Name: Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar o rolamento e adesão de leucócitos em artérias corroídas de camundongos com hipertensão induzida por angiotensina II usando microscopia intravital. Este método permite observar interações célula-endotélio em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo Ministério alemão de educação e pesquisa (BMBF 01EO1003 e BMBF 01EO1503).

Experimentos foram conduzidos na idade de ratos masculinos 8 a 12 semanas de idade sob a aprovação do Comitê de ética em experimentação animal do estado da Renânia-Palatinado (número de autorização de 23 177-07/G12-1-002 e 23 177-07/G15-1-051).
1. anestesia e cirurgia preparação de rato
<ol>
	<li>Antes da cirurgia, verificar a saúde e a condição dos animais. Antes da cirurgia, monitor animais uma vez por dia durante 2-3 dias por sua condição geral (aparência, postura, comportamento espontâneo), bem como o peso corporal, consumo de água e comida.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre para anestesia com midazolam (5 mg/kg de peso corporal), medetomidina (0,5 mg/kg de peso corporal) e fentanil (0,05 mg/kg de peso corporal) de intraperitonealmente (i.p.) injetar 200 rato µ l/30 g em seringa de 1 mL com agulha 26G.</li>
	<li>Implantação de bomba osmótica e preparação de animais para experiências IVM são executadas em um campo de operação com 39 ° C plataforma de aquecimento. Esterilizar todos os equipamentos em um banho de desinfecção e desinfectar a plataforma de aquecimento.</li>
	<li>Durante os procedimentos, protege os olhos do animais com pomada. Retire a pele com lâminas de barbear antes da implantação da bomba osmótica. Use um creme da remoção do cabelo e cotonetes para isolamento de carótidas e implantação de cateter jugular em experimentos IVM. Desinfectar a pele do animal usando dois desinfetantes de pele: um anti-séptico e desinfetante contendo iodopovidona e uma pele octenidine contendo anti-séptico em solução à base de álcool.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre para hostilizar a anestesia ("antisedan mix") com o atipamezol (0,05 mg/kg de peso corporal) e flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) e prepare-se 200 µ l/rato em seringa de 1 mL com agulha 26G para ser por via subcutânea (s.c.) injetado.</li>
</ol>
2. implantação e preparação da bomba osmótica
Nota: A infusão subcutânea de Sandra usando bombas osmóticos foi descrita em detalhe por Lu et al 17
<ol>
	<li>Prepare a Sandra, reconstituir o pó liofilizado com solução salina estéril e ajustar a concentração com o peso do animal e a taxa de entrega da bomba. Manter a Sandra reconstituída em tubos de plástico (não utilize tubos de vidro).</li>
	<li>Encha as bombas com a solução de Sandra para entregar 1 mg/(kg·d) por 7 dias. Após o preparo, manter as bombas em solução salina estéril para 4-6 h mínimo a 37 ° C.</li>
	<li>Teste a anestesia completa do mouse após injeção da mistura anestesia com traseira reflexos do pé e coloque-o sobre o campo de operação quente. Indução de anestesia leva 10-15 min e funciona melhor se os animais são colocados em um ambiente escuro.</li>
	<li>Raspar a parte inferior das costas o mouse e desinfectá-la com um anti-séptico de pele alcoólica.</li>
	<li>Faça uma incisão de 1 cm perpendicular à espinha com uma tesoura. Crie uma bolsa para a bomba usando uma pinça hemostática estreita e introduza a bomba (fluxo moderador primeiro). O bolso deve permitir a livre circulação da bomba sem pressão sobre a ferida.</li>
	<li>Feche a ferida com suturas e não de clipes, a fim de limitar a inflamação; em seguida desinfecte com anti-séptico de pele.</li>
	<li>Antagonizar a anestesia por injeção s.c. de 200 µ l da mistura antisedan e retornar o mouse para sua gaiola.</li>
