Name: Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a medir a permeabilidade da barreira epitelial em organoides intestinais humanos em tempo real usando microinjeção de FITC-dextran e microscopia de células vivas. Este método permite visualizar e quantificar alterações induzidas por tratamentos farmacológicos.

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Os autores gostaria de agradecer os Drs Stephanie Spohn e Basileia Abuaita para muitas discussões úteis na microinjeção de organoides. JRS é suportado pelo Intestinal células estaminais Consortium (U01DK103141), um projeto colaborativo de pesquisa financiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças do rim (NIDDK) e o Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID). JRS e VBY são suportados pelo romance NIAID, sistemas de modelo alternativo para o consórcio de doenças entéricas (NAMSED) (U19AI116482). DRH tem suporte a mecanismos de patogénese microbiana formação concessão do Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID, T32AI007528) e o prêmio de ciência translacional e clínica ao Instituto Michigan para clínica e saúde Pesquisa (UL1TR000433).
Os arquivos de dados completos e o código de análise de dados usado neste manuscrito estão disponíveis em https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

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Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Este protocolo estabelece um método de uso geral para a microinjeção de HIOs hPSC-derivados e derivados de tecido intestinal organoids e a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real. Também demonstrámos a nossa abordagem para análise e interpretação dos dados gerados usando estes métodos. Dada a crescente adoção do organoids intestinal sistemas modelo16,20,21,28 e o interesse de longa data na permeabilidade da barreira intestinal como um fisiologicamente relevantes funcional resultado3,4,5,6, prevemos que outras pessoas que trabalham neste campo será capazes de aplicar e construir sobre esses métodos.
Há várias etapas que são essenciais para a aplicação desta técnica. Acesso ao hPSC de alta qualidade - ou tecido derivada HIO de tecido deve ser estabelecido antes da experimentação extensiva com microinjeção. HIO macrostructure pode ser heterogêneo, com variação no tamanho e na forma, embora a identidade de tecido e a morfologia celular é altamente reprodutível quando utilizando a metodologia estabelecida para gerar HIOs24. HIOs esféricas, consistindo de um único lúmen semi-transparente e medindo aproximadamente 1 mm de diâmetro são ideais para microinjeção e medição de fluorescência luminal em tempo real. Em alguns casos, microinjeção irá falhar, resultando em colapso do HIO ou óbvio vazamento de material injetado. HIOs falhadas podem ser removidos da cultura bem a critério do usuário usando uma micropipeta padrão. Considere as lentes objetivas disponíveis em uma plataforma de imagem ao selecionar HIOs para microinjeção e imagem. Em geral, 2-4 X objectivas são ideais para capturar o sinal fluorescente completo do HIO, embora um objetivo X 10 pode ser utilizado se as lentes de baixa potência não estiverem disponíveis ou se o HIOs disponíveis são &#60; 1 mm de diâmetro. Software de imagem deve permitir a captura automatizada de imagens fluorescentes em pontos definidos ao longo do tempo.
Diversas modificações do presente protocolo são possíveis a fim de atender às necessidades de experimentais. Por exemplo, os resultados dos testes de função de barreira podem ser dependentes do tamanho molecular dos compostos em uso43 e pode ser apropriado testar preparações de dextrano de variação de peso molecular. Além disso, pode efectuar-se a imagem brightfield além de imagens de fluorescência como um indicador da integridade estrutural global do tecido25. Ao executar a microinjeção de bactérias vivas25,28,31,32,33,44, pode ser necessário adicionar penicilina e estreptomicina ou gentamicina para os meios de cultura HIO antes ou depois da microinjeção. Fora da conta vai ser contaminada durante o enchimento com a suspensão da cultura bacteriana e isto poderá ser transferido para a mídia HIO. Alternadamente, microinjeção pode ser executada em HIOs suspendidos na matriz extracelular (por exemplo, Matrigel) sem mídia, adicionando a mídia após a conclusão da microinjeção. Isto pode limitar a contaminação para a matriz extracelular e a face externa do HIO. Ao planejar a ensaios de crescimento microbiano, pode ser necessário remover os antibióticos na mídia após 1-2 h para evitar, retardar ou impedir o crescimento de organismos microinjected.
Finalmente, reconhecendo que nem todos os pesquisadores terão acesso a equipamentos de microscopia, adequado para a imagem latente em vitro , é importante salientar que os procedimentos descritos no presente protocolo para coleta de dados de fluorescência podem ser aplicados a imagens tomadas em momentos fixos usando microscopia epifluorescente padrão sem captura automatizada de imagem ou controles ambientais. Exemplos desta abordagem podem ser encontrados nos relatórios por Leslie e Huang et al . 25, que examinaram a atividade de toxina de c. difficile no hPSC-derivado organoids intestinal e Karve e Pradan et al 44, que examinaram a permeabilidade da barreira epitelial em semelhante organoids intestinal hPSC-derivado, injetadas ao vivo e. coli. Operação manual do equipamento de imagem pode resultar em maior variação e dificuldade na normalização do sinal fluorescente. Quando executar imagem manual do FITC-dextran injetado HIOs é essencial para manter a ampliação fixa, intensidade de excitação fluorescente e tempos de exposição em todo o experimento para evitar distorcer as medições de intensidade fluorescente.

