Name: Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Explore a análise estrutural híbrida combinando cristalografia de raios X e SAXS para modelar regiões dinâmicas de proteínas. Este método permite estudar domínios ordenados e desordenados de Nsa1 em Saccharomyces cerevisiae.

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Difração foram recolhidos no sudeste equipe acesso Regional colaborativa (SER-CAT) 22-ID e 22-BM de luz síncroton no Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Os dados SAXS foi coletados sobre a trajetória de SIBILAS no avanço luz fonte (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Gostaríamos de agradecer o pessoal da trajetória de SIBILAS por sua ajuda com a coleta de dados remoto e processamento. Estamos gratos à pesquisa de espectrometria de massa nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e grupo de apoio para ajudar a determinar os limites do domínio da proteína. Este trabalho foi apoiado nos Instituto de saúde Intramural pesquisa programa nacional; E.U. Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 de R. E. S.) e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR, 146626 para M.C.P). Uso de APS foi apoiado pelo departamento de energia, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas sob contrato n º W-31-109-Eng-38. Uso da fonte de luz avançado (ALS) foi apoiado pelo Director, Office of Science, escritório de energia ciências básicas, o departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231. Suporte adicional para a trajetória de SIBILAS SAXS vem do Instituto Nacional de saúde do projeto MINOS (R01GM105404) e um high-end instrumentação Grant S10OD018483. Também gostaríamos de agradecer a Andrea Moon e Dr. Sara Andres por sua leitura crítica deste manuscrito.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Usando este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae foi gerado por estudos estruturais por cristalografia de raios x e SAXS. Nsa1 foi bem comportado na solução e cristalizado em múltiplas formas de cristal. Durante a otimização destes cristais, foi descoberto que o C-terminal da Nsa1 era sensível à degradação de protease. A alta resolução, forma de cristal ortorrômbico só poderia ser duplicada com variantes de truncamento do C-terminal do Nsa1, provavelmente porque o C-terminal flexível de Nsa1 impediu a e...

Os ribossomas são máquinas de grande ribonucleoprotein que realizam o papel essencial de traduzir o mRNA em proteínas em todas as células vivas. Ribossomos são compostos por duas subunidades, que são produzidas em um processo complexo denominado Ribossoma biogênese1,2,3,4. Montagem do Ribossoma eucariota conta com a ajuda de centenas de montagem ribosomal essencial fatores2,3,5. Nsa1 (Nop7 associou 1) é um fator de montagem do Ribossoma eucariota que especificamente necessária para a produção do grande subunidade ribossomal6, e é conhecido como WD-repetição contendo 74 (WDR74) no maior organismos7. WDR74 tem demonstrado ser necessário para a formação de blastocistos em ratos8e o promotor de WDR74 é frequentemente uma mutação em células de câncer9. No entanto, a função e mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 no assembly do Ribossoma ainda são em grande parte desconhecidos. Para começar a descobrir o papel de Nsa1/WDR74 durante o amadurecimento do Ribossoma eucariota, realizaram-se várias análises estruturais, incluindo cristalografia de raios x e pequeno ângulo de espalhamento (SAXS) de raio-x10.
Cristalografia de raios x, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), microscopia eletrônica e SAXS são todos importantes técnicas para estudar a estrutura macromolecular. Tamanho, forma, disponibilidade e estabilidade das influências de macromoléculas, o método de biologia estrutural, para o qual uma macromolécula particular será melhor adequado, no entanto, combinar várias técnicas através de uma abordagem so-called "híbrido" está se tornando um ferramenta cada vez mais benéfico11. Em particular, cristalografia de raios x e SAXS são complementares e poderosos métodos para determinação estrutural de macromoléculas12.
Cristalografia fornece estruturas atômicas de alta resolução, variando de pequenas moléculas a grande maquinaria celular, tais como o ribossoma e levou a inúmeros avanços na compreensão das funções biológicas das proteínas e outros macromoléculas13. Além disso, o design de drogas baseado em estrutura aproveita o poder da estruturas de cristal para encaixe molecular por métodos computacionais, acrescentando uma dimensão crítica a droga descoberta e desenvolvimento de14. Apesar de sua ampla aplicabilidade, sistemas flexíveis e desordenados são difíceis de avaliar por cristalografia, desde que a embalagem de cristal pode ser prejudicada ou mapas de densidade de elétrons podem ser incompletos ou de má qualidade. Por outro lado, SAXS é uma abordagem estrutural baseada em solução e baixa resolução capaz de descrever sistemas flexíveis, variando de loops desordenados e termini a proteínas intrinsecamente desordenado12,15,16. Considerando que é compatível com uma ampla gama de tamanhos de partículas12, SAXS pode trabalhar em sinergia com cristalografia para ampliar o leque de questões biológicas que podem ser abordados pelos estudos estruturais.
Nsa1 é apropriado para uma abordagem estrutural de híbrido, porque ele contém um domínio WD40 bem estruturado, seguido de um C-terminal funcional, mas flexível que não é passível de métodos de cristalografia de raios x. A seguir é um protocolo para a clonagem, expressão e purificação de S. cerevisiae Nsa1 para determinação estrutural híbrido por cristalografia de raios x e SAXS. Este protocolo pode ser adaptado para estudar as estruturas de outras proteínas que são compostas por uma combinação de regiões ordenadas e desordenadas.

