Name: Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a caracterizar células tumorais circulantes combinando imunofluorescência com hibridização in situ fluorescente de DNA em fio funcionalizado 3D. Este método permite identificar simultaneamente marcadores imunofenotípicos e alterações genéticas em amostras de sangue.

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1. imuno-DNA peixes em uma lamela 2D
<ol>
	<li>Célula de preparação e aderente de lamela semeadura Nota: Execute todas as etapas a seguir sob uma capa de fluxo laminar em condições estéreis.<ol>
		<li>Mergulhe a lamela em etanol 100% para desinfectá-los. Nota: Nós usamos 12 mm × 12 mm com suporte do silicone quadrado lamelas (todos os reagentes são listados na Tabela de materiais).</li>
		<li>Coloque as lamelas em uma placa de Petri (100 mm de diâmetro). Usando seco forçou o fluxo de ar por 5 min.</li>
		<li>Lave a placa de Petri com fosfato de 15 mL estéril 1 × Dulbecco tampão salino (PBS).</li>
		<li>Lave a placa de Petri com 10 mL de meio completo (ver tabela 1).</li>
		<li>As células aderentes de sementes (aproximadamente 1.650.000 células em 10 mL de meio, contadas por análise de FACS) soltando suavemente a suspensão de células para o prato de Petri para obter chapeamento célula uniforme (cerca de 30.000 células/cm2). Nota: Para ~ 70% confluência, aderente as células devem ser cultivadas em lamelas pelo menos 48 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fixação e permeabilização Atenção: A acetona é um inflamável e irritante substância volátil. Use apenas resistente a acetona plásticos ou recipientes de vidro (sem PVC ou PVDF). Nota: Execute estas etapas sob uma coifa de química.<ol>
		<li>Remova o meio de cultura usando uma pipeta descartável aspiração.</li>
		<li>Lave a placa de Petri com 1 × PBS.</li>
		<li>Usando uma pinça, lave as lamelas mergulhando-os em um copo de vidro contendo 5 mL de 1 × PBS.</li>
		<li>Seque as lamelas em papel mata-borrão.</li>
		<li>Consertar as células na lamela por imersão em uma solução de acetona 100% por 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Remova a lamínula por pinças. Lamela seca usando um fluxo de ar forçado por 5 min. Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto. A lamela deve ser armazenada a-20 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imunofluorescência dia 1 Nota: Esta fase envolve uma incubação (O/N) durante a noite (~ 16 h).<ol>
		<li>Lave as lamínulas no 1 × PBS duas vezes.</li>
		<li>Soltar a 100 µ l de tampão de diluição de anticorpo (ver tabela 1 para obter detalhes) no sentido do lamela e incube por 30 min em RT Nota: O volume da solução deve ser ajustada com base na superfície de lamela para cobrir a lamela toda e evitar o risco de estouro.</li>
		<li>Preparar a mistura de anticorpo (tabela 1), usando um 01:20 diluição de anticorpo primário monoclonal conjugados com fluocromo e anticorpo tampão de diluição, conforme especificado na folha de dados fornecida pelo fabricante. Nota: É recomendável usar anticorpos monoclonais conjugados com fluocromo thermostable. Se um não-thermostable fluorocromo é usado, a temperatura utilizada durante as etapas de DNA-peixe do protocolo pode danificar o fluorocromo e extinguir as emissões fluorescentes. Neste protocolo, optou-se por um anticorpo EpCAM-FITC (01:20 diluição), que não mostrou quaisquer problemas significativos com a temperatura utilizada.</li>
		<li>Enxague as lamelas duas vezes em 1 × PBS.</li>
		<li>Coloque as lamelas célula-lado em um úmido câmara e soltar 100 µ l do mix anticorpo na lamela. Nota: O volume da solução deve ser ajustada com base na superfície de lamela para cobrir a lamela toda e diminuir o risco de estouro.</li>
		<li>Incubar O/N (~ 16 h) no escuro a 4 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2º dia de imunofluorescência
	<ol>
		<li>Bloquear a incubação do anticorpo lavando as lamelas em 1 × PBS duas vezes. Nota: Loja as lamelas imerso em 100 µ l de 1 × PBS a 4 ° C em uma câmara com ambiente úmido constante no escuro até que o ensaio de peixe é executado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA-peixe 2D dia 2 Atenção: Deve ser atenção especial para a alta temperatura dos instrumentos e a câmara húmida.<ol>
		<li>Configurar o forno de hibridização e o calor seco (~ 3 h antes de iniciar o protocolo de DNA-peixe). Programar o forno de hibridização em 75 ° C, programar o forno de calor seco a 37 ° C e esfriar a solução SSC 0,4 × (pH = 7,0 ± 0,1) (para receita SSC ver tabela 1) a 4 ° C. Nota: o status de pH de buffers de peixe é crítico: pH = 7,0 ± 0,1.</li>
		<li>Lave a lamela três vezes gelada 0,4 × SSC solução.</li>
		<li>Seque a lamela sob uma coifa química por 10 min no escuro.</li>
		<li>Vórtice de 10 s e realizar uma volta rápida para baixo (a taxa máxima) da sonda da parede do tubo-sonda.</li>
		<li>Coloque a lamela celular-lado para baixo em uma gota de 5 µ l de sonda de peixe em um slide e selo todas as bordas da lamela com cimento de borracha. Atenção: Nas duas próximas etapas envolvem altas temperaturas. Use luvas protetoras.</li>
		<li>Colocar o slide em uma câmara escura úmida no forno durante 8 min a 75 ° C para completa desnaturação do ADN da hibridação.</li>
		<li>Mova a câmara húmida para a estufa de calor seco a 37 ° C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA-peixe 2D dia 3
	<ol>
		<li>Definir o banho de água a 72 ° C e coloque um frasco de slide-coloração com buffer SSC 0,4 × nele (tabela 1). Depois de 30 min, verifique a temperatura do buffer 0,4 × SSC, que deve estar em 72 ± 1 ° C.</li>
		<li>Prepare dois copos de vidro: um com 2 × SSC + 0,05% Tween buffer (pH = 7,0 ± 0,1) (tabela 1) e outro com água destilada.</li>
		<li>Retire a câmara húmida do forno, cuidadosamente remova o cimento de borracha do slide e desanexar a lamela com uma pinça.</li>
		<li>Lave a lamela mergulhando em 0,4 × SSC por 2 min a 72 ° C.</li>
		<li>Lave a lamela mergulhando no 2 × SSC + 0,05% Tween reserva por 30 s.</li>
		<li>Enxágue a lamela em água destilada.</li>
		<li>Seque as lamelas sob uma coifa química por 10 min no escuro.</li>
		<li>Monte a lamela em meio líquido de montagem com 1,5 µ g/mL de 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para counterstain DNA total. Coloque a lamela celular-lado para baixo em uma gota de 5 µ l de meio de montagem em um slide, pressione a pinça na lamela para obter o ar para fora e selar com unhas polonês. Nota: Volume médio de montagem deve ser ajustada em função do tamanho da superfície da lamela.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise e observação do microscópio 2D Nota: As imagens podem ser adquiridas com sistemas diferentes de microscópio.</li></ol>Utilizamos um microscópio fluorescente convencional, dotado de um software comercial padrão para aquisição de imagens (Tabela de materiais).<ol>
		<li>Adquirir imagens usando uma câmera digital de 12 bits e 20 × / 0,50 ND e objectivo de at 40 × / 0,65 com filtros adequados para vermelho (excitação: 599 nm, emissão: 588 nm), verde (excitação: 509, emissão: 524) e azul (excitação: 367 nm, emissão: 452 nm) sondas.</li>
		<li>Analise imagens usando a ferramenta de software de escolha. Nota: Para avaliar a mancha da imunofluorescência e a localização de ALK-sonda, usamos ImageJ. Slides podem ser armazenados a-20 º C no escuro por um período máximo de 3 semanas. Para armazenamento prolongado, sugerimos usar o meio de montagem específico para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
	