O epitélio intestinal forma uma barreira seletiva que medeia o direcional transporte de nutrientes, H2O, íons e resíduos de produtos, minimizando inespecífica troca mediada por difusão de outras partículas entre o lúmen e o mesenquimais tecido ou sangue fornecimento1,2. A permeabilidade inespecífica da barreira epitelial intestinal tem sido considerada um parâmetro chave funcional na saúde e na doença,3,4,5,6, que reflete a taxa de difusão de pequenas moléculas através do epitélio através do espaço paracellular. Medição da permeabilidade da barreira epitelial pode efectuar-se em animal modelos7 e em pacientes humanos8 através da ingestão de lactulose, que não tem nenhum transportador específico no tracto gastrointestinal e a coleção subsequente e a medição das concentrações de lactulose no sangue periférico. Marcadores ingeridos alternativos da função de barreira, tais como hidratos de carbono fluorescente etiquetadas também estão disponíveis9,10. Esta abordagem foi adaptada para a célula epitelial intestinal culturas cultivadas em Transwell suporta11, uma abordagem simplificada que permite maior controle experimental, mas também tem sido criticada como um preditor pobre da vivo em permeabilidade devido à ausência de subtipos epiteliais diferenciados e estrutura de tecido12. Utilizando câmaras representam ainda uma outra abordagem e permitir a medição da função de barreira epitelial na mucosa intestinal todo ex vivo13. Aplicação desta técnica é frequentemente limitada pelo tecido disponibilidade e condição13,14. Assim, novos métodos que equilibrem a reprodutibilidade e a taxa de transferência com relevância fisiológica são necessários.
Desenvolvimentos recentes na organogênese em vitro conduziram à adopção de sistemas de cultura de tecido 3D modelo como uma plataforma sofisticada para recapitulando a dinâmica de tecidos complexos15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Em particular, células-tronco (hPSC) derivada de pluripotentes humanas organoids intestinal humana (HIOs)19,24 surgiram como um sistema reprodutível e experimentalmente tractable modelo para o estudo das interações hospedeiro-microbiana e barreira epitelial dinâmica25,26,,27,28. Da mesma forma, organoids de derivado de tecido humano (também conhecido como enteroids) pode ser derivado de um procedimento de biópsia simples e pode ser usado como um sistema tractable para estudar a fisiologia humana e doença15,29,30. Microinjeção de organoids intestinal humano permite a entrega de compostos experimentais25 ou vive micróbios25,31,32,33 para a apical epiteliais superfície do lúmen de organoides. Leslie e Huang et al . 25 recentemente adaptado a esta técnica para medir a permeabilidade de barreira em HIOs injetadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) rotulado dextrano após a exposição a toxinas bacterianas.
Este protocolo destina-se como um guia para a medição da permeabilidade da barreira epitelial em HIOs hPSC-derivados e derivados de tecido HIOs usando microscopia fluorescente. Com pequenas modificações, ele também pode servir como um primer geral na microinjeção de HIOs com compostos experimentais. Os usuários podem complementar este protocolo com aplicações a jusante adicionais ou alternativos após microinjeção.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M estéril (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Solução de matriz celular (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem de células vivas Deltavision RT</td><td>GE Life</td><td>Sciences 29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Câmera</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Incluído com o sistema Deltavision</td></tr><tr><td>software de imagem softWoRx</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Incluído com o sistema Deltavision</td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 suplemento (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamina (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>Componente do meio ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Holder</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternativa ao suporte de pipeta Xenoworks</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Escopo recomendado, embora outros modelos sejam provavelmente compatíveis</td></tr><tr><td>Olympus IX71 Microscópio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Incluído com o sistema</td></tr><tr><td>Deltavision CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td>29065728</td><td>Incluído com o sistema Deltavision</td></tr><tr><td>Recombinante C. difficile Toxina A/TcdA Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>Componente do meio ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Componente do meio ENR; ver McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextrano (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Lâminas de câmara</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos de vidro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para micropipeta</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Dispositivo preferido</td></tr><tr><td>Kit de tubulação analógica</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 pol ponteira transparente</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>O-ring 1-1,2 mm</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no organoids intestinal humana

