Name: Um método para o sequenciamento de alvo 16S das amostras de leite humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda um método semi-automatizado de sequenciamento 16S rRNA para amostras de leite humano de baixa biomassa. Esta técnica facilita pesquisas sobre o microbioma humano e suas implicações para saúde e doença.

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Gostaríamos de agradecer a Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, PhD para o desenvolvimento do protocolo. Suporte total para o internacional materna pediátrica adolescente AIDS clínicos ensaios grupo (IMPAACT) foi fornecido pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) do National Institutes of Health (NIH) sob os números do prêmio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), com o co-financiamento do Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) e o Instituto Nacional de Saúde Mental (NIMH). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH.

Para todas as etapas do protocolo, adequado equipamentos de proteção individual (EPI) devem ser usado, e abordagens de prevenção de contaminação rigorosas precisam ser tomadas. Observe o fluxo de trabalho de Pre-amplificação trabalhar áreas para áreas de trabalho pós-amplificação para minimizar a contaminação das amostras. Todas as fontes usadas são estéreis, livres de DNase, RNase, DNA e pirogênio. Todas as pontas de pipetas são filtradas. Um fluxograma das etapas do protocolo é fornecido (Figura 1).
1. amostra Lysis
Nota: Lise de amostra e extração de ácidos nucleicos são executadas usando um kit de extração de DNA/RNA em um ambiente de sala limpa, onde os controles de engenharia e processuais estão no lugar para minimizar a introdução de bactérias ambientais para as amostras.
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpar o gabinete de segurança biológica (BSC) área com limpador de superfície apropriado para eliminar qualquer contaminação de ácido nucleico de trabalho.</li>
		<li>Ligue o reaccional de temperatura controlada e, em seguida, configurá-lo para 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar o tampão de Lise guanidínio tiocianato (ver tabela de materiais)
	<ol>
<li>Verifique a Lise para precipitados. Re-dissolver precipitados por aquecimento a 37 ° C.</li>
		<li>Prepare-se para cada amostra de 600 µ l de tampão de Lise com 6 µ l β-mercaptoetanol (β-ME). Considere um volume extra de 20% por amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da amostra
	<ol>
<li>Se o leite integral é congelado, descongele no gelo. Alíquota 5ml de todo o leite em um 15 mL ou em um tubo estéril 5 mL em BSC e mantê-lo no gelo.</li>
		<li>Gire o 5 mL leite alíquota para 10 min a 5.000 x g a 4 ° C para células de Pelotas.</li>
		<li>Remover a camada de gordura, agora a camada superior do tubo, com uma espátula de plástico ou grande furo a ponta da pipeta.</li>
		<li>Sem perturbar o sedimento, retire todo o sobrenadante com exceção de 100 µ l.</li>
		<li>Lave o pellet por resuspending em 1 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).</li>
		<li>Prepare 1 controlo negativo, adicionando 1 mL de PBS estéril para um tubo de 5 mL.</li>
		<li>Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 mL limpa e girar em um microcentrifuge para 1 min (5.000 x g à temperatura ambiente (RT)).</li>
		<li>Use uma ponta de pipeta estéril de filtrado de 1.000 µ l para descartar toda a camada sobrenadante/gordos.</li>
		<li>Se não extrair o mesmo dia, estala congelar a célula da pelota colocando-o em uma pasta de gelo seco-etanol e transferi-lo imediatamente ao congelador a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Interrupção de amostra e homogeneização (batimento de grânulo)
	<ol>
<li>Adicione 600 µ l de tampão de Lise contendo β-ME para a pelota e transferir a suspensão a um tubo do grânulo.</li>
		<li>Cada lote de extração de 12 contém 10 amostras, 1 controle negativo (preparado na etapa 3.7 acima) e 1 controle positivo (preparada na próxima etapa).<ol>
<li>Prepare 1 controle positivo com Lise e 20 µ l da amostra bacteriana simulada (Comunidade simulada usada tem uma concentração, uma vez extraída, de aproximadamente 0,2 ng / µ l de DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vórtice todos talão tubos vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Amostras de calor sobre a temperatura controlada reaccional a 37 ° C por 10 min, agitando a 700-800 rpm.</li>
