Name: Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH em desidrogenases mitocondriais contendo flavina usando fluorometria de microplacas. Este método elimina reações laterais indesejadas e permite avaliar diretamente o potencial de produção de ROS de sítios individuais.

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Este trabalho foi financiado pelas ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). Produção de vídeo foi realizada em colaboração com o centro de inovação no ensino e aprendizagem (DIOC) na Memorial University of Newfoundland.

1. produtos químicos e enzimas purificadas
<ol><li>Adquirir os seguintes materiais: PDHC e KGDHC de origem porcina coração (ou outra flavoenzyme mitocondrial purificada); H2O2 (solução a 30%), piruvato, α-cetoglutarato, NAD+, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarose manitol, HEPES, EGTA, Ácido valérico de 3-metil-2-oxo (KMV), superóxido dismutase (SOD), peroxidase de rábano (HRP), 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.</li>
</ol>2. planejamento do ensaio e preparação dos reagentes
<ol><li>Configure o ensaio de acordo com a tabela 1 em uma placa de 96 poços. Nota: O volume total para cada reação é 200 µ l. concentrações de estoque são ajustadas de tal que 20 µ l de reagente é adicionado a cada poço. Isso garante a rápida adição de cofactores e substratos para cada reação bem antes de começar o ensaio.</li>
	<li>Prepare a solução tampão de reação com manitol 220mm, sacarose de 70 mM, 1 mM EGTA e 20 mM HEPES (pH 7,4 com HCl). Nota: Isto pode mudar dependendo das propriedades físicas de diferentes enzimas purificadas.</li>
	<li>Examine o KGDHC ou o PDHC purificada por contaminação usando a enzima atividade ensaios14,16,17 ou por immunoblot ou Coomassie mancha5.</li>
	<li>Prepare todos os reagentes no buffer de reação conforme as concentrações de solução de trabalho na tabela 1.</li>
	<li>Armazenar todos os reagentes como alíquotas de 1ml a-20 ° C. Loja de piruvato e α-cetoglutarato a-80 ° C, em alíquotas de 100 µ l para prevenir a degradação espontânea devido à auto-oxidação e congelamento-descongelamento repetidos.</li>
	<li>Preparar o reagente AUR estoque mestre em 1 mL de DMSO e então diluir a 100 µM em tampão de reação. Armazenar protegido da luz. Nota: Aqui, a solução de trabalho de 100 µM é feito fresco a cada 2 a 3 semanas e protegido da luz.</li>
</ol>3. configurar o modelo de ensaio
<ol><li>Configure o procedimento de ensaio em um leitor de microplacas monocromática com capacidades de medição dual.</li>
	<li>Defina o processo de leitura, selecionando "Protocolo". Clique em "Procedimento".</li>
	<li>Defina "Temperatura" a 25 ° C (figura 1A).</li>
	<li>Clique em "Iniciar cinético" para definir as condições de leitura (figura 1A). Defina a hora e o número de intervalos de leitura/experiências.</li>
	<li>Clique em "ler" (figura 1B). Nota: As amostras são lidos da posição superior com um ganho de 50. Tempo: 5 min, ler em intervalos de 30-s. Canal 1: Fluorescência Resorufin - excitação/emissão = 565 nm nm:600, largura do comprimento de onda de 13.5 nm. Canal 2: NADH autofluorescência - excitação/emissão = 376 nm nm:450, largura do comprimento de onda de 20 nm.</li>
	<li>Em "Leitura", selecione poços para monitor (por exemplo, A1-A4 e B1-B4).</li>
	<li>Selecione "END cinética".</li>
</ol>4. padrão curvas
<ol><li>Descongelar os reagentes e armazenar no gelo até ser necessário.</li>
	<li>
Curva padrão de NADH (Figura 2A)
	<ol>
<li>Prepare as soluções de trabalho para NADH na faixa de concentração de 0,5-10 mM de tampão de reação.</li>
		<li>Adicione 20 alíquotas µ l de cada NADH trabalhando a concentração da solução de poços que contém 180 µ l tampão de reação. A concentração final de NADH em cada bem é 0,05-1 mM.</li>
		<li>Clique em "Ler" e defina a excitação/emissão = 376 nm nm:450, largura do comprimento de onda de 20 nm. Nota: Este é um ponto de extremidade somente leitura - parâmetros cinéticos não são necessários.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curva padrão AUR (Figura 2B)
	<ol>