	<li>Realizar a analgesia pós-operatória com buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) uma vez após a cirurgia e sob demanda, dependendo do comportamento animal.</li>
</ol>
3. implantação de cateter jugular e preparação de carótidas
<ol>
	<li>Testar a anestesia completa do mouse após injeção da anestesia misturar com reflexos traseira comida e colocar o animal anestesiado em decúbito dorsal na placa cirúrgica de 39 ° C com uma sonda retal a fim de manter a temperatura e passar a pomada os olhos para protegê-los durante o procedimento.</li>
	<li>Remova os pelos do pescoço usando o creme depilatório. Use um cotonete para espalhar e esfregue o creme por 2 min, até que os pelos começam a cair. Depois de um adicional 2 min, retire o creme e os cabelos com uma espátula e desinfectar a pele com um anti-séptico de pele alcoólica.</li>
	<li>Realizar a cirurgia sob um estereomicroscópio. Faça uma incisão longa de 1-1,5 cm na pele longitudinalmente no pescoço, 1 cm ao lado da traqueia. Em seguida, fazer duas outras incisões perpendicular a ambas as extremidades das incisões primeiras.</li>
	<li>Cuidadosamente remova tecidos ao lado da pele e o pedaço de pele que cobre a esquerda jugular e a traqueia.</li>
	<li>Cuidadosamente, isolar a glândula parótida; glândulas sublinguais e submandibulares, da zona de interesse com 2 pinças curvas. Não cortar ou danificar as glândulas, colocá-los para permitir o melhor acesso para a veia jugular e as carótidas.</li>
	<li>Para isolar a veia jugular, usar pinça fina e lentamente abra e feche-a suavemente livre do navio no tecido circundante. Uma vez que a veia é completamente limpa, posicione a pinça sob o vaso e coloque duas suturas de 7-0 de 10 cm sob ele.</li>
	<li>Feche a sutura proximal na cabeça com dois nós. Na outra sutura, preparar um nó, mas não fechá-lo.</li>
	<li>Segure o cateter (0,28 mm diâmetro, 0,61 mm de diâmetro exterior interior) preenchido com solução salina estéril de 37 ° C com fórceps com uma mão; enquanto com a outra mão, faça uma pequena incisão no vaso com uma tesoura fina ou uma agulha 26G curvo. Em seguida, insira o cateter na veia jugular e feche o nó duas vezes. Feche a sutura proximal na cabeça sobre o cateter a fim de garantir a imobilização completa.</li>
	<li>Para isolar e preparar as artérias carótidas, disse a zona que abrange a traqueia usando pinça curva fina.</li>
	<li>Uma vez que as carótidas estão livres de tecidos circundantes, remover o nervo vago (parece que uma linha branca adjacente na carótida) do navio (mas não cortá-la). A pinça fina pode ser fechada e aberta lentamente para mobilizar suavemente o nervo.</li>
	<li>Uma vez que ambas as artérias estão completamente limpas, coloque a pinça sob a primeira artéria carótida e um pequeno preto 3 mm x largura 2,5 cm comprimento pedaço de plástico sob o vaso. É muito importante não overstretch o navio e para verificar que o fluxo de sangue está presente, uma vez que o titular do vaso é colocado. Coloque a segunda artéria sobre o titular do navio. Se o mouse não é colocado diretamente sob o microscópio, volte a colocar as glândulas sobre a traqueia e aplicar soro fisiológico estéril de 37 ° C para evitar a secagem da zona.</li>
</ol>
4. avaliação do rolamento e adesão de leucócitos / LysM + pilhas com IVM
<ol>
	<li>Preparar a acridina laranja de um 2 mg/mL de solução armazenado a-20 ° C e diluir 1:4 em soro fisiológico estéril (concentração final de 0,5 mg/mL) em uma seringa de 1 mL.</li></ol>Proteger a seringa de luz e usar 200 µ l por um rato.<ol>
		<li>Diferentes condições experimentais: (1) injeção de acridina laranja com o cateter na jugular; (2) injeção de laranja de acridina diretamente para a veia lateral da cauda (com esta condição que foi implantado sem cateter jugular); (3) medição sem ratos acridina laranja usando a fluorescência LysMCre++ do IRG (aqui de novo sem cateter jugular foi implantado).</li>
	</ol>
	