		<li>Carregar os tubos para o conjunto do adaptador disruptor amostra automatizado.</li>
		<li>Grânulo de vencer por 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Desmontar o conjunto de adaptador e alternar manualmente o adaptador em conjunto com as placas de amostra do braço robótico esquerdo para o braço direito robótico do instrumento.</li>
		<li>Grânulo de bate por mais 1 minutos a 30 Hz.</li>
		<li>Tubos de centrífuga a 17.200 x g, durante 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Remova todo o sobrenadante com uma pipeta de 200 µ l, tomando cuidado para não pegar qualquer um da camada de gordura na parte superior da amostra ou o grânulo residual na parte inferior da amostra e aplicar a uma coluna de homogeneizador.</li>
		<li>Colunas de homogeneizador centrífuga na velocidade máxima, 17.200 x g, durante 3 minutos a 25 ° C.</li>
		<li>Transferência de 350 µ l de eluato para tubo de microcentrifugadora um-2ml do fabricante para uso com o instrumento automatizado para purificação de DNA e RNA (não utilize qualquer outro tubo). Tenha cuidado para não transferir qualquer camada gordurosa residual.</li>
		<li>Se o volume de escoamento inferior a 350 µ l, adicione tampão de Lise com β-ME até um volume final de 350 µ l.</li>
		<li>Deixe as amostras no RT para até 2 h antes de prosseguir para o isolamento de ácidos nucleicos, usando o instrumento de purificação de DNA automatizado, ou congelar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpeza de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpa todas as superfícies em usam uma solução de descontaminação não enzimáticos, deixar por 10 min, então pulverize com etanol a 70% e limpe a superfície a.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolar o DNA/RNA
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Ligar o bloco de calor e definir a temperatura de 70 ° C.</li>
		<li>Ligue o reaccional de temperatura controlada e seleccionar a temperatura de 37 ° c.</li>
		<li>Aquecer o tampão de eluição (EB) contendo 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, em um tubo de 50 mL para 70 ° C.</li>
		<li>Aquecer a 350 µ l de amostra congelada lysates em tubos de 2 mL a 37 ° C até completamente descongelados sem qualquer precipitado (aproximadamente 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificação de DNA
	<ol>
<li>Vórtice e centrifugar os tubos de 2 mL com amostra brevemente (3000 x g durante 10 s).</li>
		<li>Inserir tubos 2 mL shaker seguindo o gráfico de carga do instrumento purificação automatizado de DNA/RNA, as instruções do fabricante.</li>
		<li>Se os adaptadores de rotor e configurá-los na bandeja com base no número de amostras.</li>
		<li>Etiquete cada adaptador de rotor com base na identificação da amostra (ID).</li>
		<li>Corte as tampas e suavizar as arestas de colunas individuais de rotação para DNA e RNA.</li>
		<li>Insira o adaptador do rotor a coluna de rotação de DNA sem o tubo de coleta. Descarte o tubo de coleta.</li>
		<li>Rotular 1,5 mL a tubos de colheita e inserir em adaptadores de rotor.</li>
		<li>Conjunto de adaptadores de rotor em centrífuga seguindo o gráfico de carga do instrumento purificação automatizado de DNA/RNA.</li>
		<li>Inserção 1.000 µ l filtro-dicas do fabricante em racks de ponta.</li>
		<li>Adicione água livre de RNase para tubo de microcentrifugadora um 2 mL do fabricante baseado no número de amostras (por instruções de protocolo específico de máquina).</li>
		<li>Introduza o tubo na ranhura do tubo "A" de slots de tubo de microcentrifugadora.</li>
		<li>Descarte qualquer reagente que sobra em frascos de reagente e encha-a com um volume mínimo de 10 mL.</li>
		<li>Inserir o rack de reagente garrafa (exceto garrafa EB) frascos de reagente.</li>
		<li>Adicione EB quente de um tubo de 50 mL para a frasco de reagente posição 6.</li>
		<li>Tubos de 1,5 mL de verificação são colocados firmemente em adaptadores do rotor.</li>
		<li>Feche a tampa do instrumento e selecione: "RNA" → "extração kit" → "Animal, tecidos e células" → "do kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" editar o Volume de eluição para 100 µ l (padrão) ou 50 µ l para baixa biomassa amostras → → "Iniciar."</li>
		<li>Quando completo, remover adaptadores de rotor de centrífuga e colocá-los na bandeja.</li>
		<li>Descarte a coluna de rotação de DNA do rotor adaptador posição 3.</li>