2. imuno-DNA peixe no fio
<ol>
	<li>Célula linha pico-no fio (suporte 3D) Nota: A configuração preliminar envolve uma exata seleção de aderente células linhas com base em EpCAM-positividade. O fio é acrescido com anticorpos anti-EpCAM para que apenas as células EpCAM positivo estão manchadas. Nota: Não toque a parte funcionalizada do fio para evitar qualquer dano. Nota: Todas as etapas devem ser efectuadas sob uma capa de fluxo laminar em condições estéreis.<ol>
		<li>Resuspenda todo o conteúdo de um frasco de T75 (80% confluência) em um frasco de 5 mL, utilizando 4 mL de meio completo; por um único pico-no, cerca de 2.000.000 células são recomendadas para maximizar a adesão de células para o fio.</li>
		<li>Retire o fio da sua embalagem de vidro.</li>
		<li>Mergulhe a parte funcionalizada ouro do fio dentro do frasco, garantindo que o fio-rolha é um ajuste à prova d'água para o frasco. Vede com filme de laboratório. Nota: Recomenda-se o uso de tubo de 5 mL para permitir que uma correspondência correta entre o fio-rolha e o tubo de ensaio.</li>
		<li>Incubar durante 30 min em RT em um rotador de tubo (0-120 ângulo).</li>
		<li>Enxágue o fio três vezes em solução de PBS × 1 usando 3 diferentes frascos limpos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fixação e permeabilização Atenção: A acetona é uma substância inflamável que pode irritar o trato respiratório. Só uso acetona-resistente plásticos ou recipientes de vidro (sem PVC ou PVDF). Nota: Execute estas etapas sob uma coifa de química.<ol>
		<li>Secar ao ar livre do fio.</li>
		<li>Corrigi as células por mergulhar o fio numa solução de acetona 100% por 10 min em RT. Use um tubo de 5 mL. Nota: O fio-rolha não deve entrar em contacto com o fixador.</li>
		<li>Secar ao ar livre do fio durante 5 min à RT Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O fio deve ser armazenado a-20 ° C. Ao embalar o fio para armazenamento a longo prazo, colocar a rolha de fio ao lado da ponta funcionalizada e inserir o fio cuidadosamente o tubo de vidro do armazenamento, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada. Fechar o vidro do armazenamento e armazenar (verticalmente ou horizontalmente) a-20 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imunofluorescência dia 1 Nota: Esta fase envolve uma incubação O/N (~ 16 h).<ol>
		<li>Lave duas vezes 1 × PBS solução usando tubo de 5 mL.</li>
		<li>Incube o fio no tampão de diluição de anticorpo durante 30 min à RT usando tubo de 5 mL.</li>
		<li>Prepare 150 µ l de mistura de anticorpo com uma diluição de anticorpo primário monoclonal conjugado com fluocromo em tampão de diluição de anticorpo, conforme especificado na ficha. Por exemplo, o anticorpo EpCAM-FITC foi usado com um 01:20 diluição.</li>
		<li>Use uma ponta de p200 para realizar a incubação, como segue: extrair o fio a fio-rolha e inserir delicadamente o fio através do furo maior da ponta. Insira a extremidade unfunctionalized primeiro e puxe lentamente o fio através do furo menor até a parte de ouro é apenas além do furo maior.</li>
		<li>Solte suavemente 150 µ l do mix anticorpo (por exemplo, anti EpCAM_FITC anticorpo 01:20 diluído) na ponta. Para evitar o risco de formação de bolha, Gire suavemente o fio até a parte funcionalizada é completamente mergulhada.</li>
		<li>Selem o buraco da ponta. Envolvimento de filme de laboratório ao redor do buraco pode ajudar.</li>
		<li>Incube verticalmente O/N (~ 16 h) no escuro a 4 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2º dia de imunofluorescência
	<ol>
		<li>Bloquear a incubação do anticorpo lavando o fio duas vezes em 1 × PBS.</li>
		<li>Re-insira o fio em seu fio-rolha. Nota: Loja em 1 X PBS a 4 ° C em 5 mL de um frasco até que o ensaio de peixe é executado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA-peixe 3D dia 2 Atenção: Deve ser atenção especial para a alta temperatura da câmara húmida e instrumentos.<ol>
		<li>Configurar o forno de hibridização e o calor seco (~ 3 h antes de iniciar o protocolo de DNA-peixe). Definir o forno de hibridização em 75 ° C, o forno de calor seco a 37 ° C e esfriar a solução SSC 0,4 × (pH = 7,0 ± 0,1) a 4 ° C. Nota: O status de pH de buffers de peixe é fundamental e deve ser 7,0 ± 0,1.</li>
		<li>Lave o fio 3 vezes gelada 0,4 × SSC solução. Nota: Mantenha o fio no escuro para evitar fluorocromo fotobranqueamento durante os procedimentos a seguir.</li>
		<li>Seco por 10 min no escuro sob a hotte.</li>
		<li>Vórtice e girar a sonda por 5 s.</li>
		<li>Caem 10 µ l da sonda ocopo microtubos. Cubra com filme de laboratório.</li>
		<li>Girar os microtubos da seguinte forma: envolva o microtubo em um seco colocar absorvente, papel para um tubo de 50 mL e girar brevemente.</li>
		<li>Cuidadosamente coloque o fio seco para o microtubo e inserir o fio-rolha. Selar com cimento de borracha. Atenção: Nas duas próximas etapas envolvem altas temperaturas.</li></ol></li></ol>Use luvas protetoras.
		<li>Coloque o fio em uma câmara escura úmida no forno durante 8 min a 75 ° C para obter completa desnaturação do ADN da hibridação.</li>
		<li>Mova a câmara húmida para uma estufa de calor seco a 37 ° C O/N.</li>
	
