Name: Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprenda microsampling capilar eletroforese-espectrometria de massa para metabolômica de célula única em embriões vivos de Xenopus laevis. Este método minimamente invasivo permite análise rápida do metabolismo durante o desenvolvimento embrionário.

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Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios GM114854 (de Parque Nacional) e CA211635 (de Parque Nacional), o Arnold e Mabel Beckman Fundação Beckman Young Investigator concedem (Parque Nacional), o prêmio DuPont jovem Professor (de Parque Nacional), a sociedade americana para a missa Prêmio de pesquisa espectrometria (de Parque Nacional) e bolsas COSMOS Club Foundation (para R.M.O e E.P.P.). As opiniões e conclusões expressadas nesta publicação são exclusivamente dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial das fontes de financiamento.

Os autores não têm nada para divulgar.

Microprobe CE-ESI-MS permite a caracterização directa dos metabolitos em células únicas em viver, livremente desenvolver embriões. O cerne da abordagem são dois subcomponentes técnicas, nomeadamente em situ microsampling capilar e alta sensibilidade CE-ESI-MS. em comparação à dissecação de células inteiras, microsampling capilar tem a vantagem de operação rápida (alguns segundos vs 5 min pilha / por dissecação), compatibilidade com a morfologia tridimensional complexa de embriões e escalabilidade de pequenas cél...