		<li>Não deposite estes adaptadores de rotor, o RNA é na posição 2.</li>
		<li>Remova os tubos de colheita de 1,5 mL contendo DNA eluted na posição 3 e armazenar em −20 ° C.</li>
		<li>Colete amostra contendo tubos de agitador e loja em −20 ° C, se qualquer amostra que sobra, caso contrário descartar.</li>
		<li>Continue com o protocolo "do kit nome 350 µ l parte B RNA" para mais purificação do RNA.</li>
		<li>Purificação de RNA será feita desde a aproximadamente 350 µ l de passagem que está na posição do meio de adaptadores do rotor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificação de RNA
	<ol>
<li>Insira a coluna de rotação de RNA sem sua tampa e tubo de coleta no adaptador do rotor.</li>
		<li>Rótulo novo 1,5 mL tubos de coleção e inseri-los no adaptador do rotor, conforme indicado no manual.</li>
		<li>Defina os adaptadores de rotor em centrífuga seguindo o gráfico de carga do instrumento purificação automatizado de DNA/RNA.</li>
		<li>Feche a tampa do instrumento e selecione: "RNA" → "Do fabricante Kit" → "Animal, tecidos e células" → "Padrão parte B RNA" → "Start".</li>
		<li>Quando concluído, remover adaptadores de rotor de centrífuga e colocá-los na bandeja.</li>
		<li>Descarte a coluna de rotação RNA da posição 3.</li>
		<li>Remova os tubos de colheita de 1,5 mL contendo 30 µ l eluída RNA na posição 3 e armazenar a −80 ° C.</li>
		<li>Remova os frascos de reagente.</li>
		<li>Descarte de conteúdo de adaptador do rotor através de canais adequados de resíduos perigosos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estação de trabalho limpo
	<ol>
<li>Spray de acessórios todos automatizado de DNA/RNA purificação do instrumento, tais como cremalheiras de reagente, bandeja e qualquer outra superfície em usam uma solução de descontaminação não enzimáticos, deixar por 10 min e enxague com deionizada (DI) e, em seguida, deixe-os secar.</li>
		<li>Pulverizador do instrumento automatizado com apenas fabricante aprovado solução de descontaminação não enzimáticos, limpe o interior do centrifugador juntamente com todas as superfícies em uso, deixe por 10 min e em seguida limpe com etanol a 70%. Não utilize outros tipos de soluções de descontaminação, pois eles podem danificar o instrumento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alvo 16S PCR set-up
Nota: A afinação para o PCR 16S é realizada em um espaço de trabalho pré-amplificação designado localizado dentro da sala limpa. Os reagentes e amostras são preparadas e então carregadas em um manipulador de líquido para realizar o PCR para cada amostra em triplicata (30 amostras, que incluem o verdadeiras amostras e controles positivo e negativo de extração, além de 2 controles de água PCR em triplicado, para um total de 96 combinado de amostras e controles). Uma vez que as reações de PCR são montadas e seladas, a placa da amostra é transferida para um termociclador, localizado em uma área de post-amplificação para o ciclismo.
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpe a estação de trabalho do PCR. Spray de que todas as superfícies em uso com um DNA de RNase, DNase, descontaminante, seguido por DI água duas vezes, e, finalmente, 70% de etanol.</li>
		<li>Preparar a planilha de PCR 16S (consulte a planilha de PCR alvejados 16S) com uma lista de exemplos precisos e atribuir primers de código de barras diferente para cada amostra9. Imprima a planilha e os mapas de placa (ver placa 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do mestre mistura PCR Nota: 16S cartilha seleção baseia-se na região de interesse para o estudo particular e pode mudar pelo tipo de estudo ou amostra. Portanto, antes de requisitar as primeiras demão, é importante confirmar qual é a área do melhor de rRNA 16S amplifica os micróbios de interesse para o estudo particular. Este protocolo, como está escrito é para a amplificação da região 16S V4. Se diferentes cartilhas/região é selecionado, em seguida, a temperatura do recozimento na ciclagem térmica pode requerer ajustes.<ol>
<li>Trabalho na estação de trabalho da PCR para preparar tudo.</li>
		<li>Tirar 50-100 µ l de amostras de DNA de-20 ° C e todos os reagentes necessários e descongelá-los no gelo. Vórtice e brevemente spin para baixo.</li>
		<li>Os primers são pré-diluídos na concentração de trabalho de 5 µM em um volume mínimo de 20 µ l.</li>
