Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

O objetivo geral deste procedimento é medir a permeabilidade da barreira epitelial em organoides intestinais humanos ao longo do tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da gastroenterologia, como como toxinas específicas, produtos bacterianos ou mesmo tratamentos farmacológicos podem alterar a permeabilidade da barreira epitelial. A principal vantagem desta técnica é que ela permite tanto a visualização quanto a medição quantitativa da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real e usando tecido epitelial intestinal humano.

Antes da microinjeção de organoides intestinais humanos, o microinjetor deve ser configurado e o microcapilar preparado, instalado e testado conforme descrito no protocolo de texto. Para preencher o microcapilar com o material de injeção, mergulhe a ponta do microcapilar de vidro na suspensão de injeção de FITC-dextrano, tomando cuidado para evitar quebrar a ponta do microcapilar contra a lateral ou o fundo do tubo. Puxe a seringa de óleo mineral para puxar aproximadamente 10 microlitros da suspensão FITC-dextrana para o microcapilar.

Quando a suspensão de microinjeção preencher 90% do comprimento do microcapilar de vidro, pare de encher o microcapilar. Pressione ligeiramente a seringa antes de retirar o microcapilar da solução de microinjeção para garantir que a ponta do microcapilar não contenha bolsas de ar. Remova a placa de cultura organoide intestinal humana da incubadora de cultura de células e transfira para o gabinete de biossegurança com o microinjetor.

Remova a tampa da placa de cultura e centralize o primeiro poço no microscópio stage para que fique claramente visível através da ocular do osciloscópio na configuração de ampliação mais baixa. Gire o braço do micromanipulador de forma que o microcapilar seja apontado para baixo no poço de cultura em um ângulo maior que 45 graus em relação ao microscópio stage. Posicione bem a ponta do microcapilar acima da primeira cultura, aproximadamente um centímetro acima da superfície do meio.

Verifique se a ponta do filamento de vidro e o organoide intestinal humano são visíveis através da ocular. A chave para uma microinjeção bem-sucedida é alinhar cuidadosamente o microcapilar com o organoide antes de tentar a microinjeção. E eu sempre recomendo que novos usuários pratiquem com tecido sobressalente antes de tentarem um experimento crítico.

Girando o botão de controle do eixo z no sentido horário, avance o microcapilar lentamente. Perfure o organoide intestinal humano com a ponta microcapilar. A superfície externa do organoide intestinal humano se deprime ligeiramente quando o microcapilar começa a aplicar pressão e volta à forma quando a ponta penetra no lúmen.

Se houver dificuldade em ver a ponta do microcapilar dentro do lúmen, ajuste as configurações de iluminação ou ampliação do microscópio de dissecação. Quando o microcapilar estiver posicionado corretamente com a ponta do microcapilar perto do centro do organoide intestinal humano, remova as mãos dos controles do micromanipulador. Pressione ligeiramente a seringa cheia de óleo mineral para empurrar a solução de microinjeção para fora do microcapilar e para o lúmen organoide intestinal humano.

O organoide intestinal humano pode se expandir ligeiramente para acomodar o volume da injeção. Com o microcapilar posicionado acima do meio para evitar danos acidentais aos organoides intestinais humanos durante a manobra, passe para o próximo alvo do organoide intestinal humano. Entre os tratamentos ou em caso de quebra, altere o microcapilar.

Afrouxe o clamp na extremidade do braço do micromanipulador e remova o microcapilar do suporte da micropipeta. Para testar compostos entregues ao epitélio apical, o composto deve ser ressuspenso em PBS estéril contendo dois miligramas por mililitro de FITC-dextrano. Neste experimento representativo, ressuspenda a toxina TcdA de Clostridium difficile, adicione 12,8 nanogramas por microlitro em PBS contendo FITC-dextrano antes da microinjeção.

Microinjete o composto no lúmen organoide intestinal humano, conforme demonstrado na seção anterior. Para testar os compostos entregues ao compartimento lateral basal, após microinjeção de FITC-dextrano, substitua o meio de cultura externo por um novo meio contendo dois EGTA milimolares como controle positivo, veículo PBS sozinho como controle negativo ou outro composto experimental. Comece a imagem ao vivo imediatamente após a microinjeção.

Esta imagem representativa de campo brilhante mostra um organoide intestinal humano derivado de tecido após microinjeção de FITC-dextrana. O sinal fluorescente é aparente mesmo sem o uso de um conjunto de filtros específico. Organoides intestinais humanos derivados de células-tronco foram microinjetados com dextrano conjugado com FITC de quatro kilodalton suspenso em PBS, ou PBS contendo toxina Clostridium difficile TcdA.

Como controle positivo, o EGTA foi adicionado ao meio de cultura de organoides intestinais humanos em um subconjunto de organoides intestinais humanos injetados com PBS e FITC-dextrano. Os organoides intestinais humanos foram fotografados por 20 horas. Conforme ilustrado por essas imagens, os organoides intestinais humanos injetados com PBS retiveram quase todo o sinal fluorescente presente em T zero.

No entanto, os organoides intestinais humanos que também foram injetados com TcdA, ou tratados com EGTA, exibiram uma diminuição substancial na intensidade fluorescente em oito horas após a microinjeção. Os dados de imagem foram quantificados para todos os organoides intestinais humanos em todos os pontos de tempo para gerar um conjunto de dados de alta resolução representando a mudança relativa na intensidade fluorescente ao longo do tempo em cada condição experimental. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 30 minutos a uma hora, dependendo do número de condições experimentais.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente e levar o seu tempo ao alinhar os organoides intestinais humanos com o microcapilar antes da microinjeção. Após este procedimento, outros métodos como PCR, western blot e busca de RNA podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a resposta do organoide intestinal humano ao material injetado. O desenvolvimento dessa técnica nos permitiu examinar os efeitos de toxinas bacterianas, agentes farmacológicos, citocinas e até microrganismos vivos na função da barreira epitelial em organoides intestinais humanos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar dextrano marcado com fluorescência e outros materiais experimentais no lúmen de um organoide intestinal humano. Não se esqueça de que, ao trabalhar com toxinas bacterianas ou organismos vivos, pode ser extremamente perigoso e, portanto, precauções como o uso de EPI adequado devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. E, por último, tenha um cuidado especial para evitar perfurações, pois os microcapilares são extremamente afiados.