<li>Preparar as ações de trabalho de peróxido de hidrogênio no amortecedor da reação; intervalo de concentrações estoque de 4.000-200 nM.</li>
		<li>Adicione 120 µ l de buffer de reação a cada poço.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l de HRP (trabalhando a concentração das ações = 30 U/mL, concentração final no poço = 3 U/mL), 20 µ l de SOD (trabalhando a concentração das ações = 250 U/mL, concentração final no poço = 25 U/mL) e 20 µ l de AUR (trabalhando a concentração das ações = 100 µM concentração final no poço = 10 µM) para cada bem com tampão de reação.</li>
		<li>Adicione 20 µ l de cada H2O2 solução estoque a cada bem contendo reagentes buffer e ensaio de trabalho. O volume final da reação é de 200 µ l e a concentração final de H2O2 em cada poço é 20-400 nM.</li>
		<li>Incubar as placas por 1 min no leitor a 25 ° C.</li>
		<li>Clique em "Ler" e defina a excitação/emissão = 565 nm/600 nm, largura do comprimento de onda de 13.5 nm. Note que este é um ponto de extremidade somente leitura - parâmetros cinéticos não são necessários.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. medir O●- / h2 O2 versão2e a produção de NADH por KGDHC e PDHC
<ol><li>Ver tabela 1 para a ordem de adição dos reagentes diferentes, a concentração de cada solução de trabalho e o volume adicionado a cada poço.</li>
	<li>Adicione 40 µ l de tampão de reação a cada poço. Para os ensaios usando KMV ou CPI-613, adicione 20 µ l de buffer para cada poço.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l do PDHC ou KGDHC (estoque de trabalho de 1 U/mL, concentração final por alvéolo = 0.1 U/mL) a cada poço.</li>
	<li>Incube o PDHC e KGDHC a 25 ° C por 2 min.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de KMV (estoque de trabalho = 100 mM, concentração final = 10 mM) ou 20 µ l de CPI-613 (trabalhando a concentração das ações = 1,5 mM, concentração final = 150 µM) (tabela 2). Nota: Este passo pode ser excluído se inibidores não estão sendo usados para os ensaios.</li>
	<li>Incubar durante 1 min a 25 ° C. Nota: Este passo pode ser excluído se inibidores não estão sendo usados para os ensaios.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de HRP (trabalhando a concentração das ações = 30 unidades/mL, concentração final no poço = 3 unidades/mL) e 20 µ l de SOD (trabalhando a concentração das ações = 250 unidades/mL, concentração final no poço = 25 unidades/mL) a cada poço.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de coenzima A (trabalhando a concentração das ações = 1 mM, concentração final = 0,1 mM), 20 µ l de TPP (trabalhando a concentração das ações = 3mm, concentração final = 0,3 mM) e 20 µ l de NAD+ (trabalhando a concentração das ações = 10mm, concentração final = 1 mM) para cada w Ell.</li>
	<li>Remover o reagente AUR do revestimento protetor de papel alumínio e adicionar 20 µ l de cada poço.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de piruvato (trabalhando a concentração das ações, que varia de 1-100 mM, a concentração final para os ensaios = 0,1-10 mM) para poços contendo PDHC e α-cetoglutarato (trabalhando a concentração das ações, que varia de 1-100 mM, a concentração final para os ensaios = 0,1-10 mM) para poços contendo KGDHC.</li>
	<li>Clique em "Ler" para iniciar a medição cinética.</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>Mantenha pressionado o botão "CTRL" no teclado e clique em poços para gerar um gráfico que contém todas as medições cinéticas correspondente para o canal 1 (Figura 3A).</li>
	<li>Clique em "dados" no ícone de exibição no canto superior direito para valores brutos para unidades de fluorescência relativo (RFU) medidas nos pontos de tempo diferentes (Figura 3B).</li>
	<li>Exporte os valores para análise (tabela 3).</li>
	<li>Clique em "Graph" menu drop-down no canto superior direito (Figura 3B) para acessar valores RFU associados com o canal 2 de fluorescência.</li>
	<li>Repita as etapas de 6.1 a 6.3 para canal 2.</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li>
<li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