		<li>Prepare a mistura de mestre de PCR no tubo 5ml específico com somente o primer para frente de acordo com o cálculo da planilha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando o manipulador robótico líquido para instalação automatizada de PCR
	<ol>
<li>Para amostras, retire o adaptador de amostra de um 32-poço do instrumento e carregar 50-100 µ l de amostras de DNA de acordo com o mapa de placa de 96 poços, de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Para cada placa PCR, configure 2 controles negativos, colocando 30 µ l de água do PCR em um tubo de amostra limpa.</li>
			<li>Coloque todas as amostras no adaptador de amostra do instrumento 32-poço com tampas bloqueadas na posição aberta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para primeiras demão reverso9<ol>
<li>Retire a tampa de cada primer reverso com código de barras específico # s um de cada vez (luvas de mudança entre elas para evitar contaminação cruzada).</li>
			<li>Coloque um máximo de 32 primers no adaptador do reagente do instrumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pegue um prato PCR de 96 poços e rotulá-la com o nome de estudo, número da amostra, data e as iniciais do técnico.</li>
		<li>Carregar o manipulador robótico líquido<ol>
<li>Coloque o adaptador de reagente na posição B1. Para evitar um efeito de borda, coloque cuidadosamente uma extremidade do adaptador contra o lado de aperto e lentamente derrubar a outra borda. Certifique-se de empurrar em todos os cantos dos adaptadores de rede.</li>
			<li>Coloque o adaptador de amostra na posição C1. Certifique-se de empurrar em todos os cantos dos adaptadores de rede.</li>
			<li>Vórtice mestre 5 mL mistura, abra a tampa e coloque-o na posição A, em bloco de mistura e reagente mestre do instrumento.</li>
			<li>Coloque a placa PCR no adaptador de 96 poços do instrumento que se destina a segurar placas PCR metade contornadas.</li>
			<li>Começar a correr e salvar como um arquivo novo.</li>
			<li>Siga as instruções e seleção marcar cada aviso: uma, dicas estão disponíveis, dois, caixa de resíduos está disponível, e três, começar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após a execução estiver concluída, verifique se foram sem erros, verificando a máquina para mensagens de erro.</li>
		<li>A placa com o 12 ou 8 tira bonés, vórtice do selo vigorosamente, spin para baixo por 1 min, usando um girador de placa de 96 poços e colocá-lo no gelo ou na geladeira.</li>
		<li>Remova os tubos contendo primers reversos e amostras.</li>
		<li>Levar a placa de 96 poços para a sala de pós-amplificação e carregar a placa sobre o termociclador e ciclo de acordo com a tabela de condições térmicas-ciclismo (ver tabela 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. controle da qualidade alvo 16S Post-PCR usando a plataforma baseada em fita para a electroforese do Gel
Nota: Post-PCR controle de qualidade (QC) e todas as etapas subsequentes são realizadas em uma área designada de post-amplificação do laboratório. O DNA é analisado em um analisador automatizado de fragmento de DNA/RNA.
<ol><li>
Preparação de área de trabalho
	<ol>
<li>Limpe a estação de trabalho por pulverização de que todas as superfícies em uso com DNase, RNase, DNA descontaminante, seguido por DI água duas vezes, e, finalmente, 70% de etanol.</li>
		<li>Reunir todos os suprimentos e equipamentos necessários.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar os reagentes
	<ol>
<li>Coloque o amortecedor da amostra e escada na temperatura controlada reaccional a 25 ° C, por um período mínimo de 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enquanto os reagentes estão a aquecer, preparar amostras PCR por pool de 3 repetições PCR para cada amostra em um tubo único</li>
	<li>Carregar amostras no instrumento.</li>
	<li>Brevemente o vórtice e spin-down tubos com produto PCR em pool.</li>
	<li>Coloque a placa de 96 poços do instrumento em um rack no RT e rotulá-la.</li>
	<li>Brevemente vórtice e girar para baixo o amortecedor da amostra e a escada.</li>
	<li>Adicione o amortecedor da amostra 3 µ l de cada poço da placa de 96 bem (necessidade de pelo menos 53 fita de tela / µ l).</li>
	<li>Executar um número de amostras; Se houver um número ímpar de amostras, adicione 4 µ l de tampão de amostra para um poço vazio.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de escada para uma escada bem.</li>