	
	<li>DNA-peixe 3D dia 3
	<ol>
		<li>Colocar um slide coloração frasco com solução SSC × 0,4 em um banho de água e definir a 72 ° C.</li>
		<li>Verifique a temperatura de solução 0,4 × SSC até atingir 72 ± 1 ° C.</li>
		<li>Prepare dois copos de vidro, com 2 × SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1) solução e o segundo com água destilada.</li>
		<li>Retire a câmara húmida do forno calor seco, Retire cuidadosamente o cimento de borracha do fio-rolha usando uma pinça e retire o fio. Nota: Puxe cuidadosamente a extremidade sem revestimento do fio através da IN-Stopper, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada.</li>
		<li>Mergulhe o fio na solução SSC × 0,4 por 2 min a 72 ° C.</li>
		<li>Lave o fio em 2 × SSC + 0,05% Tween solução por 30 s no RT</li>
		<li>Lave o fio em água destilada em RT</li>
		<li>Seque o fio sob a coifa por 10 min no escuro.</li>
		<li>Prepare uma solução stock de DAPI de 1,43 µM em 2 mL de 1 × PBS.</li>
		<li>Incubar a funcionalizados ponta do fio com solução DAPI em um frasco de 2ml por 1h no escuro no RT</li>
		<li>Enxágue o fio duas vezes em 1 × PBS e deixe secar naturalmente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise e observação do microscópio 3D
	<ol>
		<li>Posição do fio no porta fio. Com cuidado, introduza a ponta funcionalizada através do ponto de entrada do titular especial, até que a ponta coincide com o ponto de engate. Tenha cuidado para não danificar a ponta funcionalizada (Figura 1a).</li>
		<li>Coloque o suporte especial no palco do microscópio. Ajuste o foco do microscópio usando uma lente de 20 ×. Primeiro grosseiramente focar o apoio especial e ajustar finamente em células que aparecem brilhantes no DAPI-canal.</li>
		<li>Só colocar em foco as células central para a lente. Nota: As imagens podem ser adquiridas com sistemas diferentes de microscópio. Neste cenário, nós usamos um microscópio fluorescente convencional, dotado de um software comercial padrão para aquisição de imagens.</li>
		<li>Adquirir imagens usando uma câmera digital de 12 bits e 20 × / 0,50 ND e objectivo de at 40 × / 0,65 com filtros adequados para vermelho (excitação: 599 nm, emissão: 588 nm), verde (excitação: 509, emissão: 524) e azul (excitação: 367 nm, emissão: 452 nm) sondas. Nota: Imagens podem ser visualizadas utilizando software e ferramentas diferentes. Nós usamos o ImageJ para avaliar a mancha da imunofluorescência e localização de ALK-sonda. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O fio deve ser armazenado a-20 ° C. Ao embalar o fio para armazenamento a longo prazo, colocar a rolha de fio ao lado da ponta funcionalizada e inserir o fio cuidadosamente o tubo de vidro do armazenamento, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada. Fechar o vidro do armazenamento e armazenar (verticalmente ou horizontalmente) a-20 ° C.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
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<li>Theil, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+new+CellCollector+to+isolate+circulating+tumor+cells+from+the+blood+of+patients+with+different+stages+of+prostate+cancer+and+clinical+outcomes+-+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study.</a> PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Neste trabalho, pela primeira vez, um método combinando a mancha da imunofluorescência e peixe de DNA, para uso com o fio funcionalizado foi proposto. O método foi chamado imuno-DNA de peixes. Esta técnica foi desenvolvida para permitir a identificação simultânea de CTC putativo num arame 3D com base em parâmetros fenotípica, tais como positividade para EpCAM (evento 1) e para facilitar a detecção de alterações moleculares, como ALK gene estatuto ( evento 2). A identificação simultânea dos dois eventos permite a detecção da sua localização co. Portanto, esta abordagem pode ser adaptada para identificar e caracterizar o CTC obtida do sangue de pacientes com câncer. Os efeitos potenciais sobre o procedimento de coloração de haemo-componentes e leucócitos geralmente não interferem com o procedimento. Em particular, dados relatados na literatura indicaram que haemo-componentes e leucócitos não influenciam a mancha da imunofluorescência das células anexadas para o fio, o passo fundamental para identificar o real CTC1,15.
O brilho da fluorescência de peixe imuno-DNA é um pouco menos marcado do que a de um tradicional immunophototyping do ensaio e é o resultado da alta temperatura necessária para o ensaio de peixe. No entanto, a mancha da imunofluorescência é ainda apreciável. Por exemplo, um sinal fraco é ainda detectável na baixa EpCAM-expressando linhagem celular, NCIH1975. A alta temperatura necessária para o ensaio de peixe é o principal fator limitante na hora de escolher o certo fluorocromo ligado ao anticorpo. Neste protocolo, anticorpos devem ser vinculados a um fluorocromo thermostable para tolerar a temperatura de desnaturação do DNA. Por exemplo, ficoeritrina, um fluorocromo termossensível, não é recomendada neste cenário por causa da degradação de fluorocromo causada pela alta temperatura. Isotiocianato de fluoresceína é uma boa escolha e muitas vezes comum fluorocromo empregada em sondas de peixe. O sinal de autofluorescência imuno-DNA de peixes é muito pobre em suportes 2D padrão. Com o apoio de fio, camada de polímero pode induzir um sinal de autofluorescência ligeira, especialmente no canal vermelho. Ao contrário de segundo plano 2D, um sinal de fundo de controvérsias é discernível no fio mas não afeta significativamente a caracterização de identificação ou de células de núcleos.
Avaliação de microscópio do fio é muito mais cansativo do que num suporte 2D devido os limites do microscópio óptico na leitura da superfície de uma estrutura 3D em forma cilíndrica. No entanto, essa dificuldade pode ser superada girando o titular de fio e adquirir as imagens que são principalmente localizadas ao longo da linha mediana do fio. O titular do fio permite uma rotação de 360 ° do fio. Uma vez que enfoca os núcleos, mudar os canais de fluorescência não necessariamente mantém o foco na área-alvo. Por esta razão, é essencial para manter o foco na área de alvo interno-pilha.
Esta técnica pode ser adaptada para detectar e caracterizar as células em diferentes tipos de suporte 3D. Também pode ser possível usar anticorpos diferentes e sondas de peixe. Ao escolher usar anticorpos diferentes, estabilidade térmica fluorocromo e o nível de expressão do antígeno alvo na membrana celular são fatores importantes a considerar. Intracitoplasmática antígenos também podem ser manchados. Quando usar peixes diferentes sondas, é importante verificar as especificações de folha de dados para o processo de desnaturação e preparar células para o peixe do ensaio em conformidade.