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Avanços na cultura 3D dos tecidos intestinais, obtidos através de biópsia ou gerados a partir de células-tronco pluripotentes através de diferenciação direcionada, resultaram em modelos sofisticados em vitro da mucosa intestinal. Aproveitar estes sistemas emergentes do modelo exigirá adaptação de ferramentas e técnicas desenvolvidas para animais e sistemas de cultura 2D. Aqui, descrevemos uma técnica para medir a permeabilidade da barreira epitelial no organoids intestinal humana em tempo real. Isso é realizado pela microinjeção de dextrano fluorescente-etiquetadas e imagem em um microscópio invertido equipado com filtros de epifluorescente. Medição em tempo real da permeabilidade de barreira no organoids intestinal facilita a geração de dados de alta resolução temporais, no tecido epitelial intestinal humano, embora esta técnica também pode ser aplicada a Commit fixo abordagens de imagem. Este protocolo é facilmente adaptável para a medição da permeabilidade de barreira epitelial após a exposição a agentes farmacológicos, produtos bacterianos ou toxinas ou microorganismos vivos. Com pequenas modificações, esse protocolo também pode servir como um primer geral na microinjeção de organoids intestinal e os usuários podem escolher completar esse protocolo com aplicações a jusante adicionais ou alternativas após microinjeção.