	<li>Seguindo o mapa, adicionar 1 µ l de produto PCR em pool para seu bem.</li>
	<li>Placa de cobertura com selo de alumínio</li>
	<li>Vórtice a placa usando reaccional e adaptador do instrumento a 2.000 rpm durante 1 min.</li>
	<li>Gire para baixo posição da amostra no fundo do tubo, se houver bolhas girar para baixo novamente.</li>
	<li>Inicie o software.</li>
	<li>Carrega as dicas de gravação e carregamento de tela dentro do instrumento.</li>
	<li>Carregar amostras para o analisador de fragmento com um adaptador de 96 poços.</li>
	<li>Configure uma corrida com o software de controlador.</li>
	<li>Certifique-se de selecionar poços nem numerados.</li>
	<li>Escreva IDs de amostra.</li>
	<li>Verifique que todos os poços da fita tela são destacados em cinza.</li>
	<li>Certifique-se que o analisador reconhece todas as pontas de pipeta.</li>
	<li>Selecione Iniciar e especificar um nome de arquivo para salvar os resultados (estudar o nome, números de amostra e data).</li>
	<li>Consulte as instruções do fabricante para obter mais detalhes.</li>
	<li>Após a execução completa, descarte a ponta, fita de tela e tubos.</li>
	<li>Analise dados para 16S pico nM (entre 315-450 bp para V4). Este pico irá variar dependendo os primers selecionados.</li>
</ol>5. Biblioteca cálculo, agrupamento, limpar e QC
<ol><li>Depois de determinar o tamanho do amplicon e molaridade de todas as amostras, as bibliotecas para atingir o volume final desejado e nM para a biblioteca em pool da piscina (ver exemplo de cálculo).</li>
	<li>Limpar e concentrado a biblioteca em pool usando uma purificação baseados em membrana de silicone kit para produtos PCR, de acordo com do fabricante protocolo (consulte Tabela de materiais).<ol>
<li>Eluir o DNA com um volume final de 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a concentração da biblioteca limpa imediatamente usando um kit de alta sensibilidade de DNA encalhado dobro para um dados, de acordo com o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Dilua 2 µ l da biblioteca em pool e limpa com 198 µ l de tampão de diluição mais tintura (diluição 1: 100).</li>
		<li>Registrar o valor medido do dispositivo fluorométrica e convertê-lo de acordo com o fator de diluição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando a concentração (ng / µ l) de leitura para a biblioteca em pool, calcule a molaridade de biblioteca em nM. Use a biblioteca não diluído de 1 µ l para medir o OD260/280 em um espectrofotômetro microvolume. Nota: Um valor de 1.8-2.0 indica pureza adequada da biblioteca.</li>
	<li>Armazene a biblioteca final a-20 ° C até que esteja pronto para sequenciamento de próxima geração.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Sequenciamento de próxima geração alvo de 16S rRNA é uma técnica amplamente utilizada, rápida para microbiome caracterização18. No entanto, muitos fatores, incluindo efeitos de lote, contaminação ambiental, contaminação cruzada amostra, sensibilidade e reprodutibilidade podem adversamente afetar resultados experimentais e confundir sua interpretação7,19 , 20. para melhor facilitar análises robustas 16S, f...

As comunidades microbianas que colonizam os seres humanos são acreditadas para ser criticamente importante para a saúde humana e doença influenciam o metabolismo, desenvolvimento imune, susceptibilidade a doenças e respostas a vacinação e drogas terapia1, 2. esforços para entender a influência da microbiota na saúde humana atualmente enfatizam a identificação de micróbios associados com compartimentos anatômicos definidos (i.e., pele, intestino, oral, etc.), bem como sites localizados dentro Estes compartimentos3,4. Subjacente a esses esforços de investigação é o rápido aparecimento e maior acessibilidade das tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) que fornecem uma plataforma maciçamente paralelo para análise do conteúdo genético microbiano (microbiome) de uma amostra. Para muitas amostras fisiológicas, o associado microbiome é complexa e abundante (i.e., fezes), mas, para algumas amostras, a microbiome é representada por baixo carbono da biomassa microbiano (ou seja, leite humano, trato respiratório inferior) onde sensibilidade, artefatos experimentais e possível contaminação tornam-se grandes questões. Os desafios comuns de microbiome estudos e delineamento experimental adequado tem sido objecto de múltiplas revisão artigos5,6,7,8.
