Name: Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a usar sensores fluorogênicos geneticamente codificados para avaliar estresse oxidativo toxicológico em células vivas com alta resolução espacial e temporal. Este método supera as limitações das abordagens convencionais.

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Os autores gostaria de agradecer Katelyn Lavrich para obter assistência com delineamento experimental e edições de manuscrito.

1. preparação das células
Nota: Este procedimento descreve a transdução Lentivirus de uma linhagem de células imortalizado (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) para expressar o repórter desejado (roGFP2 ou HyPer). Outras linhas/tipos de células e/ou métodos de transferência de genes, incluindo transfeccao, podem ser utilizados desde que resultam em um nível de expressão do repórter adequada para visualizar um número suficiente de sensor-expressando células por campo de visão (tipicamente 5-10 células). Se usando métodos do transfection, o procedimento deve ser realizado no prato que em última análise, será usado para o método de análise (por exemplo, transfect as células no mesmo prato que será apresentado ao microscópio). Os passos descritos abaixo fornecem detalhes para a preparação de transductions de célula a ser realizado em uma placa de cultura de células de 6-poços. Se este formato não é um tamanho adequado para a aplicação desejada, outras embarcações podem ser substituídas.
<ol><li>Desenvolvem-se células de aproximadamente 40-60% confluência em meios de crescimento normal. Nota: Este estudo utilizou a linha de células epiteliais brônquicas humanas, BEAS-2B, cultivada em meio de crescimento de queratinócitos (KGM).</li>
	<li>Pouco antes de transdução, substitua a mídia de crescimento nas células com 500 µ l de soro livre mídia contendo a quantidade adequada de vírus, conforme calculado pela fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq1.jpg"><ol>
<li>Para transdução de células BEAS-2B, use soro livre queratinócito basal médio (KBM) para substituir a mídia de crescimento KGM durante incubação do viral. Nota: O cálculo acima é para uma única transdução de um poço de células em um formato 6-poços. Se necessário, realizar transductions de vários poços podem ser executados, ajustando a fórmula com uma multiplicação pelo número de poços para ser transformados. Para transductions de Lentivirus, use uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 5 e 20. Para transductions adenovírus, use um MOI entre 100 e 500.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as células com a mistura viral a 37 ° C por 4 h, redistribuindo as partículas virais no prato cada 30-60 min com um breve balanço ou agitando o movimento.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de meio completo crescimento ao prato e incubar a 37 ° C para um adicional 4-16 h.</li>
	<li>Remova toda a mídia e substituir com mídia de crescimento completo fresco.</li>
	<li>Continue a crescer e as células de passagem, expanda conforme necessário. Nota: Células devem começar expressando sensivelmente o sensor dentro de 12-48 h. Se um vetor de Lentivirus foi usado para a transdução, expressao do sensor desejado deve continuar através de passagens.</li>
	<li>Para avaliações baseadas em microscopia, células de semente em vidro com fundo de pratos de microscópio e crescem a confluência desejada (≥70 - 80%) antes da imagem latente. Nota: Densidade de semeadura vai depender do tamanho do prato, taxa de crescimento da célula-linha sendo usado e o tempo da avaliação após a semeadura. Por exemplo, sementes 300.000 BEAS-2B células num prato 35mm para produzir aproximadamente 70-80% confluência após 1 dia de crescimento.</li>
</ol>2. microscopia set-up
Nota: O protocolo descrito abaixo é realizado usando um microscópio confocal equipado com linhas de laser em 404 e 488 nm. Outros meios de fazer avaliações fluorométrica dos sensores descritos neste protocolo em sua excitações/emissão prescrito devem também produzir dados viáveis. Importante, configurações de equipamentos podem variar muito, dependendo do tipo, idade e condição do instrumento a ser usado; assim, quaisquer valores de instrumento mencionados não podem ser específicos para o equipamento utilizado em outros laboratórios.