Não há nada para divulgar.

Este protocolo é vantajoso desde, 1) elimina quaisquer reacções concorrentes que caso contrário podem interferir com o H2O2 detecção (por exemplo, sistemas antioxidantes ou outras fontes de ROS), 2) fornece uma avaliação directa da taxa nativa de ROS de lançamento por uma desidrogenase mitocondrial contendo flavin, 3) permite a comparação do nativo ROS liberar a taxas de dois ou mais purificado desidrogenases flavin-baseado, 4) pode permitir a uma comparação direta da taxa de atividade de l...

O objetivo final do metabolismo de nutrientes é tornar trifosfato de adenosina (ATP). Em células de mamíferos, isso ocorre nas mitocôndrias, organelas double-membraned que convertem a energia armazenada em carbono em ATP. A produção de ATP começa quando o carbono é queimado pela mitocôndria formando duas transportadoras de elétrons, NADH e dinucleótido de flavina e adenina (DANIII2)1. NADH e DANIII2 são então oxidados por complexos respiratórios multi subunidade I e II, respectivamente, e os elétrons libertados são levados até o terminal do elétron aceitador oxigênio molecular (O2) no complexo IV1. A termodinamicamente favorável "ladeira abaixo" transferência de elétrons para O2 no final da cadeia é acoplada à exportação de prótons para o intermembrane espaço pelos complexos I, III e IV. Isso cria um gradiente eletroquímico transmembrana de prótons (força motriz protónica), uma forma temporária de energia livre de Gibbs que é aproveitada pelo complexo V tornar ATP2. Reações de transferência de elétrons nas mitocôndrias não são perfeitamente acopladas a produção de ATP. Em vários pontos do ciclo de Krebs e a cadeia respiratória, elétrons prematuramente podem interagir com O2 para formar ROS3. ROS mais biologicamente relevante gerado por mitocôndrias são O2● - e H2O2. Embora O2● - é muitas vezes considerado o ROS proximal formado por mitocôndrias, agora é evidente que sites de produção formam uma mistura de O2● - e H2O2, que é associado com o livre química radical de flavin prótese grupos4,5. Em níveis elevados, ROS pode ser perigoso, danificando componentes biológicos necessários para a função celular, resultando em angústia oxidativo6. No entanto, em quantidades reduzidas, ROS mitocondriais cumprir funções de sinalização vitais. Por exemplo, lançamento de H2O2 de mitocôndrias tem sido implicado no controle da ativação de células T, sinalização de stress (por exemplo, indução de vias de sinalização Nrf2), a indução da proliferação celular e diferenciação, sinalização da insulina e liberação e alimentação comportamento7. Progresso considerável tem sido feito na compreensão da função de sinalização de ROS. No entanto, importantes questões ainda permanecem em relação à qual enzimas nas mitocôndrias servem como as fontes mais importantes e como a produção é controlada.
Lançamento ROS por um site de produção depende de vários fatores: 1) a concentração da doação de elétrons do site, 2) o estado redox do site doar elétrons, 3) acesso ao oxigênio e 4) a concentração e tipo de substrato de oxidação3, 8 , 9. nas mitocôndrias, outros fatores como a concentração de NADH e membrana potencial força também influenciam a produção de ROS8,10. Por exemplo, a taxa de O2●-/ h2O2 produção purificada PDHC ou KGDHC aumenta com NADH crescente disponibilidade de5,11. Nesse cenário, os elétrons estão fluindo para trás do NADH ao centro FAD na subunidade3 E PDHC ou KGDHC, o site para O2●-/ h2O2 produção12. Da mesma forma, a prestação de NAD+ tem