Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin
24 de fevereiro de 2018
As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que podem produzir espécies reativas de oxigênio (ROS). Liberação de sites individuais nas mitocôndrias monitoramento ROS é um desafio devido às reações colaterais indesejados. Apresentamos um método fácil e barato para avaliação direta do nativas taxas para liberação ROS usando flavoenzymes purificado e microplacas fluorometry.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar a taxa de produção de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH de desidrogenases mitocondriais purificadas contendo flavina usando fluorometria de microplacas. A mitocôndria pode conter até 12 locais diferentes de formação de superóxido/peróxido de hidrogênio que foram identificados usando diferentes combinações de substrato e inibidor com mitocôndrias isoladas. No entanto, algumas dificuldades ainda permanecem em relação à quantificação precisa da capacidade de liberação de locais individuais de produção em mitocôndrias isoladas.
E isso está associado a reações colaterais indesejadas que também produzem espécies reativas de oxigênio, mas também à presença de antioxidantes e ao uso de inibidores que carecem de especificidade, além do uso de aditivos que podem interferir nas medições. Aqui apresentamos o método para a medição simultânea de superóxido / peróxido de hidrogênio e produção de NADH por desidrogenase mitocondrial dependente de flavina purificada. Este método é vantajoso, pois pode permitir a quantificação direta e precisa do potencial de produção de ROS de locais individuais de produção, eliminando reações colaterais indesejadas e quaisquer sistemas de extinção de espécies reativas de oxigênio.
A medição simultânea da produção de ROS e NADH também permite a comparação direta do potencial de formação de superóxido/peróxido de hidrogênio e da atividade de enzimas individuais, o que pode ser valioso para a triagem de inibidores para a produção de ROS antes da realização de ensaios com mitocôndrias. Para nossos propósitos aqui, usaremos o complexo piruvato desidrogenase e o complexo alfa-cetoglutarato desidrogenase de origem cardíaca suína como exemplos. Ambas são enzimas contendo flavina e fontes conhecidas de espécies reativas de oxigênio.
Além disso, essas duas enzimas podem ser facilmente purificadas. A medição simultânea de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH é obtida rastreando as mudanças na florescência. O NADH tem suas próprias propriedades intrínsecas de florescência, o que permite uma fácil medição de sua produção.
Enquanto isso, alterações no superóxido / peróxido de hidrogênio requerem superóxido dismutatase, peroxidase de rábano e reagente ultravermelho amplex. Na presença de peroxidase de rábano e peróxido de hidrogênio, o amplex ultrared é convertido de uma molécula não fluorescente em resorufina fluorescente. A superóxido dismutase garante que qualquer superóxido formado pela desidrogenase em estudo seja convertido em peróxido de hidrogênio.
Antes de configurar o ensaio, as soluções de trabalho são preparadas. Para agilizar o ensaio, todos os reagentes são adicionados aos poços de uma placa preta de 96 poços em alíquotas de 20 microlitros. O volume para cada reação no poço é de 200 microlitros, portanto, as soluções de trabalho são 10 vezes a concentração encontrada no poço de reação.
Em seguida, programe o leitor de microplacas para executar um ensaio cinético para a medição dupla da autoflorescência NADH e da florescência de resorufina. Isso é feito selecionando primeiro Procedimento e configurando-o para 25 graus Celsius. Em seguida, clique em Iniciar cinética.
Defina o tempo de execução por aproximadamente cinco minutos, seguido pela seleção de um intervalo de leitura fluorescente de 30 segundos. Em seguida, clique em Ler e defina os parâmetros de medição fluorescente para o seu ensaio. Aqui, a posição da sonda, os comprimentos de onda usados para rastrear as mudanças na florescência e os poços que serão lidos são inseridos no software.
Os diferentes canais para as leituras fluorescentes também são selecionados, sendo um dedicado à autoflorescência do NADH, que é definido para excitação de 376 nanômetros e comprimentos de onda de emissão de 450 nanômetros. As mudanças na florescência da resorufina são rastreadas em 565 nanômetros e 600 nanômetros. Uma vez que as condições do ensaio tenham sido estabelecidas, os poços individuais são carregados com tampão e diferentes reagentes necessários para medir a produção de NADH e superóxido/peróxido de hidrogênio ao mesmo tempo.