<ol><li>Realizar todas as análises de imagens usando controles ambientais para manter uma temperatura adequada (por exemplo, 37 ° C), umidade (normalmente &gt; 95% de humidade relativa), e/ou gás concentração (por exemplo, 5% CO2) apropriada para as células em todo o duração do experimento.</li>
	<li>Se usar altos valores de umidade relativa, manter todas as superfícies que possam entrar em contacto com a atmosfera umidificada (ex., o objetivo do microscópio) em ou ligeiramente acima da temperatura em que a umidade é gerada para evitar condensação. Isso pode ser feito com o uso de um aquecedor objetivo e/ou aquecimento de fita e um controle adequado do aquecedor.</li>
	<li>Ativar todos os componentes do microscópio e configurar todos equipamentos necessários para a excitação sequencial em 404 e 488 nm com emissão em 510 nm. Certifique-se de todos os componentes da configuração óptica estão definidos adequadamente para aquisição em tempo real.</li>
	<li>Configurar uma câmara ambiental de palco-top para manter a temperatura constante a 37 ° C, 5% CO2 atmosfera, e &gt; 95% de umidade. Antes de iniciar a aquisição de imagens, equilibrar a câmara ambiental pelo menos 10 min após a configuração inicial de todos os controles ambientais. Nota: Condições ambientais podem ser eliminadas ou ajustadas dependendo do experimento comprimento, tipo de célula e exposição sendo usado.</li>
	<li>Coloque o prato de células (passo 1.7) no palco-topo dentro da câmara ambiental.</li>
	<li>Com a lente objetiva desejada, encontrar o plano focal de células usando a ocular e a luz branca e certifique-se de morfologia normal. Nota: Um 1.4 at 60 X violeta-corrigido, imersos em óleo da lente objetiva é comumente usada, que permite a identificação dos compartimentos intracelulares, enquanto maximiza a resolução óptica do sistema confocal.</li>
	<li>Verifique se a expressão de fluorescência das células no campo de visão. Fazê-lo enquanto visualizando as células sob iluminação de fluorescência de campo amplo com um conjunto de filtro apropriado, como isotiocianato de fluoresceína (FITC). Neste ponto, usando iluminação de campo amplo, enquanto olhando através da ocular é mais conveniente porque é mais fácil mover o prato para selecionar um campo de células para estudar. Em geral, escolha um campo de visão que contém pelo menos 5 a 10 células que expressam o sensor, como indicado por fluorescência verde.<ol>
<li>Alternativamente, realizar esta avaliação usando confocally da excitação do laser no comprimento de onda que é mais compatível com o sensor a ser expressado (488 nm normalmente funciona melhor). Nota: Devido às suas propriedades intrínsecas, fluorescentes, será mais difícil de Visualizar células expressando HyPer do que aquelas roGFP2 expressando usando qualquer FITC ou em 488 nm. No entanto, ainda seria possível ver células desmaiar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que encontra-se um campo de visão desejado, feche a câmara ambiental. Nota: Use o recurso de manutenção de foco, muitas vezes disponível em suportes avançado microscópio, para facilitar a manutenção de um plano focal estável ao longo do estudo.</li>
	<li>Configure parâmetros de aquisição para garantir ótima avaliação do sensor de interesse entre o período de exposição desejada. Abaixo estão as recomendações e abordagens para a imagem latente confocal de respostas do sensor:<ol>
<li>Ajustar a potência do laser para excitação em 488 nm e emissão em 510 nm. Escolha um nível de potência do laser que permite a visualização das células e manter esta constante entre amostras ou pratos de replicar. Nota: Para este estudo, 12% e 1,5% do laser poder foram usados para as linhas de laser 404 e 488 nm, respectivamente.</li>
		<li>Use os controles confocal do software aquisição para garantir que o plano focal selecionado foi otimizado para a intensidade de emissão de fluorescência máxima no centro das células (eixo z) por digitalização em 488 nm enquanto ajusta o plano z. Isto é facilitado pela usando uma configuração de alto ganho, enquanto procurava o z-plano que resulta nas células mais sobre-exposto. Uma vez que o plano focal adequado foi encontrado, retorne o ganho para uma configuração que é o mais ideal para a fluorescência do repórter sendo usado sem oversaturating os pixels que está sendo observados. Nota: As configurações de laser e ganho que são apropriadas para encontrar e observar células durante a experimentação é completamente dependente do sistema confocal sendo utilizado. Em geral, uma vez que as células foram encontradas no campo de visão, recomenda-se que uma quantidade mínima de potência do laser a ser utilizado (normalmente % de ≤20), como a exploração excessiva das células usando luz laser de alta potência, provocar alterações oxidativas detectáveis pelo sensor.</li>
