Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

O objetivo geral deste procedimento é produzir uma proteína recombinante composta por uma mistura de domínios ordenados e desordenados para análise estrutural híbrida por cristalografia de raios-x e espalhamento de raios-x a baixo ângulo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia estrutural sobre colocar a função biológica para que a determinação de todas as soluções permaneça na estrutura da proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para modelar regiões dinâmicas de uma proteína ou macromolécula que não podem ser resolvidas por cristalografia de raios-x.

Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldade no início para aprender a avaliar adequadamente a qualidade de seus dados SAXS. Para iniciar o procedimento, transforme um plasmídeo de expressão de Nsa1 em uma cepa de expressão de E.coli adequada. Cultive as células, induza a expressão de Nsa1 e colha as células.

Ressuspenda as células em 25 mililitros de tampão de lise, pré-resfriamento a quatro graus Celsius, contendo um comprimido inibidor de protease livre de EDTA. Sonicar as células a quatro graus Celsius por sete minutos, com um ciclo de dois segundos ligado, dois segundos desligado. Em seguida, centrifugue o lisado a 26.900 vezes a gravidade por 45 minutos a quatro graus Celsius.

Certifique-se de que a mistura não congela durante a centrifugação. Em seguida, equilibre uma coluna de fluxo por gravidade contendo 10ml de resina de afinidade de cobalto imobilizada com tampão de lise. Carregar o lisado clarificado na coluna e deixá-lo fluir através da resina a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave a resina duas vezes com porções de 100ml de tampão de lise. Eluir Nsa1 da coluna com 20ml de tampão de eluição. Execute uma alíquota de 15 mcl do eluere em um gel de quatro a 15% SDS-PAGE para confirmar a eluição da proteína.

Em seguida, adicione 1ml da solução estoque de protease TEV 1mg / ml ao eluere. Incube o eluere a quatro graus Celsius durante a noite para remover a etiqueta MBP. Em seguida, use uma unidade de filtro centrífugo de 10 kilodalton para concentrar o Nsa1 clivado por MBP em cerca de 5 ml, tomando cuidado para não se concentrar demais.

Purifique a proteína concentrada em uma coluna de filtração de gel pré-equilibrada com o Tampão A. Uma das etapas críticas neste procedimento é garantir a remoção de todos os agregados durante a purificação. Os agregados interferirão na cristalização e na aquisição e análise de dados SAXS. Analise amostras de 15mcl de cada fração de coluna com SDS-PAGE para confirmar a separação de MBP de Nsa1.

Combine as frações contendo Nsa1. Use uma unidade de filtro centrífugo de 10 kilodalton para concentrar as frações combinadas em cerca de 8mg/ml. Meça a absorbância em 289 nanômetros e calcule a concentração de proteína.

Proceder imediatamente aos ensaios de triagem proteolítica e cristalização. Para iniciar a triagem proteolítica, prepare soluções estoque de 1 mg / ml de alfa-comotripsina, tripsina, elastase, capayina, septilisina e endoproteinase GluC. Diluir cada solução-mãe com tampão de diluição a 1:10, 1:100 e 1:1, 000.

Diluir a solução de 8 mg/ml de Nsa1 para 1 mg/ml com tampão A. Em seguida, para cada diluição da protease, combinar 1 mcl da diluição da protease com 9 mcl do stock de proteínas diluídas. Incube as soluções a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 10mcl de 2x amostra SDS-PAGE para tamponar em cada solução e aqueça as soluções a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Execute as soluções em um gel de quatro a 15% SDS-PAGE para identificar domínios resistentes à protease. Crie construções de expressão truncadas que excluam regiões lábeis de protease. Expresse e purifique essas proteínas para otimização da cristalização.

Depois de adquirir dados SAXS para a proteína Nsa1 em uma faixa de concentrações, defina o caminho do arquivo de shell terminal para o diretório que contém os dados. Em seguida, inicie o software de análise. Carregue as curvas de espalhamento no software de análise.

Use a ferramenta RG automático para determinar o raio de giro e a intensidade de dispersão para frente para cada curva. Em seguida, gere gráficos de Kratky para cada curva de dispersão para determinar o grau de compacidade. Use a ferramenta autonome para calcular a função de distribuição em pares para cada curva, usando uma dimensão máxima inicial de 3x o raio de giro.

Otimize a dimensão máxima para obter uma curva de função de distribuição suave e em pares que seja consistente com a curva de dispersão experimental. Compare os parâmetros estruturais entre as concentrações para verificar a ausência de danos causados pela radiação ou efeitos dependentes da concentração. É fundamental comparar os principais parâmetros estruturais, incluindo raio de giro, massa molecular, espalhamento direto e funções de distribuição de distância de pares em uma série de concentrações.

E isso é para garantir que não haja danos por radiação ou efeitos de concentração. Em seguida, execute o utilitário do método de otimização de conjunto usando o arquivo de estrutura cristalina da proteína inicial, o arquivo de sequência da proteína alvo e o arquivo de dados experimental SAXS. Compare os valores de qui-quadrado do arquivo de estrutura cristalina inicial com o arquivo de conjunto para determinar se o modelo de conjunto se ajusta bem aos dados experimentais.

Use o software de visualização molecular para sobrepor a estrutura cristalina com os conformadores gerados. Observe o número total de conformadores e a fração de ocupação de cada conformador que contribui para a curva de dispersão. A clivagem proteolítica da protease lábil C terminal de Nsa1 resultou na formação de cristais ortorrômbicos.

O Nsa1 recém-purificado formou cristais cúbicos, mas a estrutura cristalina ainda carecia de densidade eletrônica para o terminal c lábil. O domínio WD-40 da hélice beta n-terminal de sete blated de Nsa1 foi bem resolvido em ambas as estruturas. O domínio Nsa1 WD-40 sozinho não foi um bom ajuste para os dados experimentais do SAXS.

Uma combinação de modelagem de corpo rígido e reconstrução abinicial do terminal C melhorou significativamente a qualidade do ajuste. A modelagem de conjunto proporcionou uma melhoria ainda maior na qualidade do ajuste, revelando a amostragem de confirmação da cauda C-terminal em solução. Embora o SAXS seja uma técnica estrutural de baixa resolução, ele complementa muito bem estudos estruturais de alta resolução, como a cristalografia de raios-x.

Assim, você pode modelar regiões flexíveis e desordenadas. Ao coletar e analisar os dados SAXS da macromolécula, você pode começar a entender a mudança de confirmação que ocorreu após Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como resolver a estrutura de uma proteína composta de regiões ordenadas e desordenadas por cristalografia de raios-x e SAXS.