Name: Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda análise clonal de precursores de células-tronco hematopoiéticas em embriões murinos usando classificação de índice de célula única combinada com co-cultura de células endoteliais de nicho. Este método permite identificar propriedades fenotípicas e potencial de enxerto.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer a Andrew Berger, Stacey Dozono e Brian Raden no Fred Hutchinson Flow Cytometry núcleo para assistência com FACS. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde NHLBI UO1 concessão #HL100395, colaborativo auxiliares Grant #HL099997 e NIDDK concedem #RC2DK114777. Brandon Hadland é suportado pelo de o Alex Lemonade Stand Foundation e Hyundai Hope na Fundação de rodas.

<ol><li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells%2Flong-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent%2C+IL-3-independent+CD43%28-%29+embryonic+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li>
<li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li>
<li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li>
<li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis%3A+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).</li>
<li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf%CE%B2+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li>
<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
<li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li>
<li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis%3A+emergence+of+erythroid%2C+megakaryocyte%2C+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O estudo da gênese HSC durante o desenvolvimento embrionário necessita de meios para detectar potencial precursores de hemogenic ainda falta a competência para fornecer a longo prazo multilineage reconstituição hematopoiética em transplantados adultos destinatários de HSC. Neste protocolo, apresentamos um ensaio clonal de precursores hemogenic embrionárias pela cultura co do estroma em nicho vascular ECs de AGM, que suporta a maturação dos precursores de HSC, com posterior análise funcional em ensaios de transplante. Inc...

Clonais estudos revelaram heterogeneidade nas propriedades de enxertia de longo prazo de linfócitos adultos, fornecendo a introspecção nova de subtipos HSC e mudanças no comportamento HSC durante envelhecimento1. Entretanto, estudos semelhantes de linfócitos embrionários e seus precursores foram mais desafiadora. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, linfócitos surgem de uma população de precursores, conhecida como endotélio hemogenic em um processo transitório referido como o endotelial de transição hematopoiéticas2. O primeiro HSC, definido por sua capacidade de fornecer enxertia multilineage robusta, a longo prazo, seguindo o transplante no condicionado destinatários adultos, não são detectados até depois de dia embrionário 10.5 (E10.5) o embrião murino, com muito pouca frequência3 . Durante seu desenvolvimento, precursores da HSC (pre-HSC) decorrentes de endotélio hemogenic devem ser submetidas a maturação antes de adquirir as propriedades de HSC adulto que permitem uma eficiente enxertia em transplante ensaios4,5 , 6. obscurecendo o estudo da origem HSC rara, uma infinidade de progenitores hematopoiéticos com eritroide, mieloide e linfoide potencial já são detectados antes do surgimento de HSC de pre-HSC7,8. Assim, distinguir pre-HSC de outros progenitores hematopoiéticos exige métodos para isolar uma relação clonal células e fornecê-los com os sinais suficientes para sua maturação de HSC, para detectar suas propriedades de enxertia em ensaios de transplante.
Uma série de abordagens têm sido descrita que permitem a detecção de pre-HSC pela maturação ex vivo ou no vivo de HSC. Ex vivo métodos têm dependia da cultura de tecidos embrionários, como a região AGM, onde o primeiro HSC são detectadas no desenvolvimento9. Construindo sobre esses métodos, protocolos que incorporam a dissociação, a classificação e re-agregação dos tecidos AGM permitiram a caracterização das populações classificadas contendo precursores HSC durante o desenvolvimento de E9.5 para E11.5 no Pará-aórtica splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiões4,5,10; no entanto, essas abordagens não são passíveis de análise do elevado-throughput de precursores no nível da célula única necessária para análise clonal. Da mesma forma, na vivo maturação por transplante em ratos recém-nascidos, onde o microambiente presume-se ser mais adequado para o apoio das fases anteriores de precursores HSC, permitiu também estudos de populações classificadas do saco vitelino e AGM / P-Sp (P-Sp é a região de precursor para o AGM) com características de pre-HSC, mas estes métodos também não proporcionar uma plataforma robusta para single cell análise11,12.
Estudos de Rafii et al demonstraram que estroma de células endoteliais Akt-ativado (CE) pode fornecer um substrato de nicho para o apoio do adulto HSC auto-renovação em vitro13,14,15. Recentemente determinamos que CE Akt-ativado derivado da região AGM (AGM-CE) fornece um nicho adequado em vitro para a maturação dos precursores hemogenic, isolado, tão cedo quanto E9 em desenvolvimento, para adulto-engrafting HSC, bem como a posterior autorenovação da gerado HSC16. Dado que este sistema emprega uma simples cultura de co 2-dimensional, é facilmente adaptável para clonal análise do potencial HSC de precursores hemogenic individualmente isolados.
Temos recentemente relatado uma abordagem a ensaiar o potencial HSC de precursores hemogenic clonal, combinando a classificação de índice de precursores hemogenic individuais de murino embriões com co-cultura AGM-CE e posterior análise funcional em transplante ensaios de17. Classificação de índice é um modo de fluorescência-ativado celular classificação (FACS) que registra (índices) todos os parâmetros fenotípicos (isto é, dispersão direta (FSC-A), lado dispersão (SSC-A), fluorescência parâmetros) de cada célula individualmente classificado que estes características podem ser retrospectivamente correlacionadas para posterior análise funcional após a classificação. FACS software grava ambas as informações fenotípicas para cada célula e posição/poço da placa de 96 poços, na qual ele foi colocado. Esta técnica anteriormente foi elegantemente usada para identificar a heterogeneidade na HSC adulto, determinar parâmetros fenotípicos que mais enriquecem para o subconjunto engrafting a longo prazo do HSC e correlacionam parâmetros fenotípicos de HSC com transcricional Propriedades para o single de pilha nível18,19. Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada desta abordagem que permite a identificação de parâmetros fenotípicos únicos e contribuições de linhagem de pre-HSC durante as fases iniciais de desenvolvimento embrionário.