		<li>Use o ganho para afinar a fluorescência de base. Com roGFP2, estabelece a base perto do limite superior (≈ 90% relativa de intensidade) do instrumento sem excesso de saturação, como estas células perderá fluorescência de nm 510 induzida por excitação de nm 488 quando EGSH aumenta. Em contraste, a intensidade de fluorescência com 488 excitação nm deve ser baixa (≈ 10% relativa de intensidade) na linha de base para HyPer expressando as células, como estas células ganhará intensidade de fluorescência 510 nm quando H2O2 é detectado.</li>
		<li>Repita as etapas 2.9.2 e 2.9.3 com excitação em 404 nm e emissão em 510 nm. Configurações de ganho para o comprimento de onda de excitação de nm 404 são opostos aqueles usados com 488 excitação nm para cada sensor (i.e., fluorescência de base baixa (≈ 10% relativa de intensidade) em 404 nm para roGFP2, fluorescência de base alta (≈ 90% relativa de intensidade) para o H2 Sensor de2 O). Nota: em geral, a fluorescência (510 de emissão) em 404 excitação nm será consideravelmente inferior que obtenível com 488 excitação nm nas células expressar tanto roGFP2 e HyPer, como o pico nm 404 é uma relativamente menor excitação máxima para esses dois sensores.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. aquisição de dados
<ol><li>Configurar o software de aquisição para excitar sequencialmente os dois comprimentos de onda de excitação (primeiro 488 nm e, em seguida, 404 nm) e recolher as emissões para ambos em 510 nm em um intervalo de tempo predeterminado em todo o comprimento desejado do experimento (por exemplo, captura imagens cada 60 s para 60 min).<ol>
<li>Em alternativa, adquira imagens manualmente antes e após as exposições se a altura aproximada das mudanças EGSH ou H2O2 é conhecida para o xenobiótico sendo testado. No entanto, isso pode levar a perda de resolução temporal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a avaliação em tempo real de parâmetros experimentais, escolher pelo menos 5-10 sensor-expressando pilhas no campo e estabelecê-los como regiões de interesse ("ROIs") para monitorar as alterações de fluorescência durante o experimento. Nota: Este passo é opcional e pode ser realizado após o experimento se observação direta em tempo real é indesejável ou evitar a limitações de software monitoramento contínuo. Dependendo da população de células, a seleção do sensor expressando células como ROIs pode representar uma gama de níveis de expressão através de células.<ol>
<li>Para estes estudos, adicione o ambiental tóxica 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) ou peróxido de hidrogênio (H2O2) após um período de 5 min de base.</li>
		<li>Prepare todos os reagentes para uso posterior no presente protocolo.  Dissolver 9,10-PQ em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de 15 mM e em basocelular meios para produzir uma solução de trabalho de 250 µM.  Além disso, prepare uma solução de peróxido de hidrogênio na água que irá produzir uma concentração final de 1mM a injeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que foram definidos os parâmetros experimentais, começa a aquisição de curso do tempo. Estabelece um período inicial pelo menos 5 min (ou 5 pontos de dados) antes de iniciar as exposições de xenobióticas.</li>
	<li>Expor as células para a toxicidade sendo investigado usando abordagens convencionais para em vitro de dosagem. Preparar compostos solúveis em água ou outro solvente apropriado e injetar diretamente para a mídia.<ol>
<li>Se solventes orgânicos (por exemplo, dimetil sulfóxido ou etanol) forem necessários, mantenha a concentração final de solvente em ou abaixo de 0,1%. Verifique se que o solvente não produz um efeito sobre EGSH ou H2O2 produção com um controle de veículo em um prato separado das células.</li>
		<li>Para compostos com baixa solubilidade, adicione uma etapa de mistura usando uma micropipeta no protocolo após a injeção é feita. Bomba de exposições gasosas diretamente na câmara ambiental, usando a mistura de gás portador apropriado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitorar alterações em fluorescência durante o período de exposição. Efectuar injecções subsequentes conforme necessário. Tome muito cuidado para não deslocar o prato durante injeções, para que as mesmas células são seguidas ao longo do tempo todo enquanto fotografada no mesmo plano focal.</li>
