Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

O objetivo geral deste método é identificar as propriedades fenotípicas e o potencial de enxerto de células-tronco hematopoiéticas clonais ou precursores de HSC durante o desenvolvimento embrionário murino. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hematopoiese do desenvolvimento sobre as contribuições únicas da linhagem de precursores clonais de HSC durante o desenvolvimento embrionário. A principal vantagem dessa técnica é que os precursores hemogênicos são analisados em nível de célula única.

Isso permite a identificação das propriedades fenotípicas únicas que distinguem precursores raros de HSC. Comece adicionando Aorta-Gônada-Meonefros, AGM, tecidos dissecados de embriões entre 9,5 e 11,5 dias após o coito a um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de PBS suplementado com 10% de FBS em gelo. Quando os tecidos se assentarem no fundo do tubo, aspire o sobrenadante e adicione imediatamente um mililitro de colagenase a 0,25% às amostras.

Após 25 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius, interrompa a reação com um mililitro de PBS mais FBS e use uma ponta de pipeta de um mililitro para triturar os tecidos 20 a 30 vezes até obter uma suspensão de célula única. Em seguida, dilua as células com mais oito mililitros de PBS mais FBS e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de bloqueio por cinco minutos no gelo.

Em seguida, adicione 500 microlitros do coquetel de anticorpos de interesse. Após uma incubação de 15 a 20 minutos no gelo, lave as células em oito mililitros de PBS mais FBS e ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS fresco mais FBS. Filtre as células através de um filtro de células de 35 micrômetros em um tubo de cinco mililitros, lavando o filtro com mais três mililitros de PBS mais FBS para coletar todas as células e centrifugar as células novamente.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS mais FBS e coloque as células no gelo. Para definir os portões para classificação no modo de classificação de célula única e índice, carregue uma pequena alíquota de células no citômetro de fluxo e ajuste a aquisição para a taxa de fluxo mais baixa. Abra um gráfico de área de dispersão direta versus área de dispersão lateral e defina uma porta para incluir células de tamanhos variados.

Abra um gráfico de área de dispersão direta versus largura de dispersão frontal e uma área de dispersão lateral versus gráfico de largura de dispersão lateral e defina uma porta em cada gráfico para excluir os dublês. Defina uma área de dispersão direta versus gráfico DAPI para bloquear as células vivas. Em seguida, crie um gráfico de caderina endotelial antivascular versus receptor de proteína C antiendotelial e bloqueie as células que expressam o receptor de caderina endotelial vascular positivo e de alto receptor de proteína C endotelial.

Para classificar as células aorta-gônada-mesonefros, coloque uma placa de 96 poços pré-cultivada com células endoteliais AGM em meio livre de soro AGM mais citocinas no bloco de placas do citômetro de fluxo e carregue a amostra experimental. Inicie a aquisição da amostra e confirme se o modo de célula única de classificação de índice está selecionado para classificar uma única célula em cada poço da placa de 96 poços. Quando uma célula tiver sido classificada em cada poço da placa, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos ajustada para 37 graus Celsius e 5% de CO2 por até sete dias.

No final do período de co-cultura, colônias hematopoiéticas de vários tamanhos e morfologias podem ser visualizadas usando um microscópio invertido com uma ampliação de 100X. Para analisar os clones por citometria de fluxo, use uma pipeta multicanal para dissociar as células hematopoiéticas das camadas endoteliais sem desprender as células endoteliais. Em seguida, transfira 100 microlitros de células para poços individuais de uma nova placa de fundo em V de 96 poços e retorne a placa original de 96 poços contendo os 100 microlitros restantes de células para a incubadora de cultura de tecidos.

Pulverizar as células na placa de fundo em V por centrifugação e remover o sobrenadante invertendo e sacudindo a placa num único movimento rápido. Ressuspenda os pellets em cada poço com 50 microlitros de tampão de bloqueio a quatro graus Celsius. Após cinco minutos, adicione o coquetel de anticorpos de interesse a cada poço para uma incubação de 20 minutos a quatro graus Celsius.

No final da incubação, lave cada poço com 200 microlitros de PBS mais FBS, sacudindo a placa no final da centrifugação para descartar o sobrenadante. Ressuspenda os pellets em 50 microlitros de PBS mais FBS e analise as células de acordo com os protocolos padrão de análise de fluxo para rastrear colônias que contenham potencial de células-tronco hematopoiéticas. Selecionando os poços que contêm células com fenótipo de células-tronco hematopoiéticas por análise de fluxo, use uma pipeta multicanal para ressuspender os 100 microlitros restantes de células da co-cultura original e adicione cinco vezes 10 às células da medula óssea de resgate em 100 microlitros de PBS mais 2% FBS para cada poço.

Após a transferência adoptiva de cada clone para animais receptores congénitos letalmente irradiados, recolher amostras de sangue periférico dos animais enxertados a intervalos regulares após o transplante. Para identificar os clones com enxerto de longo prazo, analise as amostras por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão de análise de fluxo. As propriedades fenotípicas de cada clone podem então ser correlacionadas com suas propriedades de enxerto.

As células-tronco pré-hematopoiéticas podem ser enriquecidas pela positividade da caderina endotelial vascular e um alto nível de expressão do receptor da proteína C endotelial. A coloração com outros anticorpos conjugados com fluorocromo permite a análise retrospectiva de parâmetros fenotípicos adicionais que podem ser registrados para cada célula durante a classificação do índice. Após a classificação do índice em co-culturas de células endoteliais aorta-gônada-mesonefros, os clones individuais se integram à camada de células endoteliais aorta-gônada-mesonefros antes que os clones comecem a se arredondar e formar aglomerados hematopoiéticos.

Após cinco a sete dias de co-cultura, colônias de vários tamanhos e morfologias podem ser detectadas. Aqui, quatro colônias diferentes obtidas após co-cultura são mostradas com três colônias demonstrando diferentes proporções de células-tronco hematopoiéticas fenotípicas junto com outros tipos de células mais diferenciadas e a quarta colônia sem células com expressão de marcadores de células-tronco hematopoiéticas. A transferência adotiva da progênie de células clones permite a avaliação da capacidade de enxerto de várias linhagens de longo prazo de cada clone após a contribuição do doador para os compartimentos de células B e T mieloides do sangue periférico do receptor ao longo do tempo.

Embora a maioria das colônias contendo células com fenótipo de células-tronco hematopoiéticas tenha alcançado enxerto de longo prazo, o transplante é necessário para confirmar um enxerto funcional de várias linhagens, pois alguns clones perdem enxerto com o tempo. O potencial funcional das células-tronco hematopoiéticas de cada clone pode então ser correlacionado com os parâmetros de classificação do índice original desse clone para identificar suas características fenotípicas precisas. Após este procedimento, outros métodos, como a cultura secundária de progênie hematopoiética no estroma, apoiando o desenvolvimento de células B e T in vitro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os potenciais linfócitos de precursores hemogênicos individuais.