<table><tbody><tr><td>AGM-EC meios de cultura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiais para cultura de células endoteliais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>Use para dissociar monocamadas AGM-EC</td></tr><tr><td>Gelatina 0,1% em água</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>Use para aderir monocamadas AGM-EC ao plástico</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Uso para co-cultura de monocamadas AGM-EC e clones classificados por índice</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Uso para dissecção e coloração FACS Frascos</td></tr><tr><td>de filtro de 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>Uso para filtro estéril Meios endoteliais</td></tr><tr><td><forte>AGM-EC meios de cultura (500 mls)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM)</td> <td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 mls</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Soro</td><td>Bovino Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg dissolvido em 10 mls de meio</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Endotelial Mitogen (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>Adicione 10 mls de mídia para dissolver e adicione</td></tr><tr><td>Materiais para classificação de índice AGM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase (0.25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>Uso para dissociação de tecidos embrionários</td></tr><tr><td>Seringa de 3ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>Use para filtrar soluções de anticorpos estéreis para FACS</td></tr><tr><td>0,22 e micro; Filtro acionado por seringa</td><td>M Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Use para filtrar estéril soluções de anticorpos para FACS</td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de 5 ml com tampa de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Use para remover aglomerados de células antes do FACS</td></tr><tr><td>DAPI (preparado como estoque de 1 mg/ml em H2O)</td><td>Millipore</td><td>268298</td><td>Use para excluir células mortas do tipo</td></tr><tr><td>anti-camundongo CD16/CD32 (bloco FcR)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Use para bloquear a coloração não específica para receptores Fc</td></tr><tr><td>Anticorpos para classificação de índice AGM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>de rato IgG1 kappa Controle de isotipo, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>Controle de isotipo para CD144 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2b kappa, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>Controle de isotipo para CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>de rato IgG1 kappa Controle de isotipo, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>Controle de isotipo para CD41 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2b kappa, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>Controle de isotipo para CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM-meio livre de soro (10mls)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 mls</td></tr><tr><td>de fator de células-tronco murinas recombinantes (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>ligante FLT3 humano recombinante (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>trombopoetina humana recombinante (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 20 ng/ml</td></tr><tr><td>interleucina-3 murina recombinante (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 20 ng/ml</td></tr><tr><td>Materiais para coloração de células co-cultivadas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 placa de poço, fundo em V</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Uso para análise FACS</td></tr><tr><td>Anticorpos para análise de clones classificados por índice co-cultivados com células endoteliais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2b kappa, PE-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>Controle de isotipo para CD45 PerCP-Cyanine5.5</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2b kappa, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>Controle de isotipo para CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2a kappa, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Controle de isotipo para Ly-6A / E APC</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4 / 80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2a kappa, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>Controle de isotipo para F4 / 80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G / C (Gr1) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>de rato IgG2b kappa Controle de isotipo, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Controle de isotipo para Ly-6G/C e CD3 FITC</td></tr><tr><td>Materiais para injeção de veia caudal para transplante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml seringas de insulina com agulhas 29G 1/2"</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>Uso para injeção de veia caudal para transplante</td></tr><tr><td>Anticorpos para análise de sangue periférico após translant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Controle de isotipo para Ly-6G/C PerCP</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Coloração</td></tr><tr><td>Controle de isotipo de rato IgG2a kappa, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>Controle de isotipo para F4 / 80 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>coloração</td></tr><tr><td>anti-camundongo CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>coloração</td></tr><tr><td>de rato IgG2a kappa Controle de isotipo, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>Controle de isotipo para CD19 APC</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-cianina7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2a kappa, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>Controle de isotipo para CD45.1 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>Controle de</td></tr><tr><td>isotipo de rato IgG2a kappa, APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>Controle de isotipo para CD45.2 APC-eFluor780</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>BD <tr><td>FACSAria II com software DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II com leitor de placas</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>Para software</td></tr><tr><td>de análise FACS</td> de células dispensadoras <td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

