Name: Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a extrair DNA tumoral de alta qualidade usando citologia de impressão por toque. Este método simplificado acelera a análise genética em amostras clínicas para pesquisa oncológica e sequenciamento de nova geração.

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Agradecemos a todo o pessoal médico e auxiliar do hospital e os pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle White Wolf, PhD, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste relatório. Este estudo foi suportado por um subsídio para o projeto de pesquisa do genoma da província de Yamanashi (YH e modus operandi) e uma subvenção da Fundação médica de The YASUDA (YH).

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<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, apresentamos um método alternativo para obtenção de tumor DNA de amostras clínicas patológicas, usando TIC. Preparação de TIC é muito simples e precisa de menos tempo em comparação com métodos FFPE, sem a exigência de instrumentos especiais10. Todos os procedimentos de preparação da TIC para extração de DNA podem ser concluídos dentro de dois dias (Figura 1). Esse método, portanto, encurta o tempo de retorno para a realização de testes genéticos. Notavel...

Próxima geração tecnologia de sequenciamento forneceu pesquisadores avanços significativos na análise da informação do genoma em variações genéticas, doença mendeliana, predisposição hereditária e câncer 1,2,3 . O Atlas de genoma do câncer (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) têm perseguido a identificação de alterações genéticas em diversos tipos de cancros comuns4. Centenas de genes de condutor essencial do câncer foram identificadas com êxito, e algumas destas moléculas são sendo direcionadas para o desenvolvimento de drogas a1,5,6.
Na prática clínica, espécimes FFPE são comumente usados para diagnóstico patológico e testes moleculares para várias doenças, incluindo câncer. No entanto, durante o processo de fixação com formalina, cross-linking da ADN-proteína ou DNA-DNA ocorre e fragmentação de DNA é induzida. Assim, amostras de DNA FFPE nem sempre são apropriadas para a análise genética por causa da baixa qualidade e quantidade de DNA7,8,9. Além disso, leva vários dias para preparar espécimes FFPE e habilidade técnica é necessária preparar com precisão as seções. Portanto, é desejável desenvolver um método simples e rápido para a obtenção de DNA intacto de alta qualidade.
Citologia é um método alternativo para diagnóstico patológico. Preparação das amostras citológicas é um mais simples, menos cara e mais rápida abordagem comparada com FFPE preparação10. A técnica TIC tem sido realizada em linfonodos sentinela e os tecidos marginais de doentes com cancro da mama para diagnóstico rápido no intra-operatório por alguns anos11,12. No entanto, existem alguns relatórios que têm examinado se o DNA genômico de alta qualidade pode ser extraído amostras TIC e usados para posterior análise genética. Amostras citológicas comumente estão manchadas de Papanicolaou (Pap) ou coloração Giemsa, e informamos anteriormente que a quantidade e a qualidade do DNA extraído de amostras de tique (especialmente amostras manchadas de Giemsa) são superiores para as amostras obtidas da FFPE tecidos13. Em comparação com a coloração de Papanicolau, coloração Giemsa tem uma vantagem em que exigem menos procedimentos de coloração. Na coloração de Papanicolau, depois que as amostras foram fixadas e coradas, eles devem ser montados com montagem médio (por exemplo, Malinol) para distinguir o conteúdo de amostra, tais como as células do tumor, as células normais e células inflamatórias sob um microscópio. Se o espécime de Pap é preparado sem a etapa de montagem, é quase impossível observar as células sob um microscópio, porque a amostra é secada. Em comparação, coloração Giemsa pode ser observado no estado seco, portanto, a etapa de montagem não é necessária para avaliação celular rápida. Por microdissection, coloração Giemsa é mais adequado porque requer espécimes secos.
Neste relatório, apresentamos um método simples e rápido para preparar espécimes TIC com coloração Giemsa e demonstrar que a TIC é uma fonte melhor para DNA, em comparação com espécimes FFPE.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST white20 micro slide de vidro</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrana Lâminas de Vidro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A solução</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B solução</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa solução</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE kit de tecido</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P Kit de Reagentes</td><td>de Detecção Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Ensaio de FFPE DNA QC v2</td><td>Placa</td><td></td> de Reação Óptica Rápida de 96 Poços Thermo Fisher Scientific 4324034 <td></td></tr><tr><td>MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Filme Adesivo Óptico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Ion Library TaqMan Quantitation Kit</td> Painel de Hotspot de Câncer <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq v2</td> Kit de Biblioteca <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 2.0</td><td></td> Adaptadores de Código de Barras Ion Xpress 4480442 <td></td><td>Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Scientific 1-16 Kit</td><td>de Sequenciamento Thermo Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View (base 200)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclador de 96 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Bottle kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&trade; Kit XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Suporte Magnético de 16 posições</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Antiaderente, Tubos Microfuge sem RNase, 1.5 mL (Tubo de baixa ligação)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Placas de Reação Ópticas de 96 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Filme Adesivo Transparente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&trade; Kit XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Etanol(99.5)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (10M)</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>petit-change</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>Mini centrífuga</td></tr><tr><td>petit-incubadora</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Incubadora de ar</td></tr><tr><td>SensiCare Luvas de exame de nitrilo sem pó</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Geladeira MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER S</td><td>FEATHER</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Misturador de vórtice</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>microtubo de 1,5 mL</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

método simples e rápido para obter alta qualidade tumor dna de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