	<li>Uma vez que o cateter está no lugar e as duas carótidas são isoladas, posicione o mouse sob o microscópio. Realizar medições com um microscópio de fluorescência de campo amplo de alta velocidade usando um condensador de longa distância e um 10 X (NA 0.3) objectivo de imersão de água com um monocromador, um divisor de feixe e uma câmera de dispositivo de carga acoplada. Realize a aquisição de imagens e análise com sistema de imagem em tempo real.</li>
	<li>Focar o objetivo do microscópio no meio da artéria carótida na superfície do endotélio. Injecte lentamente 50 µ l de laranja de acridina (0,5 mg/mL) (levar em conta o volume morto do cateter para a primeira injeção). Ajustar o software para gravar 100 imagens com um tempo de exposição de 120 milissegundos por imagem.</li>
	<li>Faça quatro vídeos por artéria carótida (esquerda e direita) em diferentes locais na artéria para cada vídeo. Se o sinal de fluorescência diminui, injete outro 50 µ l de laranja de acridina.</li>
	<li>Depois de gravar todos os vídeos eutanásia do animal por deslocamento cervical.</li>
	<li>Definir a velocidade de vídeo em 10 imagens por segundo e quantificar as células aderentes e rolamento em uma exibição de retângulo µm 200 µm x 250 colocado no meio do navio para cada vídeo. Contar as células de rolamento e aderentes; as células aderentes são definidas como células que não mover-se ou desconectar-se de endotélio dentro de 10 s video. Para simplificar a quantificação, remover o canal com a fluorescência vermelha e usar só a fluorescência verde para contar as células de rolamento e aderente.</li>
	<li>Para experimentos usando laranja de acridina, fazer um limiar manual da fluorescência a fim para remover fundo produzido pelas células endoteliais.</li>

<ol><li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality%3A+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li>
<li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosaic+theory+revisited%3A+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li>
<li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li>
<li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vascular+remodeling%2C+endothelial+dysfunction%2C+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice%3A+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li>
<li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li>
<li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li>
<li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li>
<li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+monocytes+and+platelets%3A+implication+for+life%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li>
<li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li>
<li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li>
<li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li>
<li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+the+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23(2011).</li>
<li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

LysM+ monócitos anteriormente foram mostrados para ser implicados no desenvolvimento da hipertensão5. Aqui nós mostramos que as células imunes LysM+ rolar e aderem à camada endotelial em resposta à infusão de Sandra. Esta constatação foi obtida usando LysMCre++ do IRG ratos de nossos estudos anteriores, explorar o papel das células do sistema imunológico em hipertensão na vivo através da visualização de leucócitos com injeção de acridina laranja6,10. Assim, a discriminação dos tipos de célula, aderindo ao endotélio não foi possível.
O IVM é uma ferramenta muito útil para estudos vasculares e observações na vivo de células diretamente na vasculatura, mas o impacto da injeção de corantes com a ajuda de um cateter inserido cirurgicamente no contexto inflamatório da hipertensão permanece desconhecido. Para avaliar o efeito potencial do cateter e laranja de acridina injeção aproveitamos a LysMCre+ratos IRG+ . Infusão de Sandra aumentou o número de células LysM+ de rolamento para o endotélio. Inserção de um cateter na veia jugular amplificado o efeito e mais rolamento e aderente leucócitos foram detectados em camundongos Sandra-infundido instrumentados com um cateter em comparação com ratos sem implantes de cateter. Isto indica a implantação de um causas de carótida cateter uma reação inflamatória sistêmica no contexto da cicatrização que se sobrepõe com a reação imune, vista em hipertensão arterial18. Além disso, devido à proximidade da veia jugular à artéria carótida uma ativação imune adicional pode ter ocorrido por afetar a veia jugular. Uma vez que este efeito não estava presente quando as injeções foram feitas diretamente para a veia da cauda, podemos assumir que o efeito era devido não a tintura, mas o procedimento de inserção do cateter. Temos aqui demonstrado a importância de camundongos transgênicos repórter expressando proteínas fluorescentes para não interferir na vivo processos durante a experimentação. Além disso, injeção de veia de cauda dos marcadores fluorescentes poderia ser uma alternativa possível para injeções de cateter na jugular.
Uma etapa crítica do processo é a infusão de Sandra. Cauda do manguito avaliação da pressão arterial pode ser feita a fim de controlar a eficácia de Sandra entrega pela bomba. Pressão arterial deve aumentar depois de 2−3 dias de infusão. Para limitar a inflamação que pode influenciar a ativação de células LysM+ , fechamento da incisão onde a bomba é implantada deve ser feito com suturas em vez de clipes. Deve-se notar uma limitação sobre a inclusão de veia da cauda: para fazer a melhor aquisição de dados possíveis, 4 vídeos são geralmente tomados para cada carótida. Se o sinal fluorescente diminui, 50 µ l de laranja de acridina são injetados, mas com injeção de cauda é mais difícil de fazer várias injeções e manter as carótidas estável no âmbito do objectivo de microscópio. A duração da presença de um cateter na veia jugular também pode modular a ativação de células do sistema imunológico, desde que está afetando a ativação da coagulação no plasma rico em plaquetas preparado 4 h após a implantação de cateter19. Este aspecto da implantação do cateter precisa de mais investigação.
Finalmente, mesmo se nós apreciamos o impacto da implantação do cateter jugular na ativação de células LysM+ após a infusão de Sandra, não totalmente estimamos o papel de preparação, remoção de pele e carótido isolamento na cela potencial LysM+ ativação. Podemos concluir que o uso de ratos de repórter de fluorescência como o LysMCre++ do IRG rato é recomendado para evitar o rompimento da integridade da embarcação durante a preparação de animais para a imagem latente na vivo .