<table><tbody><tr><td>Clonagem molecular de Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 vetor paralelo</td><td>Sheffield et al, Expressão e purificação de proteínas 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>Usamos uma versão modificada de pMBP2 que incluía um DNA genômico N-terminal His-tag (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primers para clonagem de Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>Produção de proteínas recombinantes e purificação de Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Células estelares</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP-NSA1 e vários truncamentos</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenometionina</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr> IPTG, <tr><td>Coquetel de inibidor de protease livre</td><td></td> de dioxano Promega V3953 <td></td> EDTA Sigma-Aldrich 4693159001 <td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Caledon Produtos químicos de laboratório</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazol, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Affinity Resina</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL Filtro Centrífugo (MWCO 10K)</td> <td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel de Grau de Preparação Coluna de Filtração</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV Protease</td><td>Preparada por NIEHS Expressão de Proteína Plasmídeo de</td><td>Expressão Principal fornecido por NCI (Tropea et al. Métodos Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Cristalização, Triagem Proteolítica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Sal Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Tela de índice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Tela PEG/Ion</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Dimensões Moleculares</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96-well 3-drop UVP placas de queda sentadas</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>Fita de vedação cristalina de 3 polegadas de largura</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Dimensões Moleculares</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/hidróxido de sódio pH 7,5</td><td>Dimensões Moleculares</td><td>MD2-011-Citrato</td><td></td></tr> de <tr><td>Sódio tribásico</td><td>Dimensões Moleculares</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0,22 mm Lâminas de cobertura Siliconizadas</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços com selante (Placa VDX com Selante)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM Loops de Nylon Montados (0.05 mm a 0.5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Contas de Sementes</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de Cristal Magnético</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Varinha Cryo Magnética</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Espuma criogênica Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de disco de cristal</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Saia completa 96 bem Placa transparente</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat Tapete de vedação</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop Lite</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Websites</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski e Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo e Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>O Sistema de Gráficos Moleculares PyMOL, Versão 1.8 Schr&ouml; dinger, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov e Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de nsa1 de s. cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determinação da estrutura completo do fator de montagem do Ribossoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um desafio por causa da desordenada e protease lábil C-terminal da proteína. Este manuscrito descreve os métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análise estrutural por cristalografia de raios x e SAXS. Cristalografia de raios x foi utilizada para resolver a estrutura do domínio N-terminal WD40 bem-ordenado de Nsa1, e em seguida SAXS foi usado para resolver a estrutura do C-terminal da Nsa1 em solução. Dados de dispersão de solução foi colhidos em longa-metragem Nsa1 em solução. Calcularam-se as amplitudes de espalhamento teórico da estrutura de cristal de alta resolução do domínio do WD40, e em seguida, uma combinação de corpo rígido e ab initio modelagem revelou o C-terminal da Nsa1. Através desta abordagem híbrida a estrutura quaternária da proteína inteira foi reconstruída. Os métodos apresentados aqui devem ser geralmente aplicáveis para a determinação estrutural de híbrido de outras proteínas, composto por uma mistura de domínios estruturados e não estruturados.