CTC representa uma etapa chave de câncer célula difusão1. Sua presença no sangue periférico de pacientes está associada (metastático) recaída e doença progressão2,3. CTC isolamento e caracterização do sangue de pacientes com câncer é um tipo de biópsia líquida não-invasiva. Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais evidente que a progressão e a resposta de tumores de diferentes tratamentos usando este tipo de análise de monitoramento fornece importantes informações clínicas4,5. Biópsia líquida é ainda mais útil quando a cirurgia não é viável ou quando o tecido do tumor primário não está disponível, ou seja, para lesões não-biopsiable. Portanto, esta abordagem é promissor em configurações de câncer específicos como NSCLC metastático, onde a presença do CTC foi mostrada para ter um papel prognóstico negativo6. NSCLC é um tumor que beneficia especialmente de abordagens terapêuticas alvo7,8,9 , projetado para funcionar em moléculas específicas (alvos moleculares) conhecidas por estar envolvido no crescimento, progressão, e propagação da doença. Portanto, a detecção de alvos específicos durante a progressão da doença é necessária. Investigação do CTC é uma abordagem de diagnóstica extremamente interessante para detectar e monitorar alvos de drogas sem a necessidade de tecidos primários ou metastáticos. Por exemplo, a detecção de translocações de gene ALK em células CPNPC é associada com sensibilidade para crizotinib, uma terapia-alvo específico10. No entanto, actualmente, a detecção de translocações ALK é executada apenas em agulha fina aspirados ou biópsias pequenas; Como resultado, sem um tumor tecido análise ALK não é possível. CTC é uma alternativa potencial para tumor investigações baseadas em tecido e representa uma abordagem diagnóstica do companheiro altamente promissor.
Apesar de sua importância potencial, CTC é ainda um assunto de grande debate entre pesquisa, principalmente por causa de sua raridade (1-10 células/mL de sangue periférico,11). Métodos de biópsia líquida atual usam uma quantidade limitada de sangue (ou seja, 1-30 mL)12,13, mas isso cria uma situação de qualidade inferior sensibilidade para a detecção de CTC. daí, pesquisa está garantida para encontrar abordagens e desenvolvendo dispositivos para realizar biópsias de líquido CTC-alvo em um volume maior de sangue periférico.
Um dispositivo alternativo, um fio de médico funcionalizado (ver Tabela de materiais), foi desenvolvido para superar as limitações de recolha de amostras de sangue e obter uma análise mais representativa do CTC. Este fio funcionalizado é um dispositivo médico que capta CTC directamente a partir da corrente sanguínea de pacientes de câncer1CE-aprovado. É composto de um fio de aço inoxidável de 16 cm de comprimento (Figura 1a) com uma ponta funcionalizada de 2 cm de comprimento, revestida com uma camada de 0,2 µm de espessura de ouro. A camada por sua vez é coberta por um estrato de hidrogel de 1 a 5 µm de espessura policarboxilato covalentemente juntamente com anticorpos dirigidos contra o EpCAM, um dos mais amplamente expressos antígenos na superfície do CTC14. A funcionalizados ponta do fio é introduzida em uma veia do braço do paciente e permanece em posição durante pelo menos 30 min. Esta abordagem permite o isolamento do CTC em vivo, diretamente no sangue periférico e a tela de cerca de 1,5-3,0 L de sangue (aproximadamente 300-fold mais do que o volume usado para métodos alternativos)1.
Pantel et al. demonstrou a eficácia desta abordagem no isolamento do CTC diretamente para as veias do braço de câncer de pulmão pacientes15. Eles tocaram imunofluorescência fio coloração para identificar CTC usando convencionais anticorpos dirigidos contra EpCAM e pan-cytokeratin e CD45 para a deteção de leucócito. O fio foi examinado sob um microscópio de fluorescência óptico15. Os autores demonstraram que o dispositivo foi capaz de isolar o CTC, mas eles não investigou todos os alvos terapia-relacionados, tais como translocações ALK.
O método apresentado visa identificar putativo CTC em linhas de células CPNPC com base em parâmetros fenotípica, por exemplo, EpCAM positividade e a presença de biomarcadores moleculares, por exemplo, o status ALK (Figura 1b). Este procedimento 3-dia-longo combina um fio funcionalizado e mancha com DNA fluorescênciain situ-hibridização DNA, chamado imuno-DNA-peixe. Dado que o CTC é entidades raras, a vantagem deste protocolo é que a CTC pode ser caracterizado no mesmo fio em termos recursos imunofenotípica e rearranjos do DNA.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>Carlo Erba</td><td># 414605</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIO RAD</td><td># 1706531</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Saline)&nbsp;</td><td>Medicago</td><td># 09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 534064-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td># A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Detergente</td><td>BIO RAD</td><td># 1610407</td><td></td></tr><tr><td>RUBBERCEMENT</td><td>Royal Talens</td><td># 95306500</td><td></td></tr><tr><td>Vysis 20X SSC (66g)</td><td>Abbott Molecular Inc.&nbsp;</td><td># 30-804850</td><td>pó a ser ressuspenso em H2O destilado, conforme recomendado</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td># 31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>Gibco</td><td># 10270-098</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200mM)</td><td>Gibco</td><td># 25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>H20</td><td>Sondas MetaSystems MilliPore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XT ALK BA</td><td>#</td> <td>D-6001-100-OG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, grau FluoroPure</td><td>Invitrogen</td><td># D21490</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade Mountant com DAPI</td><td>Life Technologies</td><td># S36973</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM-FITC (clone: HEA-125)</td><td>Mitenyi</td><td># 130-080-301</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubos M-Tube18</td><td>Gilupi Nanomedizin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor CANCER01 EpCAM</td><td>Gilupi Nanomedizin</td><td></td><td>Fio Funcionalizado</td></tr><tr><td>STAR FROST Lâminas</td><td>de Microscópio Knittel GL&Auml; SER</td><td>VS1117# 076FKB</td><td></td></tr><tr><td>SecureSlip Silicone Supported Coverglass</td><td>GRACE BIO-LABS</td><td># 104112</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Microscópio Fluorescente Axioskop&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 Software de 64 bits</td><td>Nikon</td><td>BR 4.11.00</td><td></td></tr><tr><td>Nikon DS-QiMc Câmera digital de 12 bits</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3d baseado no dna peixe e imunofluorescência

