Visualização dinâmica de lignificação em plantas com química clique: dupla rotulagem é uma bênção!

O objetivo geral desta metodologia de rotulagem dupla é observar zonas de ligniificação ativa dos tecidos vegetais. Neste fluxo de trabalho, a estratégia do repórter químico é aplicada usando dois repórteres químicos distintos em uma combinação sequencial de reações químicas de clique bio-ortogonais. Este método pode ajudar a decifrar questões-chave no campo da biologia vegetal, como determinar quais fatores regulam a formação espacial ou temporal de lignina dentro das plantas e paredes.

A principal vantagem desta técnica é que ela visa exclusivamente a lignina que é produzida durante a incorporação metabólica. Ele o diferencia de qualquer lignina preexistente na amostra. Embora tenhamos desenvolvido originalmente esse método para estudar sinalizadores de lignificação, ele poderia ser usado com outras espécies, como arabidopsis, choupo ou qualquer outra planta que produza lignina.

Para apresentar essa técnica, temos Clemence Simon, que é uma estudante de doutorado que trabalha na interface entre química e biologia e que está usando essa técnica para estudar a dinâmica da lignificação. Primeiro, prepare uma solução repórter química de 300 microlitros contendo dez micromuller de repórter G marcado com alcine. E dez micromuller de repórter H marcado com azida e meio líquido estéril 1/2 MS.

Vortex a solução e transfira-a para um poço de uma placa de 48 poços com uma pipeta de transferência. Preparar uma solução de controlo negativo de 300 microlitros contendo dez micromuller de G e dez micromuller de H e meio líquido estéril de 1/2 MS. Vortex a solução e transfira-a para um segundo poço da mesma placa de 48 poços.

Usando uma lâmina de barbear limpa, corte o caule de uma planta de linho de dois meses a dez centímetros acima do nível do solo. Prepare diligentemente 50 seções transversais transversais à mão livre da haste usando a lâmina de barbear e coloque-as imediatamente em um meio de 1/2 MS. Em seguida, selecione seções transversais inteiras intactas e distribua aleatoriamente dez delas no poço preenchido com a solução repórter química, tomando cuidado para não danificar o tecido.

As seções transversais devem ser cortadas com firmeza e limpeza e a seção transversal deve ser reta. Você precisa de uma mão firme e uma lâmina de barbear afiada para manter os tecidos intactos. É aconselhável praticar com antecedência.

Depois de distribuir dez secções transversais intactas na solução de controlo negativo, incubar a placa em luz contínua numa câmara de crescimento a 20 graus Celsius durante 20 horas. No dia seguinte, remova a solução monolignal em cada poço com uma micropipeta. Adicione 500 microlitros de meio 1/2 MS a cada poço e mexa delicadamente por dez minutos.

Em seguida, remova a solução de enxágue com uma micropipeta. Prepare um mililitro de uma solução de cicloadição azida-alcina promovida por cepa. Contendo cinco micromuller de corante fluorescente marcado com cicloocteno e meio líquido estéril 1/2 MS.

Em seguida, vórtice a solução. Após as etapas finais de lavagem do protocolo de incorporação metabólica, remova o meio 1/2 MS e adicione 300 microlitros da solução SPAAC a cada poço com uma micropipeta. Proteja a placa de 48 poços da luz, colocando-a em uma caixa.

Em seguida, mexa suavemente a placa em um agitador mecânico por uma hora no escuro em temperatura ambiente. Em seguida, lave cada poço quatro vezes com meio 1/2 MS conforme descrito anteriormente, mantendo a placa no escuro. Prepare um mililitro de solução de cicloadição de azida alcina catalisada por cobre contendo ascorbato de sódio, sulfato de cobre e corante fluorescente marcado com azida e meio líquido estéril 1/2 MS.

Em seguida, vórtice a solução. Após remover o meio 1/2 MS, coloque a placa em uma caixa e adicione 300 microlitros da solução de CuAAC a cada poço com uma micropipeta. Mexa suavemente a placa em um agitador mecânico por uma hora no escuro em temperatura ambiente.

