Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

O objetivo geral desta microscopia de vídeo intravital de epifluorescência, ou protocolo IVM de vasos sanguíneos, é visualizar e quantificar o rolamento e a adesão de leucócitos em artérias corroídas na hipertensão induzida por angiotensina II em camundongos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na patologia da disfunção vascular e hipertensão arterial, como o mecanismo de interação entre os leucócitos e, em particular, os lisossomos e células positivas, e o trabalho do vaso. A principal vantagem desta técnica é que podemos ver as interações in vivo entre as células sanguíneas circulantes e a compreensão vascular.

Prepare um camundongo macho para a cirurgia após sete dias de tratamento com angiotensina dois com uma bomba osmática de acordo com o texto protol. Aplique pomada oftálmica sobre os olhos para protegê-los durante o procedimento. Coloque o animal anestesiado em decúbito dorsal em uma placa cirúrgica de 39 graus Celsius e insira uma sonda retal para manter a temperatura.

Use um cotonete para espalhar e esfregar o creme depilatório no pescoço até que o cabelo comece a cair. Em seguida, após mais 2 minutos, use uma espátula para remover os pelos e o creme. Em seguida, desinfete a pele usando um anti-séptico alcoólico.

Em seguida, sob um estereomicroscópio, faça uma incisão longitudinal de 1 a 1,5 cm na pele do pescoço, a 1 cm da traqueia. Em seguida, faça 2 incisões perpendiculares em cada extremidade da primeira incisão. Remova cuidadosamente o tecido logo abaixo da pele e remova o pedaço de pele que cobre a veia jugular esquerda e a traqueia.

Em seguida, use duas pinças curvas para isolar cuidadosamente as glândulas corroídas sublinguais e submaxilares da zona de interesse. Tomando cuidado para não cortar ou danificar as glândulas, posicione-as para permitir o melhor acesso à veia jugular e aos corrideds. Em seguida, para isolar a veia jugular, insira uma pinça fina entre o vaso e o tecido circundante e abra e feche lentamente o instrumento para liberar suavemente a veia do tecido.

Quando a veia jugular estiver completamente limpa, posicione a pinça sob o vaso e coloque duas suturas 7-0 de 10 cm de comprimento embaixo dela. Dê dois nós para fechar a sutura proximal à cabeça e com a segunda sutura, prepare um nó, mas não feche. Agora, com uma pinça em uma mão, segure o cateter cheio de solução salina estéril a 37 graus Celsius e, com a outra mão, use uma tesoura ou uma agulha curva de calibre 26 para fazer uma pequena incisão no vaso.

Insira o cateter na veia jugular e feche o nó duas vezes. Em seguida, feche a sutura proximal à cabeça sobre o cateter para garantir a imobilização completa. Para isolar e preparar as artérias corroídas, use uma pinça curva fina para dissecar a área que cobre a traqueia.

Então, uma vez que os corroídos estejam livres dos tecidos circundantes, remova o nervo vegas do vaso sem cortá-lo, fechando e abrindo lentamente a pinça fina, se necessário, para mobilizar suavemente o nervo. Quando ambas as artérias estiverem completamente limpas, posicione a pinça sob a primeira artéria corroída e, tomando cuidado para não esticar demais o vaso, coloque um pequeno suporte de plástico preto de 3 mm por 2,5 cm sob o vaso. Assim que o suporte do vaso estiver no lugar, certifique-se de que o fluxo sanguíneo esteja presente.

Para evitar esticar o vaso, a mão do operador deve se mover o mínimo possível com um único movimento da primeira pinça para isolar a artéria corroída e a ajuda da segunda pinça para fazer um orifício sob o vaso. Quando o suporte do vaso estiver posicionado corretamente, coloque a segunda artéria sobre o dispositivo. Se o camundongo não for colocado diretamente sob o microscópio, coloque as glândulas de volta sobre a traqueia e aplique solução salina estéril a 37 graus Celsius para evitar o ressecamento da zona.

Em uma seringa de 1 mL, prepare uma diluição de 1-4 em solução salina estéril, de uma solução estoque descongelada de 2 mg por mL de laranja de acridina. Proteja a seringa da luz. Para realizar medições, posicione o mouse sob um microscópio de florescência de campo amplo de alta velocidade usando um condensador de longa distância e uma objetiva de imersão em água de 10x com um monocromater, um divisor de feixe e uma câmera CCD.

Adquira imagens em tempo real, focando a objetiva no meio da artéria corroída na superfície endotelial. Injete lentamente 50 mL de laranja de acridina. Em seguida, configure o software para gravar 100 imagens, com um tempo de exposição de 120 milissegundos por imagem.

Grave quatro vídeos por artéria corroída em diferentes locais da artéria para cada vídeo. Se o sinal fluorescente diminuir, injete mais 50 mL de laranja de acridina. Para testar diferentes condições, injetar a laranja de acridina diretamente na veia lateral da cauda se um cateter jugular não tiver sido inserido e realizar a mesma aquisição de imagem.

Como controle, registre as medições de florescência de camundongos não injetados positivos para lys-Mcre-Mcre, IRG-positivos. Quantifique as células de rolamento e aderência em uma visão retangular de 200 mícrons por 250 mícrons colocada no meio do recipiente para cada vídeo, exibida a uma velocidade de 10 imagens por segundo. Conte as células de rolamento e aderência.

As células de adesão são definidas como células que não se movem ou se desprendem do endotélio no vídeo de 10 segundos. Para simplificar a quantificação, remova o canal com a fluorescência vermelha e use apenas a fluorescência verde para contar as células rolantes e aderentes. Neste estudo, os corroídos de camundongos positivos para lys-mCre e IRG-positivos infundidos com angiotensina 2 foram observados usando IVM.

Como visto aqui no início do estudo, a presença de um cateter jugular resultou na adesão de células fluorescentes positivas para lis-M. Após a injeção de laranja de acridina, as células endoteliais também eram fluorescentes. Em seguida, a redução do fundo para limitar a fluorescência relacionada ao endotélio revelou que todas as células nucleadas aderentes eram positivas para lys-M.

Neste experimento, após uma semana de infusão de angiotensina 2, as interações do endotélio leucocitário em artérias corroídas de camundongos IRG-positivos para lys-M Cre-positivo, foram visualizadas e visualizadas por IVM, com ou sem injeção de laranja de acridina, por meio de cateter jugular ou pela veia caudal. Sem qualquer cateter ou injeção, o rolamento de células positivas para lys-M aumentou significativamente após a infusão de angiotensina 2, em comparação com camundongos não tratados. E a adesão também aumentou.

A injeção de laranja de acridina com cateter jugular aumentou a adesão e o rolamento em camundongos tratados com angiotensina 2, em maior extensão em comparação com camundongos sem cateter. Finalmente, como visto nesses painéis, a injeção de laranja de acridina na veia da cauda leva a uma adesão e rolamento semelhantes em comparação com os camundongos que não receberam injeção de laranja de acridina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em trinta minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não danificar os tecidos ao redor dos vasos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores nas áreas cardiovascular e hemostática explorarem leucócitos e adesão plaquetária à parede vascular in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como limitar o impacto da injeção de corante e da cirurgia na MIV.

Não se esqueça de que trabalhar com corantes fluorescentes intercalantes pode ser extremamente perigoso, e o contato da pele com o corante deve ser evitado com o material adequado, como luvas.