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulantes de células de tumor (CTC) está associados a sobrevivência pobre em câncer metastático. Sua identificação, fenotipagem e genotipagem poderiam levar a uma melhor compreensão da heterogeneidade do tumor e, assim, facilitar a seleção de pacientes para tratamento personalizado. No entanto, isso é dificultado por causa da raridade do CTC. Apresentamos uma abordagem inovadora para a recolha de um alto volume de sangue do paciente e obtenção de informações sobre presença, fenótipo e gene translocação do CTC. O método combina a mancha da imunofluorescência e DNA fluorescentein situ-hibridização DNA e é baseado em um fio de médico funcionalizado. Este fio é um dispositivo inovador que permite o isolamento na vivo da CTC de um grande volume de sangue periférico. O volume de sangue projectado por uma administração de 30-min do fio é aproximadamente 1,5-3 L. Para demonstrar a viabilidade desta abordagem, expressão de molécula (EpCAM) de aderência de célula epitelial da translocação cromossômica do gene ALK determinaram e pulmão não-pequenas células (NSCLC) em células cancerosas no capturado pelo fio funcionalizado e manchado com uma abordagem de peixe imuno-DNA. Nosso principal desafio foi para realizar o ensaio em uma estrutura 3D, o fio funcionalizado e determinar a imuno-fenótipo e sinais de peixe sobre este suportam usando um microscópio de fluorescência convencional. Os resultados obtidos indicam que captura CTC e analisando seu fenótipo e rearranjo cromossômico poderiam potencialmente representam uma nova abordagem de diagnóstico complementar e fornecer uma inovadora estratégia para melhorar personalizada tratamentos contra o cancro.