	<li>No final do experimento, expor as células aos controles apropriados. Para ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado, adicione concentrações específicas de compostos conhecidos para oxidar e reduzir estes sensores em uma aguçado demonstração de sua capacidade de resposta do ratiometric. H2O2 e ditiotreitol (DTT) servem como controles apropriados para oxidar e reduzir ambos os sensores. Normalmente, uma concentração final de 100-1.000 µM H2O2, seguido de 1-5mm ditiotreitol (DTT), permite que o usuário totalmente oxidar e reduzir estes sensores.<ol>
<li>Para estes estudos, use 1 mM H2O2 seguido de 5mm TDT para determinar a resposta máxima do sensor.</li>
		<li>Espere pelo menos 5 min para permitir que o sensor responder e em seguida, injetar um agente redutor, como TDT, para reduzir o senor e retorná-lo a um nível de fluorescência em ou perto de sua linha de base estabelecida. Nota: O uso de controles nesta etapa é crucial para a normalização e deve ser realizado no final de cada experimento para determinar a faixa dinâmica do sensor em cada célula. Para roGFP2, aldrithiol também pode ser adicionado ao final do experimento. Aldrithiol ignora o relé de redox roGFP2 para oxidar o sensor diretamente. Isto é útil para avaliar a função de sensor após a exposição de xenobióticas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Se não já estabelecido, desenhe ROIs ao redor das células para ser analisado. Use o software apropriado para medir a intensidade de fluorescência de cada ROI para cada comprimento de onda ao longo do tempo. Certifique-se que as células não se mexeu, ou a placa não mudar durante a execução. Nota: O estabelecimento de ROIs é mais facilmente realizado desenhando-se uma região fechada que segue o padrão de expressão fluorescente de cada célula. Para ajudar ainda mais com este processo, uma imagem de luz (ou brightfield) transmitida das células dentro do campo de visão estabelecida pode ser sobreposta na imagem fluorescente nos esforços para definir os limites da célula. No entanto, o uso de uma imagem de luz transmitida requer que o usuário capturar um canal adicional (conjunto de imagens) ao longo do experimento. Alternativamente, alguns fabricantes incorporam algoritmos em seu software de imagens que usam parâmetros específicos tais como limiares de intensidade para estabelecer um método mais quantitativo, menos subjetivo, ROIs.</li>
	<li>Exporte os dados para o software de análise desejada (por exemplo, planilha eletrônica).</li>
	<li>Calcule a resposta do sensor de ratiometric para cada ROI em cada ponto de tempo, usando as fórmulas: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq3.jpg">
</li>
	<li>Para cada ponto de tempo, média os valores calculados ratiometric de ROIs todos.</li>
	<li>Calcule o valor da linha de base, que será usado para normalizar os dados, calculando os valores ratiometric calculado anteriormente (etapa 4.4) recolhidos antes da adição do xenobiótico (por exemplo, os primeiros cinco vezes pontos).</li>
	<li>Normalize os valores ratiometric da etapa 4.4 dividindo-se cada valor pelo valor de base calculado em 4,5. Rácios de normalizado centralizam-se em torno de um valor de 1 na linha de base, enquanto aumentos EGSH ou H2O2 injeções seguintes fará com que a relação aumentar. Avaliações de xenobiótico que induzem alterações oxidativas tendem a produzir valores em um intervalo de 3 - 6 vezes o valor da linha de base.</li>
	<li>Para auxiliar na comparação de respostas dentro e através de experimentos, expressa os dados normalizados como uma porcentagem de resposta máxima do sensor, definindo a resposta para o oxidante de controle (por exemplo, 1 mM H2O2) como 100%. Nota: Se expressar dados como uma porcentagem de resposta máxima do sensor, é fundamental para garantir que a mesma concentração de oxidante o controle é usada consistentemente através de experimentos. Todos os dados derivados de análise de imagens de células ao vivo é passível de análise estatística por pares e armazenando convencional para ser escolhida a critério do investigador.</li>
</ol>

A pesquisa descrita neste artigo foi revista pelo nacional de saúde e laboratório de pesquisa de efeitos ambientais, agência de proteção ambiental dos Estados Unidos e aprovada para publicação. O conteúdo deste artigo não deve ser interpretado para representar a política da Agência, nem faz menção de nomes comerciais ou produtos comerciais constituem endosso ou recomendação para o uso.

O uso de roGFP2 e HyPer na detecção de alterações em intracelular EGSH e H2O2, respectivamente, foi bem descrito em anteriores estudos fisiológicos e toxicológicos 25,35,36 ,39,40,41,42,43. O protocolo descrito aqui relata ...