o efeito contrário, diminuindo a liberação ROS de KGDHC12. Assim, controlando a entrada e a saída de elétrons a partir de sites de produção de ROS pode alterar quanto2●/h2O2 é formado. Por exemplo, bloqueando a subunidade2 E PDHC ou KGDHC com CPI-613, um ácido lipoico analógico, o que resulta em uma quase 90% diminuição2●/h2O2 produção13. Resultados semelhantes podem ser obtidos com o químico S-glutathionylation catalisadores, diamido e dissulfiram, que quase abolir O2●-/ h2O2 produção pelo PDHC ou KGDHC através da conjugação de glutationa para o E 2 subunidade14. O trade-off para bloquear o fluxo de elétrons através da subunidade2 E PDHC e KGDHC é uma diminuição na produção de NADH, que diminui a formação de ROS por cadeia de transporte de elétrons (por exemplo, complexo III). Isto também pode diminuir a produção de ATP pela cadeia de transporte de elétrons. Em geral, bloqueando a entrada do elétron aos locais de produção de ROS pode ser um meio altamente eficaz de controlar O2●-/ h2O2 produção.
As mitocôndrias podem conter até 12 potencial O2●-/ h2O2 fontes6. A maioria destes sites são flavin-contendo enzimas que geram uma mistura de O2● - e H2O2. Utilização de substrato diferente e combinações do inibidor permitiram a identificação dos quais complexos respiratórios e desidrogenases mitocondriais servem como O de alta capacidade2●-/ h2O2 formando sites em diferentes tecidos3. PDHC e KGDHC foram mostrados para servir como alta capacidade2●/h2O2 sites emitindo no músculo e fígado mitocôndrias13,15. No entanto, algumas dificuldades permanecem no que se refere a análise do2●/h2O2 formando potenciais de sites individuais em mitocôndrias e o impacto que combinações de inibidor e substrato diferente em a atividade das enzimas. Isto é devido à presença de reações colaterais indesejáveis (por exemplo, formação de2●/h2O2 por sites que não sejam a enzima de interesse), contaminando nutrientes endógenos (por exemplo,graxos ácidos) ou organelas (por exemplo,, peroxissomos que também formam O2●-/ h2O2) e uso de inibidores que a falta de seletividade, e/ou uso de compostos que não inibir totalmente a produção de ROS. Certos inibidores podem também alterar a bioenergética mitocondrial e a direção do fluxo de elétrons, e isto altera a liberação ROS de outros sites de produção e confunde os resultados. Preços absolutos para O2●/h2O2 liberação de sites individuais nas mitocôndrias também são difíceis de quantificar devido à alta concentração de O2● - e H2O2 eliminando as enzimas no espaço matriz e intermembrane. Portanto, a eliminação de reações concorrentes que possam interferir com O2●-/ h2O2 lançamento medições pode ser útil quando identificando O de alta capacidade2●-/ h2O2 formando sites.
Aqui, apresentamos um método simples que permite a análise simultânea de O2●-/ h2O2 produção e formação de NADH por purificada desidrogenases dependentes de flavin. Usando enzimas purificadas, indesejados ROS formando reações colaterais e ROS enzimas degradantes podem ser eliminadas permitindo uma medida mais precisa do nativo O2●-/ h2O2 taxas de produção para flavoenzymes individual. Esse método pode ser usado para comparar diretamente os2●/h2O2 formando a capacidade de diferentes desidrogenases purificadas ou aos potenciais inibidores específicos do site de tela para O2●-/ h2O versão 2 . Finalmente, medir2●/h2O2 e a produção de NADH simultaneamente pode permitir uma avaliação em tempo real da relação entre a atividade enzimática e a capacidade de liberação ROS.