Usando o procedimento descrito acima, é possível realizar um ensaio imuno-DNA peixe na CTC (ou outras células equivalentes), enriquecido pelo fio funcionalizado. Antes de configurar este protocolo, a compatibilidade das duas técnicas foi determinado (imuno-fluorescência com peixe) em suportes 2D padrão. Duas diferentes linhas de células CPNPC expressando EpCAM (necessário para aderir ao fio juntamente com anticorpos contra EpCAM) foram selecionadas. Eles têm um status diferente de ALK, que é útil para testar diferentes condições de partida. O primeiro, NCI-H1975, tem genes ALK tipo selvagem (WT), enquanto o segundo, NCI-H3122, caracteriza-se por translocações ALK.
Utilizou-se um sistema de detecção de ruptura-distante do gene ALK para o ensaio de peixe. O sistema consiste de duas sondas, uma (laranja) hybridizing à região proximal dentro ALK em 23 de p 2 e um (verde) hybridizing distal para ALK. Em suportes 2D, imuno-DNA peixe fornecido sinais bem definidos para ambos os anticorpos e sonda (Figura 2). Em particular, ambos células linhas mostrou a localização de membrana EpCAM bem definida. Além disso, os sinais de sonda apareceram claro e nítido: células NCI-H1975 mostraram a sobreposição de sondas laranja e verdes, confirmando o status de sua do gene ALK (Figura 2a, b). Por outro lado, células NCI-H3122 mostraram sinais sobrepostos e único pontos verdes, refletindo uma deleção do gene ALK (Figura 2-c, d). Quando o ensaio imuno-DNA de peixes foi realizado sobre o 3D suportam fio funcionalizado, anticorpo e sonda sinais eram geralmente menos definidos do que com o apoio 2D. EpCAM coloração era visível. ALK sonda sinais eram menos definidas, mas ainda reflete o status ALK esperado (Figura 3). Os resultados mostraram que mancha da imunofluorescência não interferiu com sinais de peixe de DNA. As sondas hibridizadas especificamente com seus alvos. Linhagem de células NCI-H3122 mostrou um status de gene ALK aberrante (Figura 3b), em contraste com NIC-H1975, com um gene ALK tipo selvagem (Figura 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig1.jpg"> 
Figura 1 : Acrescida de fio, arranjo esquemático de sondas de pausa-distante de ALK, esquema de padrões esperados de rearranjo ALK e suporte especial. (um) vermelho caixas destacam as três principais partes do fio: acrescida de ponta, fio-rolha e ponta un-funcionalizada. A ponta funcionalizada é a parte mais delicada do fio e não deve ser tocada durante o manuseio para evitar o desprendimento de células ou danos. (b) as sondas verdes e vermelhas respectivamente ligam a sequências de upstream e downstream de Locus gene ALK (à esquerda). À direita, padrões ilustrativa dos arranjos de ALK são mostrados. Sinal de localização co vermelho e verde sobre as células normais; separados os sinais verdes e vermelhos indicam uma quebra de cromossomas gene ALK (translocação do gene ALK) e sinal de um verde-laranja colocalization (célula aberrante-1). Um sinal vermelho e dois sinais verdes indicam a perda de um sinal vermelho, sugerindo uma translocação cromossômica e uma exclusão (célula aberrante-2). (c) fio titular; caixas vermelhas destacam as áreas onde o cuidado é necessário ao manusear o fio durante a análise de microscopia. O fio pode sofrer uma análise de 360 °, girando o rotator. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig2.jpg"> 
Figura 2 : Ensaio imuno-DNA peixe no suporte 2D (lamela). (a, b) ICN-H1975 células fracamente positivo para EpCAM. EpCAM FITC sinais eram apreciáveis. As sondas de laranja e verdes do ALK pausa-apart sobrepunham, confirmando o status WT do gene ALK em linhagem de células NCIH1975. Células exibindo mais de dois sinais emparelhados estiveram presentes devido à sua aneuploidia. (c, d) Na linha de célula EpCAM-expressando NCIH3122 alta, sinais de imunofluorescência foram brilhantes, que acentuou-se em junções célula-célula. PEIXE análises confirmadas deleções do gene ALK, típica desta linha de celular. Setas vermelhas indicam sondas verdes única (sem sondas laranja correspondentes), refletindo a supressão do gene ALK. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig3.jpg"> 
Figura 3: Peixe imuno-DNA do ensaio usando o fio funcionalizado como suporte 3D. (um) representante imagem de células NCI-H1975 no fio. Embora a forma 3D das células no fio tornam difícil adquirir imagens totalmente em foco, EpCAM sinal é bem visível em todas as células. imagem (b), representante das células NCI-H3122 no fio. Sondas ALK mostraram exclusão de gene (setas vermelhas), como já visto no suporte a 2D. Os sinais visíveis do fundo foram provavelmente devido à presença da camada de polímero. No entanto, isso não afetou significativamente análise de identificação ou fluorescência de célula. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer de</td>
			<td>Composição</td>
			<td>Nota</td>
			<td>Ações</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meio de cultura celular completo</td>
			<td>RPMI 1640 + 2mm glutamina + 5-10% de soro fetal bovino (FBS).</td>
			<td></td>
			<td>RPMI: 4 ° C; Glutamina, FBS:-20 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampão de diluição de anticorpo</td>
			<td>BSA 1%, 0.3% Triton X-100 em 1X PBS</td>
			<td></td>
			<td>RT. vedação com filme de laboratório.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC solução</td>
			<td>3 M de cloreto de sódio, citrato trissódico 300mm, dissolvido em ddH20</td>
			<td>Filtrar a solução e pH = 7,0 + /-0.1 com HCl</td>
			<td>RT. vedação com filme de laboratório.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,4 x solução SSC</td>
			<td>Diluir o estoque 20 x SSC em água destilada H2O</td>
			<td>Filtrar a solução e pH = 7,0 + /-0.1 com HCl</td>
			<td>RT.</td></tr></tbody></table>Vede com filme de laboratório.
		