Hipertensão arterial aumenta o risco de doença cardiovascular e morte e promove o desenvolvimento da aterosclerose, doença coronariana e thromboembolisms arterial ou venosa1. O desenvolvimento de hipertensão depende da interação de fatores ambientais, genéticos, endócrino e hemodinâmicas. Atualmente, a imunidade e inflamação relacionada são apreciados para desempenhar um papel importante na etiologia da hipertensão2.
Entre as células imunes, macrófagos, bem como os monócitos e linfócitos T foram encontrados para ser causalmente envolvidos na inflamação vascular induzida por Sandra e hipertensão, em parte relacionados com sua capacidade de desencadear de espécies reativas de oxigênio3. Macrófago colônia-estimulando fator deficientes ratos mostrou resposta reduzida a Sandra sobre o aumento da pressão arterial e inflamação vascular4. Em um trabalho anterior, poderíamos mostrar que LysM + monócitos dirigir disfunção vascular e inflamação na hipertensão induzida pela Sandra5. Mais recentemente, descrevemos um romance caminho no qual coagulação fator XI coopera com plaquetas e da parede do vaso para induzir inflamação vascular dependente de trombina6. O atual conhecimento sobre o papel do sistema imunológico em hipertensão foi recentemente resumido e analisado por Rodriguez-Iturbe et al. 7
Desde que a participação de células imunes no desenvolvimento da hipertensão tornou-se evidente, modelos e técnicas para estudar a interação entre o navio e células do sistema imune tornou-se necessário. Epifluorescence IVM dos vasos sanguíneos é uma ferramenta útil para observar na vivo interações entre circulantes de células do sangue e o endotélio8,9,10. Com esta técnica, injeção de corantes intercalante com DNA (como laranja de acridina) pode visualizar células nucleadas (circulação bem como do endotélio). Plaquetas isoladas manchado ex vivo com rhodamin - 6G ou diclorofluoresceína (DCF) pode ser injectada para visualizar trombo rico em plaquetas em modelos de lesão arterial ou venosa.
Normalmente, um cateter de veia jugular é usado para injetar traçadores ou marcado as plaquetas. Alteração do endotélio e subsequente ativação da cascata de coagulação são conhecidos por ter efeitos na ativação de monócitos. Lesão endotelial, imediatamente, leva a ativação plaquetária através de moléculas de subendothelial matriz para selar o tecido, com consequente monócito atração e ativação11. Pelo contrário, um endotélio intacto é conhecido por ter propriedades anticoagulante (por exemplo, através do inibidor de caminho de fator de tecido ou trombomodulina)12 e efeito inibitório direto sobre os monócitos, por exemplo, através da secreção de vesículas extracelulares contendo microRNAs13. Os monócitos são conhecidos por produzir um fator tecidual, o ativador extrínseco da cascata de coagulação e expressos protease-ativado receptores (PARs) que podem ser ativados pela trombina e participar da ativação de monócitos14,15 . Portanto, qualquer ativação das plaquetas ou da cascata de coagulação devido a lesão vascular pode ter efeitos inesperados na ativação de monócitos e interferir com o fenômeno observado. Com a ajuda do IRG transgénica LysM Cre transgénica dos ratos, um rato de repórter do Cre de duplo-fluorescente (LysMCre++do IRG), propomos a estudar detalhadamente o efeito de injeções com um cateter e métodos alternativos na LysM+ mielomonocítica células em um modelo do rato da hipertensão arterial16.