HIOs eram diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas e cultivadas em solução de matriz celular como anteriormente descrito19,24. Após 4 semanas de cultura, os HIOs tinham expandido suficientemente para permitir a microinjeção. HIOs foram injetadas com 4 kDa conjugado FITC dextrano suspenso em PBS ou PBS contendo toxina de Clostridium difficile TcdA. C. difficile é um micróbio patogénico oportunista gastrointestinal que apresenta toxicidade epitelial mediada por toxina em HIOs25. Como um controle positivo, EGTA foi adicionado para os meios de cultura HIO em um subconjunto de HIOs injetado com PBS e FITC-dextrano. EGTA é um quelante de cálcio que provoca rápida de polimerização do citoesqueleto de actina42. Fluorescência FITC foi monitorizada em tempo real em um microscópio de imagens ao vivo dentro de uma câmara de ambiente controlado e imagens foram capturadas em intervalos de 10 minutos.
Análise post-hoc de dados de imagem revelou diferenças substanciais na retenção de fluorescência FITC (Figura 5). HIOs injetados com PBS mantido quase todos do sinal fluorescente presente em t = 0, porém HIOs que também foram injetados com TcdA de tratados com EGTA exibiram um decréscimo substancial na intensidade fluorescente por microinjeção de 8 horas pós (Figura 5a). dados de imagens de foram quantificados para HIOs todos em todos os pontos de tempo gerar um conjunto de dados de alta resolução, que representa a mudança relativa em intensidade fluorescente ao longo do tempo em cada condição experimental (Figura 5B). Diferenças na permeabilidade epitelial avaliaram-se calcular o tempo médio de eliminação (t1/2 ) de FITC para cada grupo de tratamento (tabela 1), e comparando as diferenças em t t1/2 entre grupos usando o Student t-teste. Controle-Tratado HIOs reteve a maioria do sinal fluorescente de FITC por mais de 16 horas (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Tratamento com EGTA reduziu significativamente o tempo de eliminação FITC-dextrano relativo controle HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). Consistente com os resultados publicados anteriormente25, microinjeção de TcdA aumentou significativamente permeabilidade da barreira epitelial em relação ao tratamento controle (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Assim, tanto externo (EGTA) e microinjected (TcdA) compostos são capazes de induzir alterações significativas na permeabilidade da barreira epitelial em HIOs. Estes resultados sugerem que os efeitos de uma vasta gama de agentes farmacológicos, metabólitos, produtos bacterianos, citocinas, fatores de crescimento e outros compostos na função de barreira epitelial podem ser avaliados usando esta abordagem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tratamento</td>
			<td>Meia-vida (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Inferior a 95% CI (h)</td>
			<td>Superior a 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle</td>
			<td>17,11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: tempo de eliminação (t1/2) para FITC-dextran em HIOs tratados com EGTA ou TcdA. As unidades são pós-microinjeção de horas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figura 1: layout básico de uma microinjector e micromanipulador para microinjeção de HIO. Esta imagem mostra o complemento total de equipamentos utilizados para a realização de microinjeção de HIOs. Componentes-chave são rotulados e ordenação de informações pode ser encontrado na tabela de materiais. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figura 2: extrator de micropipeta. O cobre, aquecimento da bobina hc, braçadeira superior c1, braçadeira inferior (c2), braço extrator (pa), alavanca de seleção de calor (ht) são identificados pelas setas. A configuração correta para o HEAT 1 e puxe são indicadas no texto em vermelho. A inserção mostra um filamento de vidro corretamente montado pronto para o aquecimento. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figura 3: imagens representativas de um derivado de tecido HIO injetado com FITC-dextrano. Imagem do (A) demonstrando o posicionamento da conta de vidro apenas antes da inserção no HIO e microinjeção. (B) Brightfield imagem de um derivado de tecido humano intestinal organoids depois da microinjeção de FITC-dextrano. Note que o sinal de fluorescência é aparente mesmo sem o uso de um conjunto de filtro específico. Esta coloração auxilia precisão microinjeção. 3 ampliação X <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figura 4: viver o trabalho de imagem. (A) Screenshot ilustrando as etapas necessárias para definir os parâmetros de microscópio, encontrar os HIOs no slide e salvar a posição da fase para cada HIO ser fotografada. Configurações de pré-imagem (B) para capturar o canal FITC em intervalos regulares em cada uma das posições especificadas na exportação de pós-imagens r. (C) de dados em formato DV arquivos como imagens TIFF com uma imagem TIFF por HIO por ponto de tempo.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figura 5: resultados representativos. (A)-células tronco derivadas organoids intestinal humana (HIO) injetadas com FITC-dextrano de 2 mg/mL (4 kDa) fotografada por 20 horas. HIOs também foram injetadas com PBS (controle) ou toxina Clostridium difficile TcdA (12,8 ng / µ l) ou tratados com 2mm EGTA adicionado à cultura mídia externa. Ampliação de 4x. (B) parcela de média intensidade FITC normalizada ao longo do tempo em HIOs tratados com PBS (controle), TcdA ou EGTA. Barras de erro representam no MEV mostrou e n = 11 HIOs (controle), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a permeabilidade da barreira epitelial em organoides intestinais humanos ao longo do tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da gastroenterologia, como como toxinas específicas, produtos bacterianos ou mesmo tratamentos farmacológicos podem alterar a permeabilidade da barreira epitelial. A principal vantagem desta técnica é que ela permite tanto a visualização quanto a medição quantitativa da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real e usando tecido epitelial intestinal humano.Antes da microinjeção de organoides intestinais humanos, o microinjetor deve ser configurado e o microcapilar preparado, instalado e