Aqui apresentados um robusto pipeline experimental de NGS baseia-alvo sequenciamento do rRNA 16S V4 região9 para caracterizar a microbiome do leite humano. Microbiome análise do leite humano é complicado, não só por uma biomassa microbiana inerentemente baixa10, mas adicionalmente por alto níveis de DNA humano fundo11,12,13,14 e potencial Reportes de PCR inibidores15,16 em extraído do ácido nucleico. Este protocolo baseia-se nas plataformas semi automatizadas que podem ajudar a minimizar a variabilidade entre lotes de preparação de amostra e kits de extração comercialmente disponível. Incorpora uma comunidade simulada bacteriana bem definida é processado juntamente com amostras como um controle de qualidade para validar cada passo no protocolo e fornecem uma métrica independente da robustez do gasoduto. Embora o protocolo como descrito é específico para as amostras de leite humano, é facilmente adaptável para outros tipos de amostras, incluindo fezes, retal, vaginal, pele, cotonetes areolar e oral10,17e pode servir como ponto de partida para pesquisadores que desejem realizar análises microbiome.

<table><tbody><tr><td>Mini kit de RNA/DNA AllPrep</td> Kit de <td>extração de DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80204</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, descontaminante de DNA</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> tampão <td>de vórtice com temperatura controlada</td></tr><tr><td>RLT mais</td><td>tampão de lise de tiocianato de guanidínio 1053393 Qiagen / Parte do kit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME é um agente redutor que desnaturará irreversivelmente as RNases reduzindo as ligações dissulfeto</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>tubo de esferas</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>conjunto de adaptadores disruptores de amostra automatizados</td></tr><tr><td>QIAshredder coluna</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de</td><td>microcentrífuga do fabricante do tubo</td><td></td><td></td> QIAgen RB no kit</tr><tr><td>QIAcube e utensílios plásticos relacionados</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>instrumento automatizado de purificação de DNA/RNA</td></tr><tr><td>DNA Exitus de DNA mais</td> solução de <td>descontaminação não enzimática</td><td>Applichem</td><td>A7089</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>tampão de eluição</td></tr><tr><td>QIAgility e artigos</td> <td>plásticos relacionadosQiagen</td><td>9001532</td><td>manipulador de líquidos robótico</td></tr><tr><td>PCR água</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Primers reversos com código de barras</td><td>Eurofin</td><td>Sem catálogo #'s</td><td>projetado e encomendado</td></tr><tr><td>placa PCR de 96 poços</td><td>EUA científico</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 e plásticos</td> <td>relacionadosAnalisador</td><td>automatizado de fragmentos de DNA/RNA</td><td>Agilent G2964AA</td></tr><tr><td>D1000 reagentes para Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>O tampão de amostra e a escada fazem parte deste kit Kit de remoção de</td></tr><tr><td>inibidores de PCR OneStep</td> A <td>remoção 50444470</td> do <td>inibidor de PCR da Zymo Research é feita de acordo com as instruções do fabricante.</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td> Kit de limpeza de DNA <td>Qiagen</td><td>28104</td>: <td>purificação à base de membrana de sílica de produtos de PCR</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>tampão de diluição à base de dimetilsulfóxido e corante fazem parte deste kit.</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>espectrofotômetro de microvolume</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catálogo #'s</td><td>sequenciador de próxima geração</td></tr></tbody></table>

um método para o sequenciamento de alvo 16s das amostras de leite humano

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Estudos de comunidades microbianas tornaram-se generalizados com o desenvolvimento do sequenciamento de relativamente barata, rápida e alta taxa de transferência. No entanto, como com todas estas tecnologias, resultados reprodutíveis dependem de um fluxo de trabalho de laboratório que incorpora controles e as devidas precauções. Isto é particularmente importante com amostras de baixa biomassa onde a contaminação bacteriana DNA pode gerar resultados enganosos. Este artigo detalha um fluxo de trabalho semi-automático para identificar micróbios de amostras de leite materno usando alvo sequenciamento da região 16S RNA ribossomal (rRNA) V4 em escala para baixo e médio throughput. O protocolo descreve a preparação da amostra de leite integral incluindo: Lise, extração de ácidos nucleicos, amplificação da região V4 do gene de rRNA 16S e preparação de biblioteca com as medidas de controlo de qualidade da amostra. Importante, o protocolo e discussão consideram questões que são importantes para a preparação e análise de amostras de baixa-biomassa, incluindo controlos adequados em positivos e negativos, remoção de inibidor PCR, contaminação da amostra por ambiental, reagente, ou fontes experimentais e práticas recomendadas experimentais concebidas para garantir a reprodutibilidade. Enquanto o protocolo como descrito é específico para as amostras de leite humano, é adaptável a vários tipos de amostra de baixa e alta-biomassa, incluindo amostras coletadas em cotonetes, congelados puro, ou estabilizado em um buffer de preservação.