A capacidade de estudar a gênese de células-tronco hematopoiéticas (HSC) durante o desenvolvimento embrionário tem sido limitada pela raridade dos precursores HSC no embrião precoce e a falta de ensaios que funcionalmente, identificar o potencial a longo prazo de multilineage enxertia de precursores HSC putativos individuais. Aqui, descrevemos a metodologia que permite o isolamento e caracterização de precursores HSC funcionalmente validados a nível de célula única. Primeiro, nós utilizamos índice classificação para catalogar o parâmetro fenotípico preciso de cada célula individualmente classificado, usando uma combinação de marcadores fenotípicos para enriquecer para os precursores HSC com marcadores adicionais para análise experimental. Em segundo lugar, cada célula de índice-classificados é co cultivada com estroma vascular nicho da região de aorta-gônada-mesonephros (AGM), que suporta a maturação dos precursores HSC não-engrafting de HSC funcional com enxertia de multilineage, a longo prazo potencial em ensaios de transplante. Esta metodologia permite a correlação de propriedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal com seu potencial de enxertia funcional ou outras propriedades, como o perfil transcricional, proporcionando um meio para a análise detalhada do precursor do HSC desenvolvimento a nível de célula única.

A figura 1A mostra um esquema do projeto experimental. Uma vez que tecidos P-Sp/AGM são dissecados, pool e dissociados em colagenase, eles estão manchados com anticorpos para VE caderina e EPCR para classificação de índice. Pré-HSC são enriquecidos em células classificadas em VE-caderina+EPCRalta (figura 1B). Outros anticorpos conjugados a fluorocromo podem ser incluídos para analisar retrospectivamente parâ...

Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

O objetivo geral deste método é identificar as propriedades fenotípicas e o potencial de enxerto de células-tronco hematopoiéticas clonais ou precursores de HSC durante o desenvolvimento embrionário murino. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hematopoiese do desenvolvimento sobre as contribuições únicas da linhagem de precursores clonais de HSC durante o desenvolvimento embrionário. A principal vantagem dessa técnica é que os precursores hemogênicos são analisados em nível de célula única.Isso permite a identificação das propriedades fenotípicas únicas que distinguem precursores raros de HSC. Comece adicionando Aorta-Gônada-Meonefros, AGM, tecidos dissecados de embriões entre 9,5 e 11,5 dias após o coito a um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de PBS suplementado com 10% de FBS em gelo. Quando os tecidos se assentarem no fundo do tubo, aspire o sobrenadante e adicione imediatamente um mililitro de colagenase a 0,25% às amostras.Após 25 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius, interrompa a reação com um mililitro de PBS mais FBS e use uma ponta de pipeta de um mililitro para triturar os tecidos 20 a 30 vezes até obter uma suspensão de célula única. Em seguida, dilua as células com mais oito mililitros de PBS mais FBS e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de bloqueio por cinco minutos no gelo.Em seguida, adicione 500 microlitros do coquetel de anticorpos de interesse. Após uma incubação de 15 a 20 minutos no gelo, lave as células em oito mililitros de PBS mais FBS e ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS fresco mais FBS. Filtre as células através de um filtro de células de 35 micrômetros em um tubo de cinco mililitros, lavando o filtro com mais três mililitros de PBS mais FBS para coletar todas as células e centrifugar as células novamente.Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS mais FBS e coloque as células no gelo. Para definir os portões para classificação no modo de classificação de célula única e índice, carregue uma pequena alíquota de células no citômetro de fluxo e ajuste a aquisição para a taxa de fluxo mais baixa. Abra um gráfico de área de dispersão direta versus área de dispersão lateral e defina uma porta para incluir células de tamanhos variados.Abra um gráfico de área de dispersão direta versus largura de dispersão frontal e uma área de dispersão lateral versus gráfico de largura de dispersão lateral e defina uma porta em cada gráfico para excluir os dublês. Defina uma área de dispersão direta versus gráfico DAPI para bloquear as células vivas. Em seguida, crie um gráfico de caderina endotelial antivascular versus receptor de proteína C antiendotelial e bloqueie as células que expressam o receptor de caderina endotelial vascular positivo e de alto receptor de proteína C endotelial.Para classificar as células aorta-gônada-mesonefros, coloque uma placa de 96 poços pré-cultivada com células endoteliais AGM em meio livre de soro AGM mais citocinas no bloco de placas do citômetro de fluxo e carregue a amostra experimental. Inicie a aquisição da amostra e confirme se o modo de célula única de classificação de índice está selecionado para classificar uma única célula em cada poço da placa de 96 poços. Quando uma célula tiver sido classificada em cada poço da placa, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos ajustada para 37 graus Celsius e 5% de CO2 por até sete dias.No final do período de co-cultura, colônias hematopoiéticas de vários tamanhos e morfologias podem ser visualizadas usando um microscópio invertido com uma ampliação de 100X. Para analisar os clones por citometria de fluxo, use uma pipeta multicanal para dissociar as células hematopoiéticas das camadas endoteliais sem desprender as células endoteliais. Em seguida, transfira 100 microlitros de células para poços individuais de uma nova placa de fundo em V de 96 poços e retorne a placa original de 96 poços contendo os 100 microlitros restantes de células para a incubadora de cultura de tecidos.Pulverizar as células na placa de fundo em V por centrifugação e remover o sobrenadante invertendo e sacudindo a placa num único movimento rápido. Ressuspenda os pellets em cada poço com 50 microlitros de tampão de bloqueio a quatro graus Celsius. Após cinco minutos, adicione o coquetel de anticorpos de interesse a cada poço para uma incubação de 20 minutos a quatro graus Celsius.No