O termo "estresse oxidativo" é frequentemente citado como um mecanismo em toxicologia, mas raramente é este termo descrito especificamente. Estresse oxidativo pode se referir a vários processos intracelulares, incluindo a geração de espécies reativas de oxigênio, danos causados pelos radicais livres, a oxidação de moléculas antioxidantes, e mesmo a ativação de sinalização específicas cascatas. Uma ampla gama de contaminantes ambientais1,2 e3,de agentes farmacêuticos4 foram documentadas para induzir o estresse oxidativo por qualquer ação direta do composto xenobióticos em si5 ,6 ou secundariamente por produção de espécies oxidantes como parte de uma resposta celular7,8,9,10. Portanto, é de grande interesse na toxicologia com precisão observar e caracterizar os processos oxidativos, levando a resultados adversos. Métodos convencionais de medição de estresse oxidativo envolvem identificação de biomoléculas oxidada11,12,13,14,15 ou antioxidantes16 ,17,18,19,20, ou medição direta de espécies reactivas se21,22,23, 24. No entanto, esses métodos normalmente exigem rompimento celular, que muitas vezes consome a amostra, elimina a resolução espacial e potencialmente introduz artefatos25. O desenvolvimento de métodos mais sensíveis e específicos para a detecção de espécies oxidantes e marcadores de estresse oxidativo é amplamente aplicável para a investigação dos efeitos adversos da exposição xenobióticos.
Microscopia de viver-pilha usando uma nova geração de sensores fluorogenic geneticamente codificado tem emergido como uma poderosa ferramenta para monitorizar o estado redox intracelular de células vivas. Estes sensores são normalmente expressos usando um vetor sob o controle de um promotor viral é introduzido através de metodologias de transfecção ou transdução. Eficiência elevada expressão não é necessária, pois células expressando o sensor fluorescente podem ser facilmente identificadas visualmente. Para as avaliações toxicológicas, celulas que expressam estes sensores podem ser observadas usando microscopia de fluorescência, como eles são expostos a compostos xenobióticos em tempo real. Este projeto experimental permite medições repetidas na mesma cela, permitindo que a linha de base estabelecida de cada célula atuar como seu próprio controle. A alta resolução temporal, conferida pela imagem latente da viver-pilha é well-suited para a detecção de eventos oxidativos, particularmente aqueles que são modestos em magnitude ou transiente na natureza. Além de ser sensível e específico para suas moléculas-alvo, a fluorescência de alguns destes sensores pode ser excitada usando dois comprimentos de onda da luz. Este fenômeno permite a emissão fluorescente ser expressa como uma razão, que permite o discernimento do sinal alterações associadas com respostas de autêntica sensor de aqueles causados por artefatos tais como variações na expressão de sensor, espessura de célula, lâmpada intensidade, fotobranqueamento e sensibilidade do detector de fluorescência26. Outra vantagem do uso de sensores fluorogenic é que eles podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos, criando um nível de resolução espacial que é inigualável por métodos convencionais25,26,27.
Uma grande família de sensores geneticamente codificado com base na proteína verde fluorescente (GFP) foram desenvolvidos e caracterizados para relatório sobre uma ampla variedade de marcadores fisiológicos, incluindo pH, temperatura, concentrações de cálcio e a relação ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Estão incluídos entre esses sensores do potencial redox glutationa (EGSH) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Enquanto estes sensores foram desenvolvidos para aplicações em biologia redox e fisiologia, eles também foram adaptados para estudar o estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Especificamente, o protocolo descrito aqui descreve o uso da roGFP2 de sensor EGSH e o sensor de2 H2O HyPer.