testado conforme descrito no protocolo de texto. Para preencher o microcapilar com o material de injeção, mergulhe a ponta do microcapilar de vidro na suspensão de injeção de FITC-dextrano, tomando cuidado para evitar quebrar a ponta do microcapilar contra a lateral ou o fundo do tubo. Puxe a seringa de óleo mineral para puxar aproximadamente 10 microlitros da suspensão FITC-dextrana para o microcapilar.Quando a suspensão de microinjeção preencher 90% do comprimento do microcapilar de vidro, pare de encher o microcapilar. Pressione ligeiramente a seringa antes de retirar o microcapilar da solução de microinjeção para garantir que a ponta do microcapilar não contenha bolsas de ar. Remova a placa de cultura organoide intestinal humana da incubadora de cultura de células e transfira para o gabinete de biossegurança com o microinjetor.Remova a tampa da placa de cultura e centralize o primeiro poço no microscópio stage para que fique claramente visível através da ocular do osciloscópio na configuração de ampliação mais baixa. Gire o braço do micromanipulador de forma que o microcapilar seja apontado para baixo no poço de cultura em um ângulo maior que 45 graus em relação ao microscópio stage. Posicione bem a ponta do microcapilar acima da primeira cultura, aproximadamente um centímetro acima da superfície do meio.Verifique se a ponta do filamento de vidro e o organoide intestinal humano são visíveis através da ocular. A chave para uma microinjeção bem-sucedida é alinhar cuidadosamente o microcapilar com o organoide antes de tentar a microinjeção. E eu sempre recomendo que novos usuários pratiquem com tecido sobressalente antes de tentarem um experimento crítico.Girando o botão de controle do eixo z no sentido horário, avance o microcapilar lentamente. Perfure o organoide intestinal humano com a ponta microcapilar. A superfície externa do organoide intestinal humano se deprime ligeiramente quando o microcapilar começa a aplicar pressão e volta à forma quando a ponta penetra no lúmen.Se houver dificuldade em ver a ponta do microcapilar dentro do lúmen, ajuste as configurações de iluminação ou ampliação do microscópio de dissecação. Quando o microcapilar estiver posicionado corretamente com a ponta do microcapilar perto do centro do organoide intestinal humano, remova as mãos dos controles do micromanipulador. Pressione ligeiramente a seringa cheia de óleo mineral para empurrar a solução de microinjeção para fora do microcapilar e para o lúmen organoide intestinal humano.O organoide intestinal humano pode se expandir ligeiramente para acomodar o volume da injeção. Com o microcapilar posicionado acima do meio para evitar danos acidentais aos organoides intestinais humanos durante a manobra, passe para o próximo alvo do organoide intestinal humano. Entre os tratamentos ou em caso de quebra, altere o microcapilar.Afrouxe o clamp na extremidade do braço do micromanipulador e remova o microcapilar do suporte da micropipeta. Para testar compostos entregues ao epitélio apical, o composto deve ser ressuspenso em PBS estéril contendo dois miligramas por mililitro de FITC-dextrano. Neste experimento representativo, ressuspenda a toxina TcdA de Clostridium difficile, adicione 12,8 nanogramas por microlitro em PBS contendo FITC-dextrano antes da microinjeção.Microinjete o composto no lúmen organoide intestinal humano, conforme demonstrado na seção anterior. Para testar os compostos entregues ao compartimento lateral basal, após microinjeção de FITC-dextrano, substitua o meio de cultura externo por um novo meio contendo dois EGTA milimolares como controle positivo, veículo PBS sozinho como controle negativo ou outro composto experimental. Comece a imagem ao vivo imediatamente após a microinjeção.Esta imagem representativa de campo brilhante mostra um organoide intestinal humano derivado de tecido após microinjeção de FITC-dextrana. O sinal fluorescente é aparente mesmo sem o uso de um conjunto de filtros específico. Organoides intestinais humanos derivados de células-tronco foram microinjetados com dextrano conjugado com FITC de quatro kilodalton suspenso em PBS, ou PBS contendo toxina Clostridium difficile TcdA.Como controle positivo, o EGTA foi adicionado ao meio de cultura de organoides intestinais humanos em um subconjunto de organoides intestinais humanos injetados com PBS e FITC-dextrano. Os organoides intestinais humanos foram fotografados por 20 horas. Conforme ilustrado por essas imagens, os organoides intestinais humanos injetados com PBS retiveram quase todo o sinal fluorescente presente em T zero.No entanto, os organoides intestinais humanos que também foram injetados com TcdA, ou tratados com EGTA, exibiram uma diminuição substancial na intensidade fluorescente em oito horas após a microinjeção. Os dados de imagem foram quantificados para todos os organoides intestinais humanos em todos os pontos de tempo para gerar um conjunto de dados de alta resolução representando a mudança relativa na intensidade fluorescente ao longo do tempo em cada condição experimental. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 30 minutos a uma hora, dependendo do número de condições experimentais.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente e levar o seu tempo ao alinhar os organoides intestinais humanos com o microcapilar antes da microinjeção. Após este procedimento, outros métodos como PCR, western blot e busca de RNA podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a resposta do organoide intestinal humano ao material injetado. O desenvolvimento dessa técnica nos permitiu examinar os efeitos de toxinas bacterianas, agentes farmacológicos, citocinas e até microrganismos vivos na função da barreira epitelial em organoides intestinais humanos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microinjetar dextrano marcado com fluorescência e outros materiais experimentais no lúmen de um organoide intestinal humano. Não se esqueça de que, ao trabalhar com toxinas bacterianas ou organismos vivos, pode ser extremamente perigoso e, portanto, precauções como o uso de EPI adequado devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. E, por último, tenha um cuidado especial para evitar perfurações, pois os microcapilares são extremamente afiados.

