Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

O objetivo geral deste protocolo é caracterizar metabólitos em células vivas de embriões em desenvolvimento por espectrometria de massa por eletroforese capilar por microamostragem in situ. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular e do desenvolvimento, pois permite a análise do metabolismo em células individuais diretamente em embriões vivos em desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, escalável para diferentes tamanhos de células e permite amostragem minimamente invasiva de células individuais em embriões vivos.

A demonstração visual desse método é crítica, pois algumas etapas são difíceis de aprender porque o embrião se desenvolve relativamente rápido e um instrumento de ionização por eletroforese capilar personalizado é usado. Comece este procedimento com a preparação de 2% de agarose em uma solução de Steinberg 1X. Ainda líquido, cubra o fundo de placas de Petri de 60 milímetros com a solução.

Assim que o gel de agarose esfriar e solidificar, acenda a ponta de uma pipeta Pasteur de seis polegadas até formar uma bola. Em seguida, toque levemente a extremidade aquecida para imprimir de cinco a 10 poços de aproximadamente um milímetro de profundidade na agarose. Para fabricar micropipetas de ponta cônica, primeiro, puxe os capilares de borossilicato em um extrator capilar do tipo Flaming/Brown usando as configurações encontradas no protocolo de texto.

Em seguida, quebre a ponta da micropipeta puxada usando um par de pinças finas e afiadas para obter um diâmetro externo da ponta capilar de aproximadamente 20 mícrons. Execute esta etapa sob um microscópio estéreo para ajudar na precisão e reprodutibilidade. Obter embriões por meio do acasalamento natural induzido por gonadotrofinas de xenopus laevis adultos ou por fertilização in vitro, conforme referenciado no protocolo de texto.

Remova as camadas gelatinosas ao redor dos embriões quando eles começarem a se dividir no estágio de duas células, deixando primeiro os embriões descansarem na solução de desembaçar por dois minutos. Em seguida, gire-os suavemente por mais dois minutos para evitar que os embriões adiram à superfície do prato de coleta. Despeje delicadamente o conteúdo da louça em um copo limpo e transvase rapidamente a solução de desembaçar do copo.

Cubra imediatamente os ovos com 0,1X solução de Steinberg para enxaguar a solução de desembaçar restante. Agite suavemente e depois transvase a solução. Repita esta etapa quatro vezes para lavar bem os embriões.

Transfira os embriões gelatinosos para a solução de 1X Steinberg em uma placa de Petri. Para minimizar o aglomerado dentro das placas, coloque aproximadamente 100 embriões por placa de 100 milímetros. Classifique os embriões clivados no estágio de duas células em um prato separado no qual a pigmentação estereotipada marca com segurança o acesso ventral dorsal com referência para estabelecer mapas de sulfato.

Identifique corretamente os embriões clivados, certificando-se de que o primeiro sulco de clivagem, que demarca o plano sagital médio, divida a atração animal de pigmentação escura e a tração animal levemente pigmentada, de modo que as duas metades sejam imagens espelhadas. Em seguida, monte uma micropipeta fabricada em um micromanipulador multieixo. Conecte a micropipeta a um microinjetor.

Use uma pipeta de transferência de plástico para aspirar aproximadamente cinco dos embriões de oito células e transferi-los para o prato de amostragem contendo 0,5X solução de Steinberg. Usando uma alça de cabelo, posicione o embrião a ser amostrado em um poço individual e certifique-se de que a célula de interesse corretamente identificada esteja voltada para a microssonda em um ângulo aproximado de 90 graus. Enquanto trabalha sob o microscópio estéreo, guie a ponta da micropipeta para a célula única identificada dentro do embrião vivo.

Retire uma porção desejada do conteúdo da célula aplicando pulsos de pressão negativa ao microcapilar usando o microinjetor. Retraia suavemente a microssonda da célula e transfira sua ponta para quatro microlitros do solvente de extração de metabólitos resfriado em um frasco de tamanho micro. Em seguida, aplique um surto de pressão de 80 psi positivo por um segundo no capilar usando o microinjetor para expelir o aspirado para o solvente.

Feche bem o frasco para evitar a evaporação e coloque-o de volta no gelo até que a amostragem esteja completa. Uma vez concluída a amostragem, o vórtice mistura a amostra contendo frascos de microcentrífuga por aproximadamente um minuto para acelerar a extração de metabólitos. Em seguida, centrifugue os frascos a 8.000 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius para pulverizar detritos celulares e outras partículas.

Armazenar os extratos celulares juntamente com os restos celulares e precipitar a 20 graus Celsius negativos durante um dia ou a 80 graus Celsius negativos durante um mês até à medição por CE-ESI-MS. Construa a plataforma de injeção de CE capaz de tradução vertical rápida de um stage contendo o frasco de eletrólito de fundo e o microfrasco de carregamento de amostra, conforme referenciado no protocolo de texto. Monte a interface CE-ESI montando primeiro o emissor de metal eletrospray em uma união em T de três portas.

Em seguida, alimente o capilar CE de separação através do emissor de eletrospray, permitindo que ele se projete aproximadamente 40 a 100 mícrons além da ponta do emissor. Trabalhe sob um microscópio estéreo para ajudar na precisão. Conecte o capilar da solução em folha à porta restante para fornecer a solução de eletrospray.