roGFP2 informa o potencial redox intracelular reduzida e oxidada glutationa (GSH/GSSG) através de um relé de redox envolvendo glutationa peroxidase (GPx), Glutarredoxina (Grx) e glutationa redutase (GR) (Figura 1)25, 32 , 33. glutationa é a molécula antioxidante celular predominante e está presente principalmente em sua forma reduzida (GSH) em concentrações milimolar no citosol25,34. Enquanto EGSH não tem sido associada a qualquer resultado funcional, é reconhecido como um importante indicador de status oxidativo intracelular34. Um relativamente pequeno aumento na concentração de GSSG resulta em um aumento EGSH é detectável por roGFP2. Igualmente importante, monitoramento de EGSH usar roGFP2 durante exposições xenobióticas pode potencialmente revelar muito sobre o mecanismo de ação em vários pontos do relé de redox e caminhos associados, tais como o fosfato de pentose derivação (Figura 1 )35. O segundo sensor discutido aqui, HyPer, é uma intracelular sonda H2O2 derivada a inserção de proteína fluorescente amarela (YFP) no domínio regulamentar de bacteriana H2O2-transcrição sensível fator OxyR136. Embora anteriormente foi considerado um prejudicial oxigênio reativo intermediário, H2O2 está cada vez mais sendo reconhecido como uma importante molécula de sinalização intracelular sob condições fisiológicas37, 38, sugerindo que funções não reconhecidas para H2O2 existir em toxicologia também. Por exemplo, excesso H2O2 induzido por uma exposição de xenobióticas pode ser um precursor de desregulagem na sinalização celular, ou uma mudança na Bioenergética.
Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado foram expressas em várias linhagens celulares estabelecidas, incluindo a linhagem de células de carcinoma epidermoide humana A431 e a linha de células epiteliais brônquicas humanas BEAS-2B, para observar alterações no EGSH e H2 O2 em resposta a uma variedade de riscos toxicológicos. Estes incluem gases poluentes (ozônio35), componentes solúveis de matéria particulada (1,2 naftoquinona39,40 e zinco41) e nanopartículas de níquel (dados não publicados). Estes estudos representam apenas um pequeno subconjunto das possíveis aplicações destes dois sensores. Teoricamente, qualquer tipo de célula que é capaz de receber e expressar o DNA destes sensores através de técnicas convencionais de biologia molecular pode ser utilizado para avaliar os efeitos dos xenobióticos, suspeitados-se de alterar o estado oxidativo celular. Até à data, um ou mais destes sensores foi expressa em vários procariotas e eucariotas, incluindo vários mamíferos, planta, bactérias e levedura célula tipos25,26,36,42. A leitura de ambos EGSH e H2O2 sensores é uma mudança na intensidade da fluorescência emitida em 510 nm com excitação com luz de 404 e 488 nm. Este método é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica, incluindo vários tipos de microscopia (confocal e campo amplo) e leitores de placa. O método apresentado aqui permite a observação sensível e específica de intracelular EGSH e H2O2 em vitro sistemas toxicológicos.

<table><tbody><tr><td>RoGFP2 Plasmídeo</td><td>Universidade de Oregon</td><td>N/A</td><td>Generoso presente de S.J. Remington</td></tr><tr><td>HyPer Plasmídeo</td><td>Evrogen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>9,10-Fenantrenequinona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156507</td><td></td></tr><tr><td>Preto Pratos de Parede com Fundo de Vidro</td><td>Ted Pella</td><td>14029-20</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B linha celular</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>192151</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Office Suite</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Software de imagem AR</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1si Sistema de imagem confocal</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Enquanto o estresse oxidativo é um mecanismo comumente citado toxicológico, métodos convencionais para estudá-lo sofrem uma série de deficiências, incluindo a destruição da amostra, introdução de artefatos potenciais e uma falta de especificidade para a reativa espécie em questão. Assim, há uma necessidade atual no campo da toxicologia de métodos não-destrutivos, sensíveis e específicos que pode ser usado para observar e quantificar as perturbações redox intracelular, mais comumente referidas como estresse oxidativo. Aqui, apresentamos um método para o uso de dois sensores fluorogenic geneticamente codificado, roGFP2 e HyPer, para ser usado em estudos de imagiologia viver-pilha para observar respostas oxidativas induzida por xenobiótico. roGFP2 se equilibra com potencial de redox da glutationa (EGSH), enquanto HyPer detecta diretamente o peróxido de hidrogênio (H2O2). Ambos os sensores podem ser expressa em vários tipos de célula através de transfeccao ou transdução e podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos. O mais importante, viver-pilha microscopia usando estes sensores oferece alta resolução espacial e temporal que não é possível usar os métodos convencionais. Mudanças na intensidade da fluorescência monitorados em 510 nm serve como a leitura para ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado quando sequencialmente animado por 404 nm e 488 nm de luz. Esta propriedade faz com que ambos os sensores ratiometric, eliminando artefatos comuns da microscopia e corrigir as diferenças na expressão de sensor entre as células. Esta metodologia pode ser aplicada através de uma variedade de plataformas fluorométrica capazes de emissões emocionantes e coleta em comprimentos de onda prescritos, tornando-o adequado para uso com sistemas de imagem confocal, microscopia de campo amplo convencional e placa leitores. Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado utilizaram-se em uma variedade de tipos de células e estudos toxicológicos para monitorar celular EGSH e a H2O2 geração em tempo real. Descritas aqui, é um método padronizado que é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica de aplicação do roGFP2 e HyPer nas avaliações toxicológicas de viver-pilha de estresse oxidativo e tipos de células.