A ordem para carregar os poços com diferentes reagentes é a seguinte. Primeiro, a quantidade necessária de tampão é adicionada ao poço, seguida pela adição de 20 microlitros de solução enzimática purificada. A enzima é equilibrada no tampão por alguns minutos dentro do instrumento.
E então, os reagentes restantes são adicionados na seguinte ordem. Depois que o substrato for adicionado, pressione Iniciar. O suporte da placa entrará no leitor e o protocolo será iniciado.
Durante o ensaio, as saídas em tempo real para unidades fluorescentes relativas brutas, ou RFUs, podem ser rastreadas usando o software. O usuário pode alternar entre as diferentes leituras fluorescentes usando a guia Dados acima do layout do poço. Observe que as curvas para as diferentes leituras fluorescentes podem ser selecionadas.
Além disso, mantendo Control no teclado e clicando com o botão esquerdo nos poços, pode-se produzir um gráfico composto que permite as comparações em tempo real das diferentes reações. Após a conclusão do experimento, o suporte da microplaca sairá do instrumento. Neste ponto, os resultados no gráfico representativo para alterações na RFU são exportados para o Excel.
Os valores brutos de RFU são exportados clicando primeiro em Dados no gráfico RFU representativo. Isso produzirá uma tabela de valores brutos de RFU para NADH e florescência de resorufina. Não que os números brutos de RFU correspondentes a mudanças no NADH ou na florescência de resorufin não possam ser exportados simultaneamente.
Depois de exportados, os resultados são organizados para análise. Usando curvas padrão para NADH e florescência de resorufina geradas antes da realização do ensaio, a quantidade de NADH em micromol e superóxido/peróxido de hidrogênio em picomol formado ao longo do tempo pode ser calculada. Isso pode ser seguido pelo cálculo da taxa de produção de NADH e superóxido/peróxido de hidrogênio.
Para este procedimento, é vital verificar a pureza de sua desidrogenase isolada contendo flavina antes de realizar ensaios. Isso pode ser conseguido realizando uma simples coloração de Coomassie para proteínas ou testando a atividade da enzima na presença de diferentes substratos. Observe que é aconselhável que agentes redutores como o DTT sejam omitidos do ensaio, pois podem servir como substrato para a produção de superóxido / peróxido de hidrogênio por desidrogenases ligadas à flavina.
No geral, este método é altamente flexível, pois pode ser usado para rastrear inibidores para a produção de superóxido/peróxido de hidrogênio e também permite uma comparação direta da capacidade de formação de ROS de diferentes desidrogenases mitocondriais ligadas à flavina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão íntima de como medir a produção de ROS e NADH por desidrogenases purificadas. Este ensaio pode servir como um trampolim para experimentos mais sofisticados com mitocôndrias isoladas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para quantificar as taxas de produção de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH a partir de desidrogenases mitocondriais purificadas contendo flavina, utilizando fluorimetria em microplaca. O método aborda os desafios na medição da liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) a partir de sítios mitocondriais individuais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Biologia Mitochondrial
Contexto
- As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que geram ERO.
- A quantificação precisa da liberação de ERO a partir de sítios individuais é difícil.
- Reações colaterais indesejadas e a presença de antioxidantes complicam as medições.
- Diferentes combinações de substratos e inibidores têm sido utilizadas para identificar os sítios de produção de ERO.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a medição simultânea da produção de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH.
- Eliminar reações colaterais indesejadas na quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS).
- Fornecer uma avaliação direta do potencial de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos sítios mitocondriais.
Métodos Utilizados
- Foram utilizadas desidrogenases mitocondriais dependentes de flavina purificadas.
- A fluorometria em microplaca foi empregada para as medições.
- Foi realizada a quantificação simultânea de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH.
- Inibidores e substratos específicos foram utilizados para avaliar sítios individuais de produção.
Resultados Principais
- O método permite a quantificação precisa das taxas de produção de ESP.
- As reações colaterais indesejadas foram efetivamente minimizadas.
- Os locais individuais de produção de ESP foram avaliados com sucesso.
- A abordagem fornece uma compreensão mais clara da dinâmica mitocondrial de ESP.
Conclusões
- Este método melhora a capacidade de estudar a produção de ERO mitocondrial.