Remova a placa do agitador mecânico e remova a solução de CuAAC de cada poço com uma micropipeta. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio 1/2 MS e mexa a placa no agitador mecânico por dez minutos no escuro. Depois de lavar mais duas vezes com meio 1/2 MS, adicione 500 microlitros de uma solução de metanol 7:3 e água a cada poço.

Mexa a placa no agitador mecânico por uma hora no escuro. Em seguida, remova a solução dos poços. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio 1/2 MS a cada poço e mexa no escuro por dez minutos.

Depois de repetir esta lavagem quatro vezes, mantenha as seções transversais armazenadas em meio 1/2 MS, protegido da luz. Coloque cinco gotas de meio de montagem em uma lâmina de microscópio de vidro. Em seguida, deposite cuidadosamente cada seção transversal marcada com repórter químico na lâmina.

Aplique o esmalte nos dois lados opostos do slide. Cubra a lâmina com uma lamínula, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Em seguida, remova o excesso de meio de montagem usando uma toalha de papel.

Em seguida, sele a amostra com esmalte nos quatro lados. Depois que o esmalte estiver seco, armazene as lâminas a quatro graus Celsius no escuro até a observação em um microscópio confocal. As seções de plantas tendem a ficar crocantes quando secam.

Certifique-se de mantê-los sempre em solução e selar as lamínulas com esmalte por todos os lados. Aumenta a vida útil das corrediças montadas. Coloque a lâmina de amostra no microscópio stage sob a lente objetiva.

Observe e gire a amostra para identificar a região desejada do tecido vegetal. Em seguida, selecione o plano mais fluorescente no eixo Z. Ajuste o ganho, o deslocamento e a potência do laser para obter a distribuição ideal do sinal ao longo de toda a faixa de nível de cinza para cada canal.

Por fim, adquira imagens confocais de alta qualidade. O BLISS fornece três mapas de localização de cores da lignina nas paredes celulares das plantas, visa exclusivamente a lignina produzida in novo durante a incorporação metabólica e a diferencia da lignina preexistente na amostra. Ele destaca os locais de lignificação ativos em diferentes tecidos de um órgão, em diferentes tipos de células de um tecido ou em diferentes camadas de parede ou subestruturas de uma célula.

Os perfis de incorporação do repórter G marcado com alcina e H marcado com azida do câmbio para a medula dentro do xilema secundário do linho indicam que a lignificação máxima é rapidamente alcançada em traqueídeos de fibra durante o desenvolvimento, enquanto as células raciais continuam a incorporar lignina em estágios muito posteriores de sua vida. A variação da proporção de repórteres químicos demonstra que a composição da lignina nos tecidos secundários do xilema é diretamente dependente da disponibilidade monolignal dentro das paredes celulares. Em vez de na especificidade da peroxidase ou lacase durante a polimerização da lignina.

A incorporação de repórter químico é limitada aos cantos celulares e à parede celular primária da lamela média de algumas, mas não de todas as fibras liberianas. Nas raízes do linho, os repórteres químicos são incorporados nas paredes das células endodérmicas onde a banda caspar está ausente. Para melhor visualização da arquitetura do tecido, reconstruções de pilha Z 3D também podem ser geradas.

Seguindo esse visual, o processamento de dados abrangente também pode ser realizado. Tomadas todas as precauções, é possível obter resultados constantes por comparação relativa, lendo uma amostra entre diferentes amostras. Isso pode ser feito além da localização da liderança ativa de várias áreas.

Este método é uma ferramenta maravilhosa para biólogos de plantas como eu, que estudam a parede celular. Uma vez dominado, pode ser feito em poucas horas. É muito sensível e pode ser aplicado a toda uma gama de diferentes sistemas de modelos experimentais in vitro in vivo.

A aplicação da estratégia do repórter químico à lignina abre caminho para o biólogo químico explorar a dinâmica da lignificação e descobrir o que controla esse processo de polimerização, que em muitos aspectos ainda constitui um território desconhecido.