Uma compreensão abrangente do desenvolvimento embrionário exige caracterização de todas as alterações moleculares que se desenrolam em cada célula do organismo em desenvolvimento. Enquanto a próxima geração de sequenciamento com amplificação molecular permite medição profunda de célula única transcriptomes1 em desenvolvimento sistemas2,3, consideravelmente menos é conhecida sobre o conjunto de moléculas menores produzido em células embrionárias única, incluindo proteínas e, especialmente, metabólitos (massa molecular &#60; Da ~ 1.500). Com uma resposta rápida e dinâmica de eventos intrínsecos e extrínsecos, o metabolome serve como um poderoso descritor de estado molecular da célula. O metabolome de célula única, portanto, aumenta o potencial para acompanhar o desenvolvimento espacial e temporal da heterogeneidade celular no embrião precoce e identificar novas moléculas para estudos funcionais. No entanto, sem amplificação molecular disponível para estas moléculas, deteção da metabolome exige sensibilidade excepcional utilizando espectrometria de massa (MS), que é a tecnologia de escolha para a análise do metabólito.
MS de célula única é uma coleção de tecnologias com sensibilidade suficiente para medir metabólitos em células individuais (ver comentários 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reprodutível amostragem de células e extração eficiente de metabólitos são essenciais para a detecção bem sucedida de metabólitos em células únicas. Dissecação de células inteiras de identificadas células de embriões de Xenopus permitiu a caracterização de moléculas pequenas e peptídeos16. Outras abordagens empregam micropipetas para células individuais ao vivo, seguidas de deteção usando ionização electrospray (ESI) MS da amostra. Por exemplo, metabólitos foram medidos na planta ou células de mamíferos por célula única vídeo MS17, sonda de pressão18, única sonda19e microscopia fluídico força20, entre outras técnicas21, 22,23,24. Além disso, a incorporação de separação química antes de ionização para o fluxo de trabalho MS monocelulares eficientemente simplifica a metabolome, aliviando assim, a potenciais interferências durante a geração de íon antes da detecção. Importante, a separação também fornece informações específicas do composto para auxiliar na identificação molecular. Eletroforese capilar (CE) tem sido usado para detectar metabolitos nos neurônios de2726 ou microsampled único dissecado25,, capturando pequeno-molécula diferenças entre fenótipos de neurônio. Nós recentemente adaptado CE para ESI em tandem MS para habilitar a detecção de nível de rastreamento de centenas de metabólitos em células individuais que foram dissecados de embriões adiantados do Xenopus laevis16,28. Estes estudos revelaram diferenças metabólicas surpreendentes entre células embrionárias na fase inicial de desenvolvimento e levaram à descoberta de metabólitos com anteriormente desconhecidos impactos no desenvolvimento16.
Aqui nós fornecemos um protocolo que permitiu a detecção de metabólitos em únicas pilhas diretamente em um embrião de vertebrados ao vivo usando microsonda monocelulares CE-ESI-MS29,30. O organismo modelo escolhido é a 8-a-32-célula X. laevis embrião, embora a abordagem também é aplicável aos últimos estágios de desenvolvimento e outros tipos de organismos modelo. Este protocolo usa capilares afiados com multi-eixo controle translacional sob orientação por um sistema de imagens de alta resolução para aspirar uma porção de nL ~ 10 de células identificadas em situ no desenvolvimento do embrião morfologicamente complexo. Este microsonda é escalável para células menores e opera dentro de segundos, que é suficientemente rápido para acompanhar as linhagens de células no embrião. Depois de extrair polar ou apolar pequenas moléculas, tais como metabólitos e peptides, da amostra coletada em ~ 4-5 solução de extração µ l, uma ~ 10 nL do extrato resultante é analisada em uma plataforma de CE Custom-Built hifenizada de um espectrômetro de massa ESI. Construção e operação da plataforma CE-ESI-MS baseia-se em protocolos descritos em outro lugar. 31 , 32 a interface CE-ESI co-axial é construída conforme descrito em outro lugar. 31 esta plataforma é mantida no regime de pulverização de cone-jato para atingir o nível de rastreamento sensibilidade, com uma capacidade para quantificação sobre uma gama dinâmica de log-ordem de 4-5 (relativo28,29,30 ou absoluto16). A plataforma de CE-ESI-MS oferece um limite de detecção com 8% desvio-padrão relativo (RSD) 60-amol na quantificação sobre um intervalo testado de 10 nM a 1 µM para pequenas moléculas,16, que são suficientes para caracterizar metabólitos endógenos, em X. laevis células. Microprobed células continuam a dividir-se no decorrer do embrião, através de desenvolvimento30, permitindo a análise temporal e espacialmente resolvido de metabolismo celular. De facto, única célula CE-ESI-MS pode ser usado para encontrar diferenças metabólicas entre as células que ocupam o dorso-ventral16,29, animal-vegetal,16e esquerda-direita28 eixos do desenvolvimento bem como células que formam a tecido neural predestinada linhagem dorsal de uma célula progenitora comum em X. laevis30. Além de consultar as diferenças metabólicas entre células embrionárias individuais em diferentes fases do desenvolvimento do embrião X. laevis 30, prevemos que os protocolos aqui descritos são aplicáveis a uma ampla gama de biomoléculas e microsampled de células individuais de diferentes fases do desenvolvimento embrionário, bem como outros tipos de células e organismos-modelo. Além disso, a microsonda poderia ser usada para microsampling enquanto uma plataforma diferente compatível com amostras minúsculas pode ser usada para a separação e/ou caracterização de biomoléculas.