<table><tbody><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td>Mistura anestésica</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Pfizer Deutschland GmbH</td><td></td><td>Mistura anestésica</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>Janssen-Cilag GmbH</td><td></td><td>Mistura anestésica</td></tr><tr><td>Alzane</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Mistura antisedan</td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Hikma pharma</td><td></td><td>Mistura antisedan</td></tr><tr><td>Braunol</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bombas osmóticas</td><td>Alzet</td><td>1007D</td><td>Implante de bomba osmótica</td></tr><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Implante de bomba osmótica</td></tr><tr><td>7-0 sutura de prolene</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Implante de bomba osmótica</td></tr><tr><td>Laranja de acridina</td><td>Cateter Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths</td><td>Medical Deutschland GmbH</td><td></td><td>Diâmetro interno, 0,28 mm; diâmetro externo, 0,61 mm</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Microscópio de</td> fluorescência <td></td><td>Olympus BX51WI</td></tr><tr><td>Divisor de feixe</td><td>Fotometria</td><td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10X</td><td>Objetiva de imersão em água com monocromador</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Aquisição e análise de imagens software</td><td>Olympus</td><td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td><td></td></tr><tr><td>Ratos</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>Jax 008705</td><td>B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td></tr><tr><td>Camundongos</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>Jax 004781</td><td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J</td></tr></tbody></table>)

visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina ii-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescência vídeo a microscopia intravital (IVM) dos vasos sanguíneos é um método estabelecido para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e sua capacidade de papel e aderem à camada endotelial. Visualização de células em circulação por injeção de corantes fluorescentes ou anticorpos acoplados fluoróforo é comumente usada. Alternativamente, os ratos repórter fluorescentes podem ser usados. Interações de leucócitos, em particular lisozima M+ (LysM+) monócitos, com a parede do vaso desempenham um papel crucial na promoção da disfunção vascular e hipertensão arterial. Aqui apresentamos a técnica para visualizar e quantificar leucócitos rolamento e adesão em artérias carótidas em angiotensina II (Sandra)-induzido por hipertensão arterial sistêmica em ratos pelo IVM.
A implantação de um cateter danifica a parede vascular e leva a respostas de células alteradas. Comparamos a injeção de diferentes técnicas e vias de administração para visualizar leucócitos em um LysMCre++ do IRG mouse com expressão generalizada da proteína fluorescente vermelha e expressão condicional da proteína verde fluorescente em LysM + células. Para estudar a ativação de células LysM+ , usamos Sandra infundida ratos em que o rolamento e adesão de leucócitos ao endotélio é aumentada. Também injetamos cateter acridina laranja usando uma jugular ou diretamente que a cauda da veia e compararam a quantidade de rolamento e aderindo as células. Descobrimos que implante de cateter na jugular, por si, aumentou o número de rolamento e aderente LysM+ células em Souza-infundido LysMCre+ratos IRG+ , comparados aos controles. Essa ativação foi aumentada em camundongos Sandra-infundido. Curiosamente, injetando a aderência de célula de acridina laranja diretamente através da cauda veia não aumentar LysM+ ou rolando em camundongos Souza-infundido. Assim, demonstramos a importância de camundongos transgênicos repórter expressando proteínas fluorescentes para não interferir na vivo processos durante a experimentação. Além disso, injeção de veia de cauda dos marcadores fluorescentes poderia ser uma alternativa possível para injeções de cateter na jugular.