O uso de roGFP2 e HyPer em detectar alterações EGSH e intracelular H2O2 tem sido bem descrito anteriormente25,36,42,43 e é demonstrado aqui. Imagens confocal de células expressando roGFP2 na linha de base e seguir adição de H2O2 e TDT são mostradas na Figura 2. Dados de imagens ...

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

O objetivo geral desta metodologia é estabelecer o uso de sensores redox codificados geneticamente para a avaliação específica de perturbações induzidas por tóxicos na homeostase redox. Ao superar as limitações significativas das abordagens convencionais usadas com estresse oxidativo, este método ajudará a responder a questões-chave relativas ao estresse oxidativo toxicológico. A principal vantagem desta técnica é que ela combina um alto grau de especificidade e sensibilidade com resolução espaço-temporal incomparável para investigar o estresse oxidativo toxicológico em células vivas.Realize todas as análises de imagem usando um microscópio confocal equipado com linhas de laser em 404 e 488 nanômetros e controles ambientais para manter uma temperatura, umidade e/ou concentração de gás apropriadas para as células durante toda a duração do experimento. Se estiver usando altos valores de umidade relativa, use um aquecedor objetivo e/ou fita de aquecimento para manter quaisquer superfícies que possam entrar em contato com a atmosfera umidificada na temperatura ou ligeiramente acima da temperatura na qual a umidade é gerada para evitar condensação. Ligue todos os componentes do microscópio e configure todos os equipamentos necessários para excitação sequencial em 488 e 404 nanômetros com emissão em 510 nanômetros.Certifique-se de que todos os componentes da configuração óptica estejam configurados adequadamente para aquisição em tempo real. Configure uma câmara ambiental no topo do palco para manter a temperatura constante a 37 graus Celsius, atmosfera de 5% de CO2 e umidade superior a 95%. Antes de iniciar a aquisição da imagem, equilibre a câmara ambiental por pelo menos 10 minutos após a configuração inicial de todos os controles ambientais.Coloque o prato de células no topo do palco dentro da câmara ambiental. Com a lente objetiva desejada, encontre o plano focal das células usando a ocular e a luz branca e garanta a morfologia normal. Uma lente objetiva imersa em óleo corrigida violeta de 1,4 abertura numérica de 60 X é comumente usada, o que permite a identificação de compartimentos intracelulares enquanto maximiza a resolução óptica do sistema confocal.Verifique a expressão de fluorescência das células no campo de visão enquanto visualiza as células sob iluminação de fluorescência de campo amplo com um conjunto de filtros apropriado, como isotioanato de fluoresciane ou FITC. Neste ponto, usar a iluminação de campo amplo enquanto olha pela ocular é mais conveniente porque é mais fácil mover o prato para selecionar um campo de células para estudar. Assim que um campo de visão desejado for encontrado, feche a câmara ambiental.Use o recurso de manutenção de foco para facilitar a manutenção de um plano focal estável durante todo o estudo. Em seguida, configure os parâmetros de aquisição para garantir a avaliação ideal do sensor de interesse durante o período de exposição desejado. Para fazer isso, ajuste a potência do laser para excitação em 488 nanômetros e emissão em 510 nanômetros.Escolha um nível de potência do laser que permita a visualização das células e mantenha essa constante entre amostras ou pratos replicados. Use os controles confocais do software de aquisição para garantir que o plano focal selecionado tenha sido otimizado para intensidade máxima de emissão de florescência no centro das células, digitalizando a 488 nanômetros enquanto ajusta o plano Z. Use uma configuração de alto ganho enquanto ajusta para o plano Z com as células mais superexpostas.Uma vez que o plano focal apropriado tenha sido encontrado, retorne o ganho para uma configuração que seja mais ideal para a fluorescência do repórter que está sendo usado sem saturar demais os pixels observados. Em seguida, use o ganho para ajustar a fluorescência da linha de base. Com roGFP2, estabeleça a linha de base perto do limite superior do instrumento sem saturação excessiva, pois essas células perderão fluorescência de 510 nanômetros induzida por excitação de 488 nanômetros