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Este protocolo detalha o estabelecimento de enteróides, um modelo intestinal tridimensional, a partir do tecido intestinal fetal. Imagens imunofluorescentes de biomarcadores epiteliais foram utilizadas para caracterização do modelo. A exposição apical de lipopolissacarídeos, uma endotoxina bacteriana, utilizando a técnica de microinjeção induziu a permeabilidade epitelial de forma dose-dependente medida pelo vazamento de dextrano fluorescente.

Testando a permeabilidade epitelial em enteroides derivados de tecido fetal

O presente protocolo descreve um método que utiliza o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out para determinar a permeabilidade intestinal. Este método pode ser usado para determinar a permeabilidade paracelular em enteróides que modelam doenças inflamatórias intestinais, como enterocolite necrosante.

Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Este estudo apresenta um protocolo para geração de monocamadas 2D intestinais bovinas a partir de organoides, oferecendo melhor acesso para o estudo das interações patógeno-hospedeiro. Inclui métodos para avaliar a integridade e funcionalidade da membrana, avançando modelos in vitro que imitam a fisiologia gastrointestinal do gado. Essa abordagem promete benefícios biomédicos e agrícolas significativos, incluindo estratégias de tratamento aprimoradas.

Avanços na tecnologia de organoides bovinos usando interfaces de monocamada de intestino delgado e grosso

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

O protocolo apresentado no presente estudo descreve métodos para a monitorização em tempo real da progressão reprogramação através da medição da cinética de marcadores de células estaminais pluripotentes positivos e negativos utilizando análise de citometria de fluxo. O protocolo também inclui a avaliação baseada em imagens da morfologia, e marcador ou expressão repórter durante a geração da IPSC.

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Aprenda a medir a permeabilidade da barreira epitelial em organoides intestinais humanos em tempo real usando microinjeção de FITC-dextran e microscopia de células vivas. Este método permite visualizar e quantificar alterações induzidas por tratamentos farmacológicos.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

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