Carótidas de LysMCre++ do IRG ratos infundidos com Sandra foram observados usando IVM. Laranja de acridina foi injetada usando um cateter na jugular. Visamos olhar a proporção de células LysM+ em contacto com a parede vascular, em comparação com todas as células nucleadas circulantes (que também podem interagir com o navio desde a discriminação do tipo de células interagindo com o recipiente permaneceu aberto pergunta de nosso trabalho anterior). No início do estudo, a presença de um cateter na jugular faz com que a adesão das células LysM+ (Figura 2A, D). Após a injeção de laranja de acridina, as mesmas células eram fluorescentes, mas também as células endoteliais eram fluorescentes (Figura 2B, E). Após a redução do fundo para limitar endotelial relacionadas a fluorescência, os dados indicam que todas as células nucleadas de aderente são LysM+ (Figura 2, F); Estes resultados prendem verdadeiros após a infusão de Sandra, confirmando os resultados anteriores e demonstrando que a LysMCre++ do IRG é um bom modelo para observar o efeito da Sandra na ativação de células LysM+ .
Avaliamos o papel das vias de administração de acridina laranja na ativação de células LysM+ após a infusão de Sandra no LysMCre++do IRG. Após uma semana de infusão de Sandra, interações de leucócitos endotélio em artérias carótidas de LysMCre++ do IRG ratos foram fotografados e visualizados pelo IVM, com ou sem injeção de laranja de acridina, através de um cateter na jugular, ou através da veia da cauda. Sem cateter ou injeção, rolamento de LysM+ células aumentou significativamente após infusão de Sandra comparado com ratos não tratados e adesão mostrou um aumento (Figura 3). Injeção de acridina laranja com uma adesão de cateter jugular aumentada e rolando no Sandra tratou ratos em maior medida em comparação com ratos sem um cateter (Figura 3). Injeção de acridina laranja na veia da cauda leva à adesão semelhante e rolamento em comparação com os ratos que não receberam injeção de laranja de acridina (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Figura 1. Regime de infusão de angiotensina II e a avaliação das LysM+ células de rolamento e adesão em camundongos. LysMCre++ do IRG ratos foram infundidos 7 dias com Sandra e aderindo bem como rolamento LysM+ células sobre as carótidas foram quantificadas com ou sem injeção de acridina laranja através de um cateter na jugular ou pela veia da cauda injeção. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Figura 2. Avaliação da aderência de célula LysM+ e rolamento em artérias carótidas de LysMCre+ratos IRG+ . Adesão de LysM+ em LysMCre+células ratos IRG+ antes (A, D) e após a injeção de acridina (B, E) através de um cateter na jugular. Fluorescência vermelha e verde foram gravadas, células LysM+ (em verde) e células de músculo liso (em vermelho) eram visíveis. Após a injeção de laranja de acridina, células endoteliais também são visíveis no verde mas remover fluorescência de fundo permite que circulam apenas nucleated visualização da célula (C, F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Figura 3. Avaliação das vias de administração de corantes fluorescentes em angiotensina II infundido LysMCre+ratos IRG+ . Quantificação de rolamento (A) e aderindo LysM (B)+ células em farsa operado ou Sandra-infundido animais e com ou sem injeção de laranja de acridina, usando um cateter na jugular ou por injeção de veia da cauda. Fotos representativas das diferentes condições (C). Os resultados são média ± erro padrão da média. realizou-se 2-way ANOVA e post hoc teste do Bonferroni, n = 3-12/grupos; p &lt; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este manuscrito descreve o uso de camundongos transgênicos repórter e vias de administração diferentes de corantes fluorescentes em angiotensina II induzida por hipertensão usando microscopia intravital de vídeo dos vasos sanguíneos para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e suas capacidade de rolar e aderir ao endotélio.