- Oferece uma ferramenta confiável para pesquisadores que investigam a função mitocondrial.
- Os achados podem ter implicações para a compreensão do estresse oxidativo em células.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) a partir de enzimas mitocondriais individuais é fundamental para a validação de alvos na descoberta de fármacos relacionados ao estresse oxidativo. Este método permite a comparação direta da formação de ROS e da atividade enzimática, auxiliando na redução de riscos mecanicistas de alvos desidrogenases ligadas a flavina. Ao eliminar sistemas antioxidantes interferentes e reações laterais, fornece confiabilidade preditiva para triagem de inibidores antes de ensaios mitocondriais ou celulares mais complexos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação das taxas nativas de liberação de ERO por desidrogenases dependentes de flavina purificadas.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da medição direta da produção de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH a partir de sítios enzimáticos individuais.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao permitir a avaliação da seletividade e eficácia de inibidores na produção de ERO antes de ensaios mitocondriais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream, fornecendo leituras padronizadas e quantitativas de ERO e NADH.
- Reprodutibilidade: Utiliza fluorometria em microplacas com comprimentos de onda de excitação/ emissão definidos (NADH: 376/450 nm; resorufina: 565/600 nm) para detecção de sinal consistente.
- Escalabilidade: Permite triagem em alto rendimento de inibidores utilizando formato de placa de 96 poços com volumes de reação de 200 microlitros.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Serve como um passo intermediário para experimentos mais sofisticados com mitocôndrias isoladas ou fibras musculares permeabilizadas, estabelecendo relações de base entre espécies reativas de oxigênio (ROS) e enzimas.
- Sistema Relevante para Doenças: Utiliza o complexo da piruvato desidrogenase (PDHC) e o complexo da alfa-cetoglutarato desidrogenase (KGDHC), derivados do coração de suíno, como modelos para fontes mitocondriais de ROS relevantes para doenças metabólicas e cardiovasculares.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se as alterações observadas nas ROS decorrem da atividade da enzima-alvo ou de efeitos fora do alvo ou interferência de antioxidantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na sequência de descobrimento desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos promissores, fornecendo dados quantitativos de ERO e de atividade que orientam decisões de avanço ou interrupção antes de prosseguir para modelos fenotípicos complexos ou pré-clínicos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao isolar a produção de ESP a partir de desidrogenases ligadas a flavinas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na análise de vias metabólicas.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da detecção padronizada e simultânea da autofluorescência de NADH e da fluorescência de resorufina, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera resultados quantitativos (NADH em micromols, superóxido/peróxido de hidrogênio em picomols ao longo do tempo) que permitem o cálculo de taxas de produção para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica à continuidade pré-clínica ao definir as taxas nativas de liberação de ESP para enzimas individuais antes de testes em sistemas mitocondriais intactos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de alvos enzimáticos dependentes de flavina em diversos projetos, reduzindo o desenvolvimento redundante de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na atribuição da fonte de espécies reativas de oxigênio (ROS).
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da definição da ordem de reagentes, configurações cinéticas e separação de canais de fluorescência.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir triagem precoce de inibidores, reduzindo falhas em estágios avançados devido à toxicidade mediada por ROS não prevista.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao quantificar o potencial de produção de ROS em sítios enzimáticos individuais, orientando decisões de seleção e avanço de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em purificação de enzimas e configuração de ensaios fluorométricos, incluindo validação da pureza de desidrogenases contendo flavina por meio de coloração com comassie ou ensaios de atividade.
- Depende de leitor de microplacas capaz de realizar leituras cinéticas em duplo comprimento de onda (376/450 nm para NADH, 565/600 nm para resorufina) com controle de temperatura a 25°C.
- Necessita exclusão de agentes redutores como DTT, que podem atuar como substratos para produção de superóxido/hidrogênio peróxido e interferir nos resultados.
- Exige a preparação de soluções de trabalho em concentração 10x devido ao volume final de 200 microlitros a partir de alíquotas de 20 microlitros em placas de 96 poços.
- Envolve limitações práticas, como a necessidade de superóxido dismutase para converter superóxido em hidrogênio peróxido para detecção por meio do sistema amplex ultrared/peroxidase de rábano.