<table><tbody><tr><td>Reagentes para meios de cultura de embriõescloreto de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Metabolito Solventes de extração</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila (grau LC-MS)</td><td>Metanol Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>(grau LC-MS)</td><td>Água Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>(grau LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solventes e Padrões para CE-ESI-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico (grau LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grau LC-MS)</td><td>Água Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>(grau LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de acetilcolina</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Configuração de fabricação de microssonda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropippette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de borossilicato</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina e afiada: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Resistente à corrosão e autoclavável.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Configuração de amostragem de microssonda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Estereomicroscópio TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Deve ser isolado vibracionalmente.</td></tr><tr><td>Iluminador, por exemplo, Goosenecks</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência (plástico, descartável)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri 60 mm e 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur (borosilicato, descartável)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Centrífuga 13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Configuração</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de alta tensão</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>O HVPS pode ser controlado remotamente usando um programa de baixa tensão gerado por um computador pessoal. Cuidado: Alto voltage apresenta risco de choque elétrico; Todas as partes conectivas devem ser aterradas ou cuidadosamente blindadas para evitar a exposição acidental dos usuários.</td></tr><tr><td>Bombas de seringa (2)</td><td>Aparelho</td><td>Harvard 704506</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Estereomicroscópio capaz de ampliação de 4,5&vezes, equipado com um iluminador para monitorar o modo de pulverização da interface CE-ESI.</td></tr><tr><td>Estágio de tradução XYZ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>Estágio de tradução XYZ</td><td>Construído sob medida</td><td></td><td>Esta plataforma é capaz de carregar quantidades de nanolitros de amostra no capilar de separação por meio de injeção hidrodinâmica e fornecer o BGE para CE. Ambas as interfaces descritas neste trabalho foram capazes de injetar 6&ndash; 10 nL de amostra dentro de 1 min em um capilar de separação de 1 m</td></tr><tr><td>Frascos de amostra de aço inoxidável</td><td>Frasco BGE de</td> aço inoxidável personalizado <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Capilar</td> de sílica fundida personalizado <td></td><td></td></tr><tr><td>(40 &micro; m/105 e micro; m ID/OD; 100 cm)</td> <td>Tecnologias Polymicro</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de sílica fundida (75 &micro; m/360 e micro; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Tecnologias Polymicro</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Emissor de aço inoxidável com pontas rombas (130/260 &micro; m ID / OD)</td> <td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>Para um melhor desempenho, clive a laser e polir a ponta do emissor.</td></tr><tr><td>Seringas (à prova de gás): 500 - 1000 &micro; L</td><td>Hamilton Co.</td><td>Multímetro digital 1750TTL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa de alta resolução</td><td>Bruker Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>Espectrômetro de massa em tandem de alta resolução equipado com uma interface de pressão atmosférica configurada para ESI</td></tr><tr><td>Mistura de ajuste para calibração de espectrômetro de massa</td><td>Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Análise de dados ver. 4.3 software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento Auxiliar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vácuo capaz de operar em 4&ndash; 10&deg; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Microbalança analítica (XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-20 &deg; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-80 &deg; C)</td> Incubadora Refrigerada <td>Fisher Scientific</td><td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única metabolomics em embriões de viver rã (xenopus laevis)

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

A quantificação de pequenas moléculas em células únicas gera novos potenciais para melhor compreender os processos básicos que fundamentam o desenvolvimento embrionário. Para habilitar monocelulares investigações diretamente em embriões vivos, novas abordagens analíticas são necessários, especialmente aqueles que são sensíveis, seletiva, quantitativos, robusta e escalável para tamanhos diferentes da célula. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a análise em situ do metabolismo nas células únicas no livremente desenvolvimento de embriões do Sul Africana Xenopus (Xenopus laevis), um poderoso modelo em biologia celular e do desenvolvimento. Esta abordagem usa uma microsonda capilar para aspirar uma porção definida de simples células identificadas no embrião, deixando as células vizinhas intactas para análise posterior. O conteúdo da célula coletado é analisado por uma interface de microescala eletroforese capilar electrospray ionização (CE-ESI) acoplada a um espectrômetro de massa em tandem de alta resolução. Esta abordagem é escalável para vários tamanhos de célula e compatível com a complexa estrutura tridimensional do embrião em desenvolvimento. Como exemplo, demonstramos que microsonda que monocelulares CE-ESI-MS permite a elucidação de heterogeneidade celular metabólica que se desdobra como uma célula progenitora dá origem a descendentes durante o desenvolvimento do embrião. Além de célula e biologia do desenvolvimento, os protocolos de célula única análise descritos aqui são aptos para outros tamanhos de células, tipos de células ou modelos animais.