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

O objetivo geral desta microscopia de vídeo intravital de epifluorescência, ou protocolo IVM de vasos sanguíneos, é visualizar e quantificar o rolamento e a adesão de leucócitos em artérias corroídas na hipertensão induzida por angiotensina II em camundongos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na patologia da disfunção vascular e hipertensão arterial, como o mecanismo de interação entre os leucócitos e, em particular, os lisossomos e células positivas, e o trabalho do vaso. A principal vantagem desta técnica é que podemos ver as interações in vivo entre as células sanguíneas circulantes e a compreensão vascular.Prepare um camundongo macho para a cirurgia após sete dias de tratamento com angiotensina dois com uma bomba osmática de acordo com o texto protol. Aplique pomada oftálmica sobre os olhos para protegê-los durante o procedimento. Coloque o animal anestesiado em decúbito dorsal em uma placa cirúrgica de 39 graus Celsius e insira uma sonda retal para manter a temperatura.Use um cotonete para espalhar e esfregar o creme depilatório no pescoço até que o cabelo comece a cair. Em seguida, após mais 2 minutos, use uma espátula para remover os pelos e o creme. Em seguida, desinfete a pele usando um anti-séptico alcoólico.Em seguida, sob um estereomicroscópio, faça uma incisão longitudinal de 1 a 1,5 cm na pele do pescoço, a 1 cm da traqueia. Em seguida, faça 2 incisões perpendiculares em cada extremidade da primeira incisão. Remova cuidadosamente o tecido logo abaixo da pele e remova o pedaço de pele que cobre a veia jugular esquerda e a traqueia.Em seguida, use duas pinças curvas para isolar cuidadosamente as glândulas corroídas sublinguais e submaxilares da zona de interesse. Tomando cuidado para não cortar ou danificar as glândulas, posicione-as para permitir o melhor acesso à veia jugular e aos corrideds. Em seguida, para isolar a veia jugular, insira uma pinça fina entre o vaso e o tecido circundante e abra e feche lentamente o instrumento para liberar suavemente a veia do tecido.Quando a veia jugular estiver completamente limpa, posicione a pinça sob o vaso e coloque duas suturas 7-0 de 10 cm de comprimento embaixo dela. Dê dois nós para fechar a sutura proximal à cabeça e com a segunda sutura, prepare um nó, mas não feche. Agora, com uma pinça em uma mão, segure o cateter cheio de solução salina estéril a 37 graus Celsius e, com a outra mão, use uma tesoura ou uma agulha curva de calibre 26 para fazer uma pequena incisão no vaso.Insira o cateter na veia jugular e feche o nó duas vezes. Em seguida, feche a sutura proximal à cabeça sobre o cateter para garantir a imobilização completa. Para isolar e preparar as artérias corroídas, use uma pinça curva fina para dissecar a área que cobre a traqueia.Então, uma vez que os corroídos estejam livres dos tecidos circundantes, remova o nervo vegas do vaso sem cortá-lo, fechando e abrindo lentamente a pinça fina, se necessário, para mobilizar suavemente o nervo. Quando ambas as artérias estiverem completamente limpas, posicione a pinça sob a primeira artéria corroída e, tomando cuidado para não esticar demais o vaso, coloque um pequeno suporte de plástico preto de 3 mm por 2,5 cm sob o vaso. Assim que o suporte do vaso estiver no lugar, certifique-se de que o fluxo sanguíneo esteja presente.Para evitar esticar o vaso, a mão do operador deve se mover o mínimo possível com um único movimento da primeira pinça para isolar a artéria corroída e a ajuda da segunda pinça para fazer um orifício sob o vaso. Quando o suporte do vaso estiver posicionado corretamente, coloque a segunda artéria sobre o dispositivo. Se o camundongo não for colocado diretamente sob o microscópio, coloque as glândulas de volta sobre a traqueia e aplique solução salina estéril a 37 graus Celsius para evitar o ressecamento da zona.Em uma seringa de 1 mL, prepare uma diluição de 1-4 em solução salina estéril, de uma solução estoque descongelada de 2 mg por mL de laranja de acridina. Proteja a seringa da luz. Para realizar medições, posicione o mouse sob um microscópio de florescência de campo amplo de alta velocidade usando um condensador de longa distância e uma objetiva de imersão em água de 10x com um monocromater, um divisor de feixe e uma câmera