		<tr>
			<td>2 x SSC + 0,05% Tween 20 solução</td>
			<td>Diluir o estoque 20 x SSC na destilada H2O + 0,05% Tween 20</td>
			<td>Filtrar a solução e pH = 7,0 + /-0.1 com HCl</td>
			<td>RT. vedação com filme de laboratório.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solução 30 nM</td>
			<td>Diluir o estoque 1,43 µM em 1X PBS</td>
			<td></td>
			<td>-20 ° C em escuro estado pronto para usar aliquote</td>
		</tr>
	

Tabela 1: Receitas de soluções.

Apresentamos uma nova abordagem para caracterizar as células do tumor. Nós combinamos a imunofluorescência com DNA fluorescentein situ-hibridação para avaliar células capturadas por um fio médico funcionalizado capaz de na vivo enriquecimento CTC diretamente do sangue do paciente.

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

O objetivo geral deste protocolo é combinar a coloração por imunofluorescência com hibridização in situ fluorescente de DNA em um fio funcionalizado em 3D e identificar sinais de imunofenótipo e FISH no suporte usando um microscópio de fluorescência de campo amplo convencional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da caracterização secretora de células tumorais, como a identificação de alvos relacionados à terapia em células circulantes de câncer de pulmão de células não pequenas. A principal vantagem deste protocolo é permitir a identificação simultânea de parâmetros fenotípicos, como positividade de EpCAM, e alterações citossomáticas, como o status do gene ARC, para detectar CTCs putativas.Embora este método tenha sido projetado exclusivamente para fornecer recursos de CTC de câncer de insulina in situ, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros tipos de câncer, como o câncer de mama. Desenvolvemos este protocolo durante o manuseio do fio para imunofenotipagem direta e detecção de CTC. Para obter mais dados, associamos um protocolo de imunofenotipagem a um protocolo de hibridização in situ de fluorescência de DNA.O manuseio do fio não é fácil, principalmente porque a ponta funcionalizada é frágil. Uma demonstração visual fará com que os leitores reproduzam as etapas. Para iniciar o experimento, ressuspenda todo o conteúdo de um frasco T75 que está a 80% de confluência em um frasco de cinco mililitros usando quatro mililitros de meio completo.Em seguida, remova o fio da embalagem de vidro. Mergulhe a parte dourada funcionalizada do fio no frasco, garantindo que a rolha do fio seja à prova d'água para um frasco de cinco mililitros. Sele o fio com filme de laboratório.Em seguida, incube o fio em um rotador de tubo por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a rotação, enxágue o fio três vezes em uma solução PBS usando três frascos limpos diferentes e espere o fio secar. Depois de secar o fio ao ar por 10 minutos em um exaustor, fixe as células mergulhando o fio em solução de acetona a 100% em um tubo de cinco mililitros por 10 minutos em temperatura ambiente.Certifique-se de que não haja vestígios de acetona na ponta funcionalizada. Seque o fio ao ar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, em um tubo de cinco mililitros, lave o fio duas vezes em PBS de uma dobra.Incube o fio em tampão de diluição de anticorpos. Prepare 150 microlitros de mistura de anticorpos com uma diluição de anticorpo primário monoclonal conjugado com fluorocromo e tampão de diluição de anticorpos especificado na folha de dados. Em seguida, use uma ponta P200 para extrair o fio da rolha do fio e insira suavemente o fio através do orifício maior da ponta.Insira a extremidade não funcionalizada primeiro e puxe lentamente o fio pelo orifício menor até que a parte dourada esteja logo além do orifício maior. Adicione suavemente 150 microlitros da mistura de anticorpos na ponta. Para evitar o risco de formação de bolhas, gire suavemente o fio até que a extremidade funcionalizada esteja completamente mergulhada.Sele o orifício da ponta e enrole o filme de laboratório ao redor do orifício. Incube o fio verticalmente durante a noite no escuro a quatro graus Celsius. No segundo dia, bloqueie a incubação de anticorpos lavando o fio duas vezes em PBS de uma dobra.Reinsira o fio em sua rolha de fio. Três horas antes do protocolo DNA-FISH, ajuste o forno de hibridização para 75 graus Celsius e ajuste o forno de calor seco para 37 graus Celsius. Resfrie a solução SSC de 0,4 vezes a quatro graus Celsius.Lave o fio três vezes em solução SSC de 0,4 vezes gelada. Seque o fio no escuro sob o armário do exaustor por 10 minutos. Após 10 minutos, vórtice e gire a sonda por cinco segundos.Coloque 10 microlitros da sonda em microtubos de vidro e cubra-os com filme de laboratório. Embrulhe os microtubos em papel absorvente seco. Coloque em um tubo de 50 mililitros e gire-os brevemente.Coloque cuidadosamente o fio seco no microtubo e insira a rolha de arame. Em seguida, sele a rolha de arame com cimento de borracha. Coloque o fio em uma câmara úmida escura no forno de hibridização por oito minutos a 75 graus Celsius para obter a desnaturação completa do DNA.Após oito minutos, mova a câmara úmida para um forno de calor seco a 37 graus Celsius durante a noite. Coloque o frasco de coloração deslizante com solução SSC de 0,4 vezes em um banho-maria a 72 graus Celsius. Verifique a temperatura da solução SSC de 0,4 vezes até atingir 72 graus Celsius para mais ou para