permite testar diretamente os efeitos da hipóxia tumoral na metástase e decifrar os mecanismos de sua ação. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem no sarcoma de Ewing, uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outros tipos de tumores.

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

O modelo de matriz extracelular (BEM) de osso de osteossarcoma (OS) é bem estabelecida e mostrado aqui. Ele pode ser usado como um andaime apropriado para simulando tumor primário crescimento em vitro e fornecendo um modelo ideal para o estudo da heterogeneidade de mutagénese e histológica do sistema operacional.

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Descrito aqui está o uso de um método específico de amplificação de sondas para analisar os níveis de metilação de elementos LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma. A ultracentrífugação, procedimento popular para separar vesículas extracelulares do soro bovino fetal, também é demonstrado.

Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

Aqui, uma implantação ortotópica sinténica seguida de um procedimento de amputação do osteossarcoma com metástase pulmonar espontânea que pode ser usada para investigação pré-inlinética da biologia da metástase e desenvolvimento de novas terapêuticas é descrita.

Um modelo de rato de osteossarcoma ortotópico sintérico sprague dawley com amputação para controlar a taxa de metástase

O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

O protocolo fornece um processo detalhado de padronização da fórmula de decocção e técnica de gavagem com decocção Yiqi Jiedu no modelo de osteossarcoma de camundongos como exemplo. Descreve a proteção animal e melhora a confiabilidade dos dados de pesquisa, fornecendo estratégias eficazes para investigar a eficácia terapêutica e os mecanismos moleculares das fórmulas de decocção in vivo.

Estratégia de Gavagem para Fórmula de Decocção da Medicina Tradicional Chinesa em Camundongos Modelo de Osteossarcoma

O presente protocolo descreve o método para estabelecer um modelo de camundongo xenoenxerto derivado do paciente (PDX) usando tecido de osteossarcoma humano.

Estabelecimento de modelo de camundongo xenoenxerto derivado de pacientes com tecidos de osteossarcoma humano

Aprenda a desenvolver um modelo pré-clínico de osteossarcoma em camundongos para estudar a comunicação mediada por vesículas extracelulares entre tumor e células-tronco mesenquimais. Este método permite investigar a progressão tumoral e metástase in vivo.

Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais

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