Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

O objetivo geral deste protocolo é combinar a coloração por imunofluorescência com hibridização in situ fluorescente de DNA em um fio funcionalizado em 3D e identificar sinais de imunofenótipo e FISH no suporte usando um microscópio de fluorescência de campo amplo convencional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da caracterização secretora de células tumorais, como a identificação de alvos relacionados à terapia em células circulantes de câncer de pulmão de células não pequenas. A principal vantagem deste protocolo é permitir a identificação simultânea de parâmetros fenotípicos, como positividade de EpCAM, e alterações citossomáticas, como o status do gene ARC, para detectar CTCs putativas.

Embora este método tenha sido projetado exclusivamente para fornecer recursos de CTC de câncer de insulina in situ, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros tipos de câncer, como o câncer de mama. Desenvolvemos este protocolo durante o manuseio do fio para imunofenotipagem direta e detecção de CTC. Para obter mais dados, associamos um protocolo de imunofenotipagem a um protocolo de hibridização in situ de fluorescência de DNA.

O manuseio do fio não é fácil, principalmente porque a ponta funcionalizada é frágil. Uma demonstração visual fará com que os leitores reproduzam as etapas. Para iniciar o experimento, ressuspenda todo o conteúdo de um frasco T75 que está a 80% de confluência em um frasco de cinco mililitros usando quatro mililitros de meio completo.

Em seguida, remova o fio da embalagem de vidro. Mergulhe a parte dourada funcionalizada do fio no frasco, garantindo que a rolha do fio seja à prova d'água para um frasco de cinco mililitros. Sele o fio com filme de laboratório.

Em seguida, incube o fio em um rotador de tubo por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a rotação, enxágue o fio três vezes em uma solução PBS usando três frascos limpos diferentes e espere o fio secar. Depois de secar o fio ao ar por 10 minutos em um exaustor, fixe as células mergulhando o fio em solução de acetona a 100% em um tubo de cinco mililitros por 10 minutos em temperatura ambiente.

Certifique-se de que não haja vestígios de acetona na ponta funcionalizada. Seque o fio ao ar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, em um tubo de cinco mililitros, lave o fio duas vezes em PBS de uma dobra.

Incube o fio em tampão de diluição de anticorpos. Prepare 150 microlitros de mistura de anticorpos com uma diluição de anticorpo primário monoclonal conjugado com fluorocromo e tampão de diluição de anticorpos especificado na folha de dados. Em seguida, use uma ponta P200 para extrair o fio da rolha do fio e insira suavemente o fio através do orifício maior da ponta.

Insira a extremidade não funcionalizada primeiro e puxe lentamente o fio pelo orifício menor até que a parte dourada esteja logo além do orifício maior. Adicione suavemente 150 microlitros da mistura de anticorpos na ponta. Para evitar o risco de formação de bolhas, gire suavemente o fio até que a extremidade funcionalizada esteja completamente mergulhada.

Sele o orifício da ponta e enrole o filme de laboratório ao redor do orifício. Incube o fio verticalmente durante a noite no escuro a quatro graus Celsius. No segundo dia, bloqueie a incubação de anticorpos lavando o fio duas vezes em PBS de uma dobra.

Reinsira o fio em sua rolha de fio. Três horas antes do protocolo DNA-FISH, ajuste o forno de hibridização para 75 graus Celsius e ajuste o forno de calor seco para 37 graus Celsius. Resfrie a solução SSC de 0,4 vezes a quatro graus Celsius.

Lave o fio três vezes em solução SSC de 0,4 vezes gelada. Seque o fio no escuro sob o armário do exaustor por 10 minutos. Após 10 minutos, vórtice e gire a sonda por cinco segundos.

Coloque 10 microlitros da sonda em microtubos de vidro e cubra-os com filme de laboratório. Embrulhe os microtubos em papel absorvente seco. Coloque em um tubo de 50 mililitros e gire-os brevemente.

Coloque cuidadosamente o fio seco no microtubo e insira a rolha de arame. Em seguida, sele a rolha de arame com cimento de borracha. Coloque o fio em uma câmara úmida escura no forno de hibridização por oito minutos a 75 graus Celsius para obter a desnaturação completa do DNA.

Após oito minutos, mova a câmara úmida para um forno de calor seco a 37 graus Celsius durante a noite. Coloque o frasco de coloração deslizante com solução SSC de 0,4 vezes em um banho-maria a 72 graus Celsius. Verifique a temperatura da solução SSC de 0,4 vezes até atingir 72 graus Celsius para mais ou para menos.

Em seguida, prepare dois copos de vidro. Um com duas vezes SSC mais solução de 0,05% Tween e o segundo com água destilada. Remova a câmara úmida do forno de calor seco.

Use uma pinça para remover cuidadosamente o cimento de borracha da rolha de arame e puxe a extremidade não revestida do arame através da rolha de extremidade, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada. Mergulhe o fio na solução SSC de 0,4 vezes por dois minutos a 72 graus Celsius. Lave o fio em solução dupla SSC mais 0,05% Tween por 30 segundos em temperatura ambiente.

Em seguida, lave o fio em água destilada em temperatura ambiente. Seque o fio sob a hotte por 10 minutos no escuro. Incube a ponta funcionalizada do fio com solução DAPI previamente preparada em um frasco de dois mililitros.

Enxágue o fio duas vezes em PBS dobrado e seque o fio ao ar. Posicione o fio no suporte do fio e insira cuidadosamente a ponta funcionalizada através do ponto de entrada do suporte especial até que a ponta corresponda ao ponto de acoplamento. Coloque o suporte especial na platina do microscópio.

Ajuste o foco do microscópio usando uma lente de 20 vezes. Primeiro, concentre-se grosseiramente no suporte especial e, em seguida, ajuste finamente nas células que parecem brilhantes no canal DAPI. Foque apenas as células centrais da lente e adquira imagens usando uma câmera digital de 12 bits em objetivas de 20x e 40x com filtros apropriados para sondas vermelhas, verdes e azuis.

Por fim, prepare o fio para armazenamento de longo prazo, embalando o fio próximo à ponta funcionalizada e insira cuidadosamente o fio em um tubo de vidro. Armazene o fio vertical ou horizontalmente a 20 graus Celsius negativos. A coloração por imunofluorescência não interferiu nos sinais de DNA-FISH.

Quando o ensaio imuno-DNA-FISH foi realizado no fio funcionalizado de suporte 3D, a coloração EpCam foi claramente visível. A sonda ALK revelou a deleção do gene. A linhagem celular NCI-H3122 mostrou um status aberrante do gene LAK em contraste com o NCI-H1975 com um ALKG do tipo selvagem.

Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em nove horas de trabalho totais ao longo de três dias. Ao tentar este procedimento, é importante não tocar na parte funcionalizada do fio para evitar qualquer dano. Diferentes anticorpos e sondas FISH podem ser usados seguindo este protocolo para responder a perguntas adicionais, como identificar células com outros marcadores fenotípicos e outras alterações citogenéticas, como amplificação do gene NAT ou HAR2.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar CTCs putativas simultaneamente por meio de parâmetros fenotípicos, como positividade de EpCAM, e detectar alterações citogenéticas, como status do gene ARC. Não se esqueça de que trabalhar com acetona e forno pode ser extremamente perigoso. Precauções como manusear acetona no capuz e usar luvas de proteção devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.