Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera

O objetivo geral deste experimento é estadiar períodos de pupa e medir a pigmentação das asas de Drosophila guttifera. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia evolutiva do desenvolvimento, como a forma como os padrões de pigmentação são desenvolvidos em Drosophila. A principal vantagem desta técnica é que podemos obter informações detalhadas sobre o desenvolvimento morfológico e o processo de pigmentação.

Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento morfológico e o processo de pigmentação de Drosophila guttifera, ele pode ser aplicado a outras espécies de Drosophila. Para iniciar a remoção do pupário, cole um pedaço de fita dupla-face em um pedaço de papel toalha. Coloque uma pupa na fita dupla-face, com o lado ventral para cima.

Localize o espaço entre o lado anterior do pupário e a pupa interna. Segure e remova o pupário ao redor dessa lacuna, usando uma pinça. E exponha o lado anterior da cabeça da pupa.

Insira a ponta de uma pinça movendo-a paralelamente ao eixo ântero-posterior. Levante a ponta da pinça para quebrar localmente o pupário. Repita esta ação até que a quebra atinja a parte posterior do pupário.

Certifique-se de que uma lacuna seja formada entre o pupário e as pernas do pupal. E quebre o lado ventral do pupário, minimizando os danos à pupa interna. Depois de quebrar o pupário o máximo possível, retire a pupa com um pincel fino.

Coloque a pupa em um pedaço de papel de seda umedecido com ddH2O e colocado em uma placa de Petri de plástico. Tire fotos imediatamente, pois a pupa exposta é vulnerável e seca facilmente. Prossiga com a preparação da imagem e remova a porção anterior do pupário com uma pinça.

Retire a pupa e coloque-a em solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, em uma placa de Petri de plástico. Em seguida, corte a articulação basal de uma asa. À medida que a asa é dobrada, coloque-a em uma placa de Petri de plástico cheia de ddH2O para estendê-la por pressão osmótica.

Colete adultos recém-fechados uma vez a cada 10 minutos de um arquivo de estoque. Anestesiar uma mosca usando uma almofada anestésica de CO2. Confirme a anestesia por imobilidade e corte a articulação basal de uma asa.

Coloque 10 microlitros de PBS em uma lâmina de vidro. Coloque a asa na queda. E cubra a gota com uma lamínula.

Em seguida, acenda a luz do microscópio estéreo e defina-a para o máximo. Defina a lente objetiva para 11,5x e defina a abertura para o estado mais aberto. Em seguida, ligue a câmera e configure-a.

Foque na amostra movendo o botão de foco do microscópio. Pressione o botão do obturador da unidade de controle remoto para tirar uma imagem. Tire uma imagem da asa, centralizando um sensillum campaniforme, posicionando a parte distal da asa no lado esquerdo e a parte interna da asa no lado superior.

Abra uma imagem com o ponto sensillum campaniforme no centro. Clique em Imagem, Tipo 1, 8 bits, para converter a imagem em uma imagem de 8 bits. Clique em retângulo nas ferramentas de seleção de área e desenhe um retângulo.

Defina o lado direito do retângulo de forma que fique localizado à direita do ponto sensillum campaniforme. Clique em Editar, Seleção, Adicionar ao Gerenciador e marque a coluna Mostrar Tudo. Em seguida, clique na ferramenta de ângulo nas ferramentas de seleção de linha.

Desenhe a primeira linha na linha posterior da terceira veia longitudinal. Defina as extremidades esquerdas da linha no vértice do retângulo desenhado anteriormente. Desenhe a segunda linha no lado superior do retângulo.

Pressione a tecla M para medir o ângulo entre as duas linhas desenhadas nesta etapa. Clique na janela da imagem na tela do computador. Clique em Editar, Seleção, Adicionar ao gerente.

Clique no retângulo nas ferramentas de seleção de área e desenhe um retângulo com aproximadamente 1/9 do tamanho da janela de imagem. Clique em Editar, Seleção, Girar. Escreva os graus negativos do ângulo medido anteriormente na coluna Ângulo e clique em OK para girar o retângulo desenhado nesta etapa.

Mova o retângulo desenhado usando as teclas de seta e defina o ponto final da linha posterior da segunda veia longitudinal no lado esquerdo do retângulo. E o lado inferior do retângulo, anexa-se à linha posterior da terceira veia longitudinal. Confirme se uma linha perpendicular do ponto final da segunda veia longitudinal até a linha posterior da terceira veia longitudinal foi traçada.

Defina o pé da linha perpendicular como ponto A.Registre a coordenada X e a coordenada Y do ponto A, indicadas abaixo das ferramentas de seleção de área ao colocar o cursor no ponto A.Abra a imagem com o ponto A no centro. Clique em Imagem, Tipo, 8 bits, para converter a imagem em uma imagem de 8 bits. Clique no retângulo nas ferramentas de seleção de área e desenhe um retângulo de aproximadamente 1/9 do tamanho da janela de imagem.

Clique em Editar, Seleção, Especificar. Marque a coluna Oval e Centralizado. Escreva 100 pixels nas colunas width e height.

Escreva as coordenadas X do ponto A na coluna de coordenadas X e escreva as coordenadas Y do ponto A na coluna de coordenadas Y e clique em OK. Em seguida, clique em Analisar e medir. Se a calibração já tiver sido concluída, os ODs são indicados na coluna Média. A comparação dos dados de vários estágios revelou que o estágio P12 é o momento do início da pigmentação e que a pigmentação é concluída 12 horas após a eclosão.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia evolutiva do desenvolvimento explorarem as diferenças no desenvolvimento da pupa e no processo de pigmentação entre as espécies de Drosophila.