CCD.Adquira imagens em tempo real, focando a objetiva no meio da artéria corroída na superfície endotelial. Injete lentamente 50 mL de laranja de acridina. Em seguida, configure o software para gravar 100 imagens, com um tempo de exposição de 120 milissegundos por imagem.Grave quatro vídeos por artéria corroída em diferentes locais da artéria para cada vídeo. Se o sinal fluorescente diminuir, injete mais 50 mL de laranja de acridina. Para testar diferentes condições, injetar a laranja de acridina diretamente na veia lateral da cauda se um cateter jugular não tiver sido inserido e realizar a mesma aquisição de imagem.Como controle, registre as medições de florescência de camundongos não injetados positivos para lys-Mcre-Mcre, IRG-positivos. Quantifique as células de rolamento e aderência em uma visão retangular de 200 mícrons por 250 mícrons colocada no meio do recipiente para cada vídeo, exibida a uma velocidade de 10 imagens por segundo. Conte as células de rolamento e aderência.As células de adesão são definidas como células que não se movem ou se desprendem do endotélio no vídeo de 10 segundos. Para simplificar a quantificação, remova o canal com a fluorescência vermelha e use apenas a fluorescência verde para contar as células rolantes e aderentes. Neste estudo, os corroídos de camundongos positivos para lys-mCre e IRG-positivos infundidos com angiotensina 2 foram observados usando IVM.Como visto aqui no início do estudo, a presença de um cateter jugular resultou na adesão de células fluorescentes positivas para lis-M. Após a injeção de laranja de acridina, as células endoteliais também eram fluorescentes. Em seguida, a redução do fundo para limitar a fluorescência relacionada ao endotélio revelou que todas as células nucleadas aderentes eram positivas para lys-M.Neste experimento, após uma semana de infusão de angiotensina 2, as interações do endotélio leucocitário em artérias corroídas de camundongos IRG-positivos para lys-M Cre-positivo, foram visualizadas e visualizadas por IVM, com ou sem injeção de laranja de acridina, por meio de cateter jugular ou pela veia caudal. Sem qualquer cateter ou injeção, o rolamento de células positivas para lys-M aumentou significativamente após a infusão de angiotensina 2, em comparação com camundongos não tratados. E a adesão também aumentou.A injeção de laranja de acridina com cateter jugular aumentou a adesão e o rolamento em camundongos tratados com angiotensina 2, em maior extensão em comparação com camundongos sem cateter. Finalmente, como visto nesses painéis, a injeção de laranja de acridina na veia da cauda leva a uma adesão e rolamento semelhantes em comparação com os camundongos que não receberam injeção de laranja de acridina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em trinta minutos se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não danificar os tecidos ao redor dos vasos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores nas áreas cardiovascular e hemostática explorarem leucócitos e adesão plaquetária à parede vascular in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como limitar o impacto da injeção de corante e da cirurgia na MIV.Não se esqueça de que trabalhar com corantes fluorescentes intercalantes pode ser extremamente perigoso, e o contato da pele com o corante deve ser evitado com o material adequado, como luvas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Neste vídeo, demonstramos a visualização em tempo real das interações entre células sanguíneas e endoteliais nas veias mesentéricas de um modelo de camundongo injetado intraperitonealmente com lipopolissacarídeo.

Microscopia intravital para analisar as interações células sanguíneas-endoteliais em um modelo de camundongo com inflamação

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

A imagem in vivo das articulações é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino da artrite induzida por colágeno tipo II (CIA).

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Aprenda a visualizar e quantificar o rolamento e adesão de leucócitos em artérias corroídas de camundongos com hipertensão induzida por angiotensina II usando microscopia intravital. Este método permite observar interações célula-endotélio em tempo real.

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