O protocolo aqui apresentado inclui importante controle de qualidade (QC) passos para garantir que a reunião de dados gerados referenciais para o controle de sensibilidade, especificidade e contaminação de protocolo. Primeiro passo QC do protocolo segue a amplificação por PCR da região 16S do V4 (Figura 2). Um µ l de produto PCR de cada amostra foi analisada por eletroforese para confirmar que era dentro do intervalo de tamanho esperado da bp 315-450 (<strong...

Um fluxo de trabalho semi-automático é apresentado para sequenciamento alvo de 16S rRNA de leite humano e outros tipos de amostras de biomassa de baixo.

Um método para o sequenciamento de alvo 16S das amostras de leite humano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

O objetivo geral deste método é amplificar 16 SRRNA de leite humano e outras amostras de baixa biomassa usando um protocolo semiautomatizado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento e perturbações do microbioma humano no que se refere à saúde e à doença. A principal vantagem da técnica é que ela é semiautomatizada, relativamente fácil de executar e adaptável a vários tipos de amostras, incluindo secreção, cotonetes e fezes.Depois de descongelar e aloquacionar o leite integral de acordo com o protocolo de texto, gire as amostras a 5000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos para peletar as células. Use uma espátula de plástico ou ponta de pipeta de grande diâmetro para remover a camada superior de gordura. Em seguida, sem perturbar o pellet, remova todo o sobrenadante, exceto 100 microlitros.Com um mililitro de PBS, ressuspenda e lave o pellet. Em seguida, prepare um controle negativo adicionando um mililitro de PBS estéril a um tubo de cinco mililitros. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga limpo de um ponto e cinco mililitros e gire-o a 5000 vezes G em temperatura ambiente por um minuto.Em seguida, use uma ponta de pipeta filtrada estéril de 1000 microlitros para descartar toda a camada de gordura sobrenadante. Para interromper e homogeneizar a amostra, adicione 600 microlitros de tampão de lise contendo beta mercaptoetanol ao pellet e transfira a suspensão para um tubo de esferas. Preparar um controlo positivo com tampão de lise e 20 microlitros da amostra simulada bacteriana.Vortex todos os tubos de contas vigorosamente por 15 segundos. Em seguida, aqueça as amostras em um vórtice com temperatura controlada a 37 graus Celsius e 700 a 800 RPM por 10 minutos. Carregue os tubos no conjunto de adaptadores automatizados do disruptor de amostras.Em seguida, bata as amostras a 30 hertz por um minuto. Desmonte o conjunto adaptador e alterne-o manualmente com o sample placas do braço robótico esquerdo para o braço robótico direito do instrumento. Bata os tubos a 30 hertz por mais um minuto e centrifugue os tubos a 17, 200 vezes G e 25 graus Celsius por três minutos.Usando uma pipeta de 200 microlitros, remova todo o sobrenadante, tomando cuidado para não retirar nenhuma camada de gordura na parte superior ou o resíduo do grânulo na parte inferior da amostra. Aplicar o sobrenadante às colunas homogeneizadoras. Em seguida, centrifugue as colunas na velocidade máxima e 25 graus Celsius por três minutos.Transfira 350 microlitros de eluídeo para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros do fabricante. Para isolar o DNA de acordo com o protocolo de texto, corte as tampas e alise as bordas das colunas de rotação individuais para DNA e RNA. Insira a coluna de rotação de DNA sem o tubo de coleta no adaptador do rotor.Em seguida, descarte o tubo de coleta. Em seguida, insira os tubos de dois mililitros em vórtice em um agitador, seguindo o gráfico de carga do instrumento automatizado de purificação de DNA / RNA de acordo com as instruções do fabricante. Rotule os tubos coletores de um ponto e cinco mililitros e insira-os nos adaptadores do rotor.Em seguida, coloque os adaptadores do rotor na centrífuga seguindo o gráfico de carga do instrumento automatizado de purificação de DNA/RNA. Depois de inserir as pontas do filtro, a água livre de RNase e os reagentes no bloco de reagentes do instrumento, feche a tampa do instrumento e execute o programa de purificação de DNA personalizado no instrumento. Quando a reação estiver completa, colete a amostra contendo tubos do agitador e, se sobrar alguma amostra, armazene-a a menos 20 graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo.Depois de preparar a área de trabalho e a mistura mestre de PCR, de acordo com o protocolo de texto, carregue