É fundamental para determinar o status mutacional no câncer antes de administração e tratamento de drogas de alvo moleculares específicas para pacientes com câncer. Na prática clínica, fixada em formol parafina (FFPE) os tecidos são amplamente utilizados para testes genéticos. No entanto, FFPE DNA geralmente é danificado e fragmentada durante o processo de fixação com formol. Portanto, FFPE DNA não às vezes é adequada para testes genéticos por causa de baixa qualidade e quantidade de DNA. Aqui nós apresentamos um método de citologia de impressão de toque (TIC) para obter o DNA genômico de células de câncer, que pode ser observado sob um microscópio. Número de células de morfologia e câncer de células pode ser avaliado usando amostras TIC. Além disso, a extração de DNA genômico de amostras TIC pode ser concluída dentro de dois dias. O montante total e qualidade de TIC DNA obtido usando esse método foi maior do que a da FFPE DNA. Este método rápido e simples permite que os pesquisadores para obter DNA de qualidade para testes genéticos (por exemplo, análise de sequenciamento na próxima geração, digital PCR e PCR quantitativo em tempo real) e para encurtar o tempo de retorno para relatar os resultados.

A Figura 1 mostra todo o processo de preparar espécimes TIC para extração de DNA. Notavelmente, o procedimento leva apenas dois dias para obter o DNA genômico de amostras TIC. Nós avaliamos quaisquer efeitos do armazenamento do tumor antes do processamento do slide. Nós achamos que as células tumorais foram anexadas a lâmina de vidro quando as amostras de tecido foram tocadas imediatamente para o slide, e quando os tecidos foram mantidos em salina umedecido-g...

Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

O objetivo geral deste protocolo é obter DNA tumoral de alta qualidade de amostras clínicas. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave na ciência básica e clínica, como pesquisa, diagnóstico e decisões de tratamento do câncer. A principal vantagem dessa técnica é que podemos obter DNA tumoral de forma mais simples e rápida do que com os métodos anteriores.Para iniciar o protocolo, toque a superfície do tumor de um tecido previamente preparado e ressecado em uma lâmina de vidro normal várias vezes com as mãos enluvadas. Confirme visualmente se a área tocada está cobrindo mais de 80% da lâmina de vidro. Pressione levemente a lâmina de vidro normal contra uma lâmina de membrana de naftalato de polietileno ou PEN e esfregue-a suavemente duas a três vezes com as mãos enluvadas.Confirme visualmente se as células são transferidas da lâmina de vidro normal para a lâmina de membrana PEN. Seque ao ar as lâminas de vidro e da membrana PEN por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a secagem, manche a lâmina de vidro normal para exame citológico direto.Mergulhe as lâminas de vidro na solução fixadora por cinco segundos e depois manche com a solução de coloração Giemsa por 15 s

simple-rapid-method-to-obtain-high-quality-tumor-dna-from-clinical

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Este vídeo descreve o ensaio de imunofluorescência de células tumorais circulantes (CTC), uma técnica para caracterizar os biomarcadores em células tumorais circulantes em amostras de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este ensaio pode ser usado para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, radiação e possíveis tratamentos de imunoterapia.

Ensaio de imunofluorescência CTC: uma técnica para caracterizar células tumorais circulantes

Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

Este protocolo descreve a dissociação rápida não enzimática de fragmentos de tecido humano fresco para avaliação qualitativa e quantitativa de células CD45+ (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Além disso, o sobrenadante obtido do homogeneizado de tecido primário pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

Aqui nós descrevemos uma estratégia de remoção otimizada e eficiente para a recolha de bio-partículas presentes em 'toque de DNA' amostras, juntamente com um protocolo de amplificação reforçada envolvendo um de uma etapa 5 jul micro-volume de lise / amplificação STR, para permitir a recuperação de repeat short tandem (STR) perfis do doador (s) bio-partícula.

Reforçada Análise Genética de solteiro biopartículas Humanos recuperado por Simplificado micromanipulação de Forensic Evidence &#39;Toque DNA&#39;

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Os tumores cutâneos são frequentemente descartados após a cirurgia micrográfica de Mohs. Descreve-se aqui um protocolo que permite que a equipe de suporte clínico processe e armazene eficazmente amostras de tumores cutâneos ( por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular e melanoma) para aplicações laboratoriais a jusante sem interferir com as operações clínicas.

Estabelecimento de um Biorepository baseado em Clínica

Apresentamos uma nova abordagem para caracterizar as células do tumor. Nós combinamos a imunofluorescência com DNA fluorescentein situ-hibridação para avaliar células capturadas por um fio médico funcionalizado capaz de na vivo enriquecimento CTC diretamente do sangue do paciente.

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.

Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada

Este protocolo apresenta um método para aumentar o conteúdo percentual de tumores de amostras de tecido embutidas em parafina.

Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

Aprenda a extrair DNA tumoral de alta qualidade usando citologia de impressão por toque. Este método simplificado acelera a análise genética em amostras clínicas para pesquisa oncológica e sequenciamento de nova geração.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

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