Nsa1 foi PCR amplificados de DNA genômico de S. cerevisiae e subcloned em um vetor que contém uma marca de afinidade de 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP e um site de protease TEV. Nsa1 transformou-se em células de Escherichia coli BL21(DE3) e rendimentos elevados da expressão da proteína foram obtidos após indução com IPTG e crescimento a 25 ° C durante a noite (figura 1A). Nsa1 foi afinidade-purified na resina de afinidade de cobalto...

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir uma proteína recombinante composta por uma mistura de domínios ordenados e desordenados para análise estrutural híbrida por cristalografia de raios-x e espalhamento de raios-x a baixo ângulo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia estrutural sobre colocar a função biológica para que a determinação de todas as soluções permaneça na estrutura da proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para modelar regiões dinâmicas de uma proteína ou macromolécula que não podem ser resolvidas por cristalografia de raios-x.Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldade no início para aprender a avaliar adequadamente a qualidade de seus dados SAXS. Para iniciar o procedimento, transforme um plasmídeo de expressão de Nsa1 em uma cepa de expressão de E.coli adequada. Cultive as células, induza a expressão de Nsa1 e colha as células.Ressuspenda as células em 25 mililitros de tampão de lise, pré-resfriamento a quatro graus Celsius, contendo um comprimido inibidor de protease livre de EDTA. Sonicar as células a quatro graus Celsius por sete minutos, com um ciclo de dois segundos ligado, doi

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo apresenta um protocolo para processamento de imagens cryo-EM usando o software suite SPHIRE. O presente protocolo pode ser aplicado para quase todos os projetos de EM de partículas individuais que visam a resolução quase atômica.

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Aqui, apresentamos como espalhamento de raio-x do pequeno ângulo (SAXS) pode ser utilizada para obter informações sobre envelopes de baixa resolução que representa as estruturas macromoleculares. Quando usado em conjunto com técnicas estruturais de alta resolução como a cristalografia de raio-x e ressonância magnética Nuclear, SAXS pode fornecer insights detalhadas em vários domínios de proteínas e complexos macromoleculares em solução.

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Apresentamos o uso do protocolo de MeshAndCollect para obter um conjunto de dados de difração completa, para uso na determinação da estrutura subsequente, composto de difração parcial de conjuntos de dados coletados de muitos pequenos cristais de proteína fluorescente Azul cerúleo.

Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

As medições SEC-BioSAXS de macromoléculas biológicas são uma abordagem padrão para determinar a estrutura de soluções de macromoléculas e seus complexos. Aqui, analisamos os dados da SEC-BioSAXS de dois tipos de traços SEC comumente encontrados — cromatógramas com picos totalmente resolvidos e parcialmente resolvidos. Demonstramos a análise e a desconvolução utilizando dispersão e BioXTAS RAW.

Análise dos dados da SEC-SAXS via desconvolução e dispersão da EFA

A cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica estrutural que permite a localização de átomos de hidrogênio, fornecendo detalhes mecanicistas importantes da função proteica. Apresentamos aqui o fluxo de trabalho para a montagem de um cristal proteico, coleta de dados de difração de nêutrons, refinamento de estrutura e análise dos mapas de densidade de extensão de dispersão de nêutrons.

Coleta e processamento de dados de cristalografia de nêutrons para modelagem de átomos de hidrogênio em estruturas proteicas

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Explore a análise estrutural híbrida combinando cristalografia de raios X e SAXS para modelar regiões dinâmicas de proteínas. Este método permite estudar domínios ordenados e desordenados de Nsa1 em Saccharomyces cerevisiae.

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Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

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