final da incubação, lave cada poço com 200 microlitros de PBS mais FBS, sacudindo a placa no final da centrifugação para descartar o sobrenadante. Ressuspenda os pellets em 50 microlitros de PBS mais FBS e analise as células de acordo com os protocolos padrão de análise de fluxo para rastrear colônias que contenham potencial de células-tronco hematopoiéticas. Selecionando os poços que contêm células com fenótipo de células-tronco hematopoiéticas por análise de fluxo, use uma pipeta multicanal para ressuspender os 100 microlitros restantes de células da co-cultura original e adicione cinco vezes 10 às células da medula óssea de resgate em 100 microlitros de PBS mais 2% FBS para cada poço.Após a transferência adoptiva de cada clone para animais receptores congénitos letalmente irradiados, recolher amostras de sangue periférico dos animais enxertados a intervalos regulares após o transplante. Para identificar os clones com enxerto de longo prazo, analise as amostras por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão de análise de fluxo. As propriedades fenotípicas de cada clone podem então ser correlacionadas com suas propriedades de enxerto.As células-tronco pré-hematopoiéticas podem ser enriquecidas pela positividade da caderina endotelial vascular e um alto nível de expressão do receptor da proteína C endotelial. A coloração com outros anticorpos conjugados com fluorocromo permite a análise retrospectiva de parâmetros fenotípicos adicionais que podem ser registrados para cada célula durante a classificação do índice. Após a classificação do índice em co-culturas de células endoteliais aorta-gônada-mesonefros, os clones individuais se integram à camada de células endoteliais aorta-gônada-mesonefros antes que os clones comecem a se arredondar e formar aglomerados hematopoiéticos.Após cinco a sete dias de co-cultura, colônias de vários tamanhos e morfologias podem ser detectadas. Aqui, quatro colônias diferentes obtidas após co-cultura são mostradas com três colônias demonstrando diferentes proporções de células-tronco hematopoiéticas fenotípicas junto com outros tipos de células mais diferenciadas e a quarta colônia sem células com expressão de marcadores de células-tronco hematopoiéticas. A transferência adotiva da progênie de células clones permite a avaliação da capacidade de enxerto de várias linhagens de longo prazo de cada clone após a contribuição do doador para os compartimentos de células B e T mieloides do sangue periférico do receptor ao longo do tempo.Embora a maioria das colônias contendo células com fenótipo de células-tronco hematopoiéticas tenha alcançado enxerto de longo prazo, o transplante é necessário para confirmar um enxerto funcional de várias linhagens, pois alguns clones perdem enxerto com o tempo. O potencial funcional das células-tronco hematopoiéticas de cada clone pode então ser correlacionado com os parâmetros de classificação do índice original desse clone para identificar suas características fenotípicas precisas. Após este procedimento, outros métodos, como a cultura secundária de progênie hematopoiética no estroma, apoiando o desenvolvimento de células B e T in vitro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os potenciais linfócitos de precursores hemogênicos individuais.

clonal-analysis-embryonic-hematopoietic-stem-cell-precursors-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este vídeo descreve o protocolo para isolar HSPCs da medula óssea e classificá-los usando uma técnica de classificação de células ativadas por fluorescência, que é um método para obter HSPCs individualmente classificados. Cultivamos essas células selecionadas para obter clones de HSPC.

Cultivo e colheita de clones HSPC: um método para obter os clones HSPC classificados individualmente

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Relatamos um método confiável para isolar e cultivar células endoteliais primárias específicas do tumor a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.

Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos

Aprenda análise clonal de precursores de células-tronco hematopoiéticas em embriões murinos usando classificação de índice de célula única combinada com co-cultura de células endoteliais de nicho. Este método permite identificar propriedades fenotípicas e potencial de enxerto.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura (Vídeo) | JoVE Journal

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Explorar mais vídeos