quando o potencial redox de glutationa aumentar.Repita essas etapas com excitação a 404 nanômetros e emissão a 510 nanômetros. As configurações de ganho para o comprimento de onda de excitação de 404 nanômetros são opostas às usadas com excitação de 488 nanômetros para cada sensor. Em geral, a fluorescência da excitação de 404 nanômetros será consideravelmente menor do que a obtida com a excitação de 488 nanômetros em células que expressam roGFP2, já que uma espiada de 404 nanômetros é um máximo de excitação relativamente menor para este sensor.Configure o software de aquisição para excitar sequencialmente os dois comprimentos de onda de excitação e coletar emissões para ambos em 510 nanômetros e em um intervalo de tempo predeterminado ao longo da duração desejada do experimento. Para avaliação em tempo real dos parâmetros experimentais, escolha pelo menos cinco a 10 células que expressam sensores no campo e estabeleça-as como regiões de interesse para monitorar suas mudanças de fluorescência durante o experimento. Em seguida, dissolver o tóxico ambiental, 9,10-PQ em dimetilsulfóxido até uma concentração de 15 milimolares.Diluir o tóxico dissolvido em meio de células basais para uma solução de trabalho de 250 micromolares para uma concentração final de 25 micromolares. Além disso, prepare uma solução de trabalho de peróxido de hidrogênio para uso posterior neste protocolo. Uma vez definidos os parâmetros experimentais, inicie a aquisição do curso de tempo.Estabelecer um período de referência de, pelo menos, cinco minutos antes de iniciar as exposições aos xenobióticos. Exponha as células ao tóxico que está sendo investigado usando abordagens convencionais para dosagem in vitro. Monitore as mudanças na fluorescência durante o período de exposição.Realize injeções subsequentes conforme necessário. Tome muito cuidado para não mudar o prato durante as injeções, para que as mesmas células sejam seguidas durante todo o curso de tempo enquanto fotografadas no mesmo plano focal. No final do experimento, exponha as células aos controles apropriados para oxidar e reduzir totalmente o roGFP2.A adição de simuli de controle valida a capacidade de resposta do sensor no final da exposição e confirma que as respostas observadas não são o resultado direto de danos ao forport. Portanto, é especialmente importante na avaliação inicial de uma toxina. Para esses estudos, use um peróxido de hidrogênio milimolar para determinar a resposta máxima do sensor.Aguarde pelo menos cinco minutos para permitir que o sensor responda e, em seguida, injete um agente redutor como DTT para reduzir o sensor e retorná-lo a um nível de fluorescência em ou próximo à sua linha de base estabelecida. Por fim, execute a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto. Aqui são mostrados resultados representativos que ilustram uma resposta à dose estabelecida gerada usando a linha de células epiteliais brônquicas Bees 2B expressando roGFP2.Cursor mostrado para expor cinco doses micromolares, 25 micromolares ou 100 micromolares de peróxido de hidrogênio. A exposição das células 2B das abelhas a um tóxico ambiental não testado anteriormente, 9, 10-PQ induz um aumento gradual, mas potente, no potencial redox de glutationa intracelular, conforme avaliado por roGFP2. Aqui, cada linha descreve a proporção bruta de roGFP2 de células individuais no prato.Embora o composto de teste produza uma resposta máxima comparável a um peróxido de hidrogênio milimolar, esse ciclador redox conhecido causou uma mudança no sensor que foi totalmente reduzida com a adição de cinco DTT milimolar, sugerindo que o sensor permanece funcional após a exposição a esse composto orgânico redox-ativo. Essa abordagem ajudará os toxicologistas a investigar os principais eventos mecanicistas no estresse oxidativo induzido por tóxicos, abrindo caminho para estudos mais focados no campo emergente da toxicologia redox em um amplo espectro de tóxicos e tipos de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar sensores geneticamente codificados e microscopia de células vivas para monitorar marcadores essenciais de estresse oxidativo toxicológico com alta sensibilidade e especificidade em resolução espaço-temporal incomparável.

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Research

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