de 50 a 100 microlitros de amostras de DNA em um adaptador de amostra de instrumento de 32 poços, seguindo o mapa da placa de 96 poços. Para cada placa de PCR, configure dois controles negativos pipetando 30 microlitros de água de PCR em um tubo de coleta limpo de um ponto e cinco mililitros. Em seguida, coloque todas as amostras no adaptador de amostra de instrumento de 32 poços com as tampas travadas na posição aberta.No adaptador de reagente do instrumento, remova a tampa de cada primer reverso com números de código de barras específicos, um de cada vez. Para carregar o manipulador de líquidos robótico, coloque o adaptador de reagente na posição B1.In evitar um efeito de borda, coloque cuidadosamente uma borda do adaptador contra o lado da alça e traga lentamente a outra borda para baixo. Certifique-se de empurrar todos os cantos dos adaptadores.Coloque o sample adaptador na posição C1, certificando-se de empurrar todos os cantos dos adaptadores. Em seguida, bata a mistura master de cinco mililitros. Abra a tampa e coloque-a na posição A na mistura principal do instrumento e no bloco de reagentes.Coloque a placa PCR no adaptador do instrumento de 96 poços que se destina a segurar placas PCR com meio rodapé. Em seguida, inicie a execução e salve-a como um novo arquivo. Quando a execução for concluída, verifique se não houve erros.Em seguida, use 12 ou oito tampas de tira para selar a placa. Vortex vigorosamente e use um girador de placas de 96 poços para girar as placas por um minuto. Por fim, coloque a placa no gelo até que seja movida para a sala de pós-amplificação e carregada no termociclador.Após a amplificação da PCR, realizar o controle de qualidade e a preparação da biblioteca de acordo com o protocolo de texto. A primeira etapa de CQ do protocolo segue a amplificação por PCR da região 16SV4. Como mostrado aqui, um microlitro de produto de PCR de cada amostra foi analisado por eletroforese para confirmar que estava dentro da faixa de tamanho esperada de 350 a 450 pares de bases.Algumas amostras de leite humano geraram quantidades menores de produto específico, sugerindo baixos níveis de DNA microbiano extraído nessas amostras ou transferência de inibidores de PCR durante a extração. A quantificação do produto específico para cada amostra foi essencial para determinar seu volume necessário para o agrupamento molar igual de amostras para sequenciamento. Uma biblioteca agrupada para sequenciamento direcionado geralmente é dominada por um produto de PCR específico.Se houver uma quantidade significativa de produto inespecífico na biblioteca, uma etapa de purificação de gel deve ser adicionada ao fluxo de trabalho. Os resultados do sequenciamento demonstram alta diversidade nos táxons associados ao microbioma do leite humano e variabilidade no número de contagens de junco de sequenciamento para cada amostra. Em contraste, a composição dos táxons e as contagens de juncos para a simulação bacteriana foram comparáveis aos resultados obtidos para a simulação em execuções anteriores do fluxo de trabalho, sugerindo que a variabilidade observada para as amostras de leite humano é um resultado experimental autêntico e não uma função da variabilidade intrínseca do fluxo de trabalho.Se deixar um sequenciador funcionando durante a noite, essa técnica pode ser feita em dois dias, para 12 a 24 amostras, se todas as amostras amplificarem na execução inicial da PCR. Caso contrário, é necessário outro dia de shell. Ao tentar este procedimento, é importante viajar apenas da área pré-PCR para a área pós-PCR para evitar contaminação.Também é fundamental trocar as luvas com frequência para evitar qualquer contaminação cruzada. Não se esqueça de que trabalhar com amostras humanas pode ser perigoso e precauções, como equipamentos de proteção adequados e cabines de biossegurança, devem sempre ser usadas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

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Este artigo descreve como montar um dispositivo que pode ser usado para coletar leite de ratos de laboratório. Este dispositivo é acessível, portátil e permite a coleta de 0,1 a 0,5 mL de leite por uma pessoa treinada. Um protocolo de ordenha detalhado também está incluído.

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Aprenda um método semi-automatizado de sequenciamento 16S rRNA para amostras de leite humano de baixa biomassa. Esta técnica facilita pesquisas sobre o microbioma humano e suas implicações para saúde e doença.

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