Nós recentemente empregados microsonda monocelulares CE-ESI-MS para caracterizar metabólitos em células individuais identificados livremente desenvolver embriões de Xenopus laevis 29,30. A microsonda permite rápido (~ 5 seg/cell), em situ aspiração de ~ 10 nL de uma célula individual, múltiplas aspirações da mesma célula, ou várias células diferentes dentro da mesmas ou posteriores estágios de desenvolvimento do ...

Descrevemos as etapas que permitem rápida situ em amostragem de uma pequena porção de uma célula individual com alta precisão e mínima invasão usando microamostragem baseada em capilar, para facilitar a caracterização química de um instantâneo da atividade metabólica em viver de embriões utilizando uma plataforma de espectrometria de massa e eletroforese capilar Custom-Built única célula.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

O objetivo geral deste protocolo é caracterizar metabólitos em células vivas de embriões em desenvolvimento por espectrometria de massa por eletroforese capilar por microamostragem in situ. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular e do desenvolvimento, pois permite a análise do metabolismo em células individuais diretamente em embriões vivos em desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, escalável para diferentes tamanhos de células e permite amostragem minimamente invasiva de células individuais em embriões vivos.A demonstração visual desse método é crítica, pois algumas etapas são difíceis de aprender porque o embrião se desenvolve relativamente rápido e um instrumento de ionização por eletroforese capilar personalizado é usado. Comece este procedimento com a preparação de 2% de agarose em uma solução de Steinberg 1X. Ainda líquido, cubra o fundo de placas de Petri de 60 milímetros com a solução.Assim que o gel de agarose esfriar e solidificar, acenda a ponta de uma pipeta Pasteur de seis polegadas até formar uma bola. Em seguida, toque levemente a extremidade aquecida para imprimir de cinco a 10 poços de aproxi

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Química

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

Aqui, apresentamos protocolos para realizar imagens de espectrometria de massa ambiente (MSI) de tecidos e análise de MS de célula única viva (SCMS) in-situ usando a sonda única, que é um dispositivo multifuncional miniaturizado para análise de MS.

Aplicações da sonda Individual: Imagem Espectrometria de Massa e Análise única célula sob condições ambientais

Uma plataforma integrada da manipulação da pilha é desenvolvida para o uso conjuntamente com uma instalação de espectrometria maciça da único-ponta de prova para a análise em linha de pilhas individuais da suspensão circunstâncias ambientais.

Plataforma integrada da manipulação da pilha acoplada com a único-ponta de prova para a análise da espectrometria maciça das drogas e dos metabolitos em únicas pilhas da suspensão

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Descrevemos aqui uma caracterização proteômica baseada em espectrometria de massa de linhagens celulares com destino tecidual conhecido no embrião do vertebrado Xenopus laevis .

Proteômica por Espectrometria de Massas Guiada por Linhagem Celular no Embrião em Desenvolvimento (Rã)

Este protocolo visa preservar metabólitos celulares para espectrometria de massa de célula única (SCMS), combinando lavagem de solução salina volátil, têmpera rápida de nitrogênio líquido, liofilização e armazenamento de -8 °C. Isso demonstra que a extinção do nitrogênio líquido é essencial para manter os perfis de metabólitos, enquanto o armazenamento refrigerado prolongado deve ser minimizado para evitar alterações metabólicas.

Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Fornecemos métodos detalhados para marcar metabolicamente e purificar transcritos nascentes para análise do transcriptoma em embriões iniciais de Xenopus usando 5-etinil-uridina (5-EU).

Marcagem Metabólica do Transcriptoma Nascente em Xenopus : Embriogênese Precoce

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo.  Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Aprenda microsampling capilar eletroforese-espectrometria de massa para metabolômica de célula única em embriões vivos de Xenopus laevis. Este método minimamente invasivo permite análise rápida do metabolismo durante o desenvolvimento embrionário.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

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