menos.Em seguida, prepare dois copos de vidro. Um com duas vezes SSC mais solução de 0,05% Tween e o segundo com água destilada. Remova a câmara úmida do forno de calor seco.Use uma pinça para remover cuidadosamente o cimento de borracha da rolha de arame e puxe a extremidade não revestida do arame através da rolha de extremidade, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada. Mergulhe o fio na solução SSC de 0,4 vezes por dois minutos a 72 graus Celsius. Lave o fio em solução dupla SSC mais 0,05% Tween por 30 segundos em temperatura ambiente.Em seguida, lave o fio em água destilada em temperatura ambiente. Seque o fio sob a hotte por 10 minutos no escuro. Incube a ponta funcionalizada do fio com solução DAPI previamente preparada em um frasco de dois mililitros.Enxágue o fio duas vezes em PBS dobrado e seque o fio ao ar. Posicione o fio no suporte do fio e insira cuidadosamente a ponta funcionalizada através do ponto de entrada do suporte especial até que a ponta corresponda ao ponto de acoplamento. Coloque o suporte especial na platina do microscópio.Ajuste o foco do microscópio usando uma lente de 20 vezes. Primeiro, concentre-se grosseiramente no suporte especial e, em seguida, ajuste finamente nas células que parecem brilhantes no canal DAPI. Foque apenas as células centrais da lente e adquira imagens usando uma câmera digital de 12 bits em objetivas de 20x e 40x com filtros apropriados para sondas vermelhas, verdes e azuis.Por fim, prepare o fio para armazenamento de longo prazo, embalando o fio próximo à ponta funcionalizada e insira cuidadosamente o fio em um tubo de vidro. Armazene o fio vertical ou horizontalmente a 20 graus Celsius negativos. A coloração por imunofluorescência não interferiu nos sinais de DNA-FISH.Quando o ensaio imuno-DNA-FISH foi realizado no fio funcionalizado de suporte 3D, a coloração EpCam foi claramente visível. A sonda ALK revelou a deleção do gene. A linhagem celular NCI-H3122 mostrou um status aberrante do gene LAK em contraste com o NCI-H1975 com um ALKG do tipo selvagem.Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em nove horas de trabalho totais ao longo de três dias. Ao tentar este procedimento, é importante não tocar na parte funcionalizada do fio para evitar qualquer dano. Diferentes anticorpos e sondas FISH podem ser usados seguindo este protocolo para responder a perguntas adicionais, como identificar células com outros marcadores fenotípicos e outras alterações citogenéticas, como amplificação do gene NAT ou HAR2.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar CTCs putativas simultaneamente por meio de parâmetros fenotípicos, como positividade de EpCAM, e detectar alterações citogenéticas, como status do gene ARC. Não se esqueça de que trabalhar com acetona e forno pode ser extremamente perigoso. Precauções como manusear acetona no capuz e usar luvas de proteção devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

characterization-tumor-cells-using-medical-wire-for-capturing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve o ensaio de imunofluorescência de células tumorais circulantes (CTC), uma técnica para caracterizar os biomarcadores em células tumorais circulantes em amostras de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este ensaio pode ser usado para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, radiação e possíveis tratamentos de imunoterapia.

Ensaio de imunofluorescência CTC: uma técnica para caracterizar células tumorais circulantes

Este vídeo descreve a técnica de coloração por imunofluorescência de células tumorais circulantes capturadas em um fio médico funcionalizado. O fio funcionalizado permite o isolamento das CTCs in vivo, diretamente da corrente sanguínea do paciente.

Ensaio de imunofluorescência: um método para identificar células tumorais capturadas em um fio médico

O isolamento e caracterização de células tumorais circulantes (CTC) do sangue de pacientes com câncer é um tipo de biópsia líquida não invasiva e associada à recidiva e progressão da doença. Este vídeo descreve a técnica de hibridização in situ de fluorescência de DNA (DNA FISH) em CTCs capturadas em um fio médico, para estudar um gene específico de interesse.

FISH de DNA 3D: uma técnica para localizar um gene específico em um cromossomo

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células epiteliais de câncer que expressam EpCAM a partir de amostras de sangue periférico. A técnica envolve o uso de um fio de grau médico funcionalizado com anticorpos EpCAM para capturar as células-alvo. As células capturadas são então posteriormente extraídas para uma solução tampão.

Isolamento de células-alvo baseado em fio funcionalizado: uma técnica ex vivo para isolar células cancerígenas do sangue periférico enriquecido

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

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As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Aprenda a caracterizar células tumorais circulantes combinando imunofluorescência com hibridização in situ fluorescente de DNA em fio funcionalizado 3D. Este método permite identificar simultaneamente marcadores imunofenotípicos e alterações genéticas em amostras de sangue.

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

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