Um método para o sequenciamento de alvo 16S das amostras de leite humano

O objetivo geral deste método é amplificar 16 SRRNA de leite humano e outras amostras de baixa biomassa usando um protocolo semiautomatizado. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento e perturbações do microbioma humano no que se refere à saúde e à doença. A principal vantagem da técnica é que ela é semiautomatizada, relativamente fácil de executar e adaptável a vários tipos de amostras, incluindo secreção, cotonetes e fezes.

Depois de descongelar e aloquacionar o leite integral de acordo com o protocolo de texto, gire as amostras a 5000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos para peletar as células. Use uma espátula de plástico ou ponta de pipeta de grande diâmetro para remover a camada superior de gordura. Em seguida, sem perturbar o pellet, remova todo o sobrenadante, exceto 100 microlitros.

Com um mililitro de PBS, ressuspenda e lave o pellet. Em seguida, prepare um controle negativo adicionando um mililitro de PBS estéril a um tubo de cinco mililitros. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga limpo de um ponto e cinco mililitros e gire-o a 5000 vezes G em temperatura ambiente por um minuto.

Em seguida, use uma ponta de pipeta filtrada estéril de 1000 microlitros para descartar toda a camada de gordura sobrenadante. Para interromper e homogeneizar a amostra, adicione 600 microlitros de tampão de lise contendo beta mercaptoetanol ao pellet e transfira a suspensão para um tubo de esferas. Preparar um controlo positivo com tampão de lise e 20 microlitros da amostra simulada bacteriana.

Vortex todos os tubos de contas vigorosamente por 15 segundos. Em seguida, aqueça as amostras em um vórtice com temperatura controlada a 37 graus Celsius e 700 a 800 RPM por 10 minutos. Carregue os tubos no conjunto de adaptadores automatizados do disruptor de amostras.

Em seguida, bata as amostras a 30 hertz por um minuto. Desmonte o conjunto adaptador e alterne-o manualmente com o sample placas do braço robótico esquerdo para o braço robótico direito do instrumento. Bata os tubos a 30 hertz por mais um minuto e centrifugue os tubos a 17, 200 vezes G e 25 graus Celsius por três minutos.

Usando uma pipeta de 200 microlitros, remova todo o sobrenadante, tomando cuidado para não retirar nenhuma camada de gordura na parte superior ou o resíduo do grânulo na parte inferior da amostra. Aplicar o sobrenadante às colunas homogeneizadoras. Em seguida, centrifugue as colunas na velocidade máxima e 25 graus Celsius por três minutos.

Transfira 350 microlitros de eluídeo para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros do fabricante. Para isolar o DNA de acordo com o protocolo de texto, corte as tampas e alise as bordas das colunas de rotação individuais para DNA e RNA. Insira a coluna de rotação de DNA sem o tubo de coleta no adaptador do rotor.

Em seguida, descarte o tubo de coleta. Em seguida, insira os tubos de dois mililitros em vórtice em um agitador, seguindo o gráfico de carga do instrumento automatizado de purificação de DNA / RNA de acordo com as instruções do fabricante. Rotule os tubos coletores de um ponto e cinco mililitros e insira-os nos adaptadores do rotor.

Em seguida, coloque os adaptadores do rotor na centrífuga seguindo o gráfico de carga do instrumento automatizado de purificação de DNA/RNA. Depois de inserir as pontas do filtro, a água livre de RNase e os reagentes no bloco de reagentes do instrumento, feche a tampa do instrumento e execute o programa de purificação de DNA personalizado no instrumento. Quando a reação estiver completa, colete a amostra contendo tubos do agitador e, se sobrar alguma amostra, armazene-a a menos 20 graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo.

Depois de preparar a área de trabalho e a mistura mestre de PCR, de acordo com o protocolo de texto, carregue de 50 a 100 microlitros de amostras de DNA em um adaptador de amostra de instrumento de 32 poços, seguindo o mapa da placa de 96 poços. Para cada placa de PCR, configure dois controles negativos pipetando 30 microlitros de água de PCR em um tubo de coleta limpo de um ponto e cinco mililitros. Em seguida, coloque todas as amostras no adaptador de amostra de instrumento de 32 poços com as tampas travadas na posição aberta.

No adaptador de reagente do instrumento, remova a tampa de cada primer reverso com números de código de barras específicos, um de cada vez. Para carregar o manipulador de líquidos robótico, coloque o adaptador de reagente na posição B1.In evitar um efeito de borda, coloque cuidadosamente uma borda do adaptador contra o lado da alça e traga lentamente a outra borda para baixo. Certifique-se de empurrar todos os cantos dos adaptadores.

Coloque o sample adaptador na posição C1, certificando-se de empurrar todos os cantos dos adaptadores. Em seguida, bata a mistura master de cinco mililitros. Abra a tampa e coloque-a na posição A na mistura principal do instrumento e no bloco de reagentes.

Coloque a placa PCR no adaptador do instrumento de 96 poços que se destina a segurar placas PCR com meio rodapé. Em seguida, inicie a execução e salve-a como um novo arquivo. Quando a execução for concluída, verifique se não houve erros.

Em seguida, use 12 ou oito tampas de tira para selar a placa. Vortex vigorosamente e use um girador de placas de 96 poços para girar as placas por um minuto. Por fim, coloque a placa no gelo até que seja movida para a sala de pós-amplificação e carregada no termociclador.

Após a amplificação da PCR, realizar o controle de qualidade e a preparação da biblioteca de acordo com o protocolo de texto. A primeira etapa de CQ do protocolo segue a amplificação por PCR da região 16SV4. Como mostrado aqui, um microlitro de produto de PCR de cada amostra foi analisado por eletroforese para confirmar que estava dentro da faixa de tamanho esperada de 350 a 450 pares de bases.

Algumas amostras de leite humano geraram quantidades menores de produto específico, sugerindo baixos níveis de DNA microbiano extraído nessas amostras ou transferência de inibidores de PCR durante a extração. A quantificação do produto específico para cada amostra foi essencial para determinar seu volume necessário para o agrupamento molar igual de amostras para sequenciamento. Uma biblioteca agrupada para sequenciamento direcionado geralmente é dominada por um produto de PCR específico.

Se houver uma quantidade significativa de produto inespecífico na biblioteca, uma etapa de purificação de gel deve ser adicionada ao fluxo de trabalho. Os resultados do sequenciamento demonstram alta diversidade nos táxons associados ao microbioma do leite humano e variabilidade no número de contagens de junco de sequenciamento para cada amostra. Em contraste, a composição dos táxons e as contagens de juncos para a simulação bacteriana foram comparáveis aos resultados obtidos para a simulação em execuções anteriores do fluxo de trabalho, sugerindo que a variabilidade observada para as amostras de leite humano é um resultado experimental autêntico e não uma função da variabilidade intrínseca do fluxo de trabalho.

Se deixar um sequenciador funcionando durante a noite, essa técnica pode ser feita em dois dias, para 12 a 24 amostras, se todas as amostras amplificarem na execução inicial da PCR. Caso contrário, é necessário outro dia de shell. Ao tentar este procedimento, é importante viajar apenas da área pré-PCR para a área pós-PCR para evitar contaminação.

Também é fundamental trocar as luvas com frequência para evitar qualquer contaminação cruzada. Não se esqueça de que trabalhar com amostras humanas pode ser perigoso e precauções, como equipamentos de proteção adequados e cabines de biossegurança, devem sempre ser usadas.