Use mangas apropriadas e conexões apertadas com os dedos para uma operação sem vazamentos da interface CE-ESI. Usando um suporte de placa, monte a interface CE-ESI em um estágio de translação de três eixos e posicione a ponta do emissor de eletrospray a aproximadamente dois milímetros do orifício do espectrômetro de massa. Para limpar os componentes da interface, primeiro forneça a solução da folha de eletrospray através do emissor de eletrospray a um microlitro por minuto e o BGE através do capilar de separação CE.

Use bombas de seringa para alimentar os solventes a uma taxa constante. Em seguida, lave o capilar de separação CE antes de cada medição, conectando uma seringa à extremidade de entrada do capilar. Use seringas grandes de forma eficiente para minimizar o reabastecimento e a preparação das linhas de fornecimento de solvente.

Depois de enxaguar o capilar de separação por aproximadamente cinco minutos, transfira sua entrada para a solução BGE localizada no frasco de aço inoxidável. Posicione a ponta do emissor de eletrospray a aproximadamente dois milímetros do orifício do espectrômetro de massa. Ajuste essa distância usando um estágio de tradução para gerar eletrospray no regime de jato de cone estável enquanto monitora o spray usando um microscópio estéreo.

Monitore a estabilidade da corrente total de íons ou TIC por aproximadamente 30 a 45 minutos para garantir uma operação estável. Aplique 21 mais ou menos dois quilovolts ao frasco de BGE aumentando gradualmente o potencial ao longo de aproximadamente 15 segundos, normalmente gerando aproximadamente 7,5 microamperes de corrente através do capilar de separação usando 1% por cento de ácido fórmico como BGE. Antes de cada medição, garanta a estabilidade do sistema monitorando o perfil do TIC por aproximadamente cinco a 10 minutos e, em seguida, reduza gradualmente o potencial de separação para zero volts.

Pipetar um microlitro da solução-padrão de arrefecimento acetilo para o frasco para injetáveis e transferir o capilar de separação do frasco para injetáveis de BGE para o frasco para injetáveis. Levante o estágio de injeção CE 15 centímetros em um segundo. Após 60 segundos, injete hidrodinamicamente seis nanolitros da amostra no capilar de separação.

Em seguida, translade o estágio de volta aos níveis iniciais e mova suavemente a extremidade de entrada capilar para o BGE. Imediatamente depois, aumente a tensão CE para iniciar a separação eletroforética e a aquisição do estado EMA. Assim que o padrão for detectado, pare a aquisição de dados e diminua a tensão de separação gradualmente para zero volts.

Em seguida, recupere o emissor a dois centímetros do orifício. Lave o capilar de separação por cinco minutos antes de analisar o extrato celular. Meça 10 nanolitros do extrato de célula única repetindo essas etapas usando 90 segundos para injetar hidrodinamicamente a amostra.

Um eletroferograma representativo do extrato celular é mostrado aqui, no qual a separação de uma série de metabólitos identificados é exibida. 70 sinais diferentes foram identificados com alta confiança como pequenos metabólitos polares com base no tempo de migração e nos padrões de fragmentação MS / MS dos sinais do extrato celular em comparação com os de um padrão ou de bibliotecas espectrais de massa em tandem. A identificação de metabólitos é realizada comparando a massa precisa, o tempo de migração e o comportamento de fragmentação do sinal desconhecido da amostra com o padrão de metabólitos ou dados disponíveis em um banco de dados de metabólitos.

Esta etapa é demonstrada para histidina. Aqui, as células dorsais individuais que foram identificadas e amostradas usando a microssonda CE-ESI-MS são mostradas nos estágios embrionários de oito, 16 células e 32 células. A análise multivariada de metabólitos identificados nos três tipos diferentes de células descobriu diferentes perfis metabólicos e tendências metabólicas complexas em todos os estágios celulares.

A análise de componentes principais dos metadados quantitativos revelou alterações metabólicas como uma célula progenitora identificada do embrião de oito células dividida para formar um clone de células no embrião de 16 e 32 células. Tendências representativas são mostradas para metabólitos selecionados. Metabólitos como a acetilcolina diminuíram em abundância com a divisão celular, enquanto a trolamina e a serina/arginina mostraram tendências opostas nesses tipos de células.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita muito rápido, geralmente em menos de 10 segundos para cada célula. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando começamos o mapeamento da heterogeneidade celular metabólica no embrião inicial de xenopus laevis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a espectrometria de massa por eletroforese capilar de microssonda para analisar metabólitos em células embrionárias únicas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rápido, pois o metaboloma é dinâmico e as células se dividem rapidamente no embrião em desenvolvimento. Além disso, examine os detalhes analíticos para garantir que dados de alta fidelidade qualitativa sejam coletados sobre o metabolismo celular. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de espécimes vivos porque nossa abordagem de espectrometria de massa de microssonda funciona rapidamente, é minimamente invasiva e compatível com amostras pequenas.

Após este procedimento, outros métodos, como o rastreamento de sulfato, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o impacto dos metabólitos na especificação do tecido. Não se esqueça de que trabalhar com fontes de alimentação de alta tensão pode ser extremamente perigoso e precauções como isolar eletricamente interfaces eletrificadas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.