<table><tbody><tr><td>Complexo de piruvato desidrogenase</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>complexo de flavoenzima purificada</td></tr><tr><td>alfa-cetoglutarato desidrogenase</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td> solução de peróxido de hidrogênio <td>purificada de flavoenzima</td></tr><tr><td>30%</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>reagente, curvas padrão</td></tr><tr><td>NAD +</td> <td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>reagente, atividade / ensaio</td></tr> <tr><td>de liberação de ROSReagente NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>, curvas padrão</td></tr><tr><td>piruvato</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>reagente, ensaio de atividade / liberação de ROS</td></tr><tr><td>reagente alfa-cetoglutarato</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>, ensaio de atividade / liberação de ROS</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>reagente, atividade / ensaio de liberação de ROS</td></tr><tr><td>pirofosfato de tiamina</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>reagente, atividade/ensaio de liberação de ROS</td></tr>componente do amortecedor <tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td></td>do</tr> <tr><td>manitol</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td></td></tr><tr><td>componente do amortecedor sacarose</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>componente</td></tr><tr><td>do amortecedor EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td></td></tr><tr>reagente<td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>, inibidor da liberação</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>reagente sc-482709</td><td>, inibidor de liberação de ROS</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>reagente, detecção de liberação de ROS</td></tr><tr><td>peroxidase de rábano</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>reagente, detecção de liberação de ROS</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>reagente, detecção de liberação de ROS</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Biotech Synergy 2</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>leitor de microplacas para ensaios</td></tr><tr><td>Gen5 software</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>, usado para coleta de software RFU Graphpad Prism Graphpad</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> bruto<td>, análise de dados</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td><td>Software Microsoft</td><td></td><td>, análise de dados</td></tr></tbody></table>

medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de nadh por desidrogenases mitocondriais contendo flavin

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Tem sido relatado que a mitocôndria pode conter até 12 fontes enzimáticas de espécies reativas de oxigênio (ROS). A maioria desses sites incluem complexos respiratórios flavin-dependente e desidrogenases que produzem uma mistura de superóxido (O2● -) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Pode ser um desafio devido à presença de sistemas de defesa antioxidante e reações colaterais que também formam O2●-/ h2O2quantificação exata do potencial produção de ROS de sites individuais em mitocôndrias isoladas. Uso de inibidores inespecíficos que podem interromper a bioenergética mitocondrial também pode comprometer as medições alterando ROS lançamento de outros sites de produção. Aqui, apresentamos um método fácil para a medição simultânea de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) produção e lançamento de H2O2 por desidrogenases purificadas flavin-lig. Para este efeito, utilizámos purificada piruvato desidrogenase complexo (PDHC) e α-cetoglutarato desidrogenase complexo (KGDHC) de origem suína coração como exemplos. Este método permite uma medida exata de taxas lançamento2 de2O de H de nativos por sites individuais de produção, eliminando outras fontes potenciais de sistemas ROS e antioxidante. Além disso, este método permite uma comparação direta da relação entre a versão de2 H2O e atividade enzimática e o rastreio da eficácia e seletividade de inibidores para a produção de ROS. Em geral, esta abordagem pode permitir a avaliação aprofundada das taxas nativas de introdução ROS em enzimas individuais antes de conduzir experiências mais sofisticadas com mitocôndrias isoladas ou permeabilized fibra muscular.

Figura 3A fornece um traço representativo para a RFU recolhida durante a medição simultânea de H2O2 e a produção de NADH por KGDHC purificado. Os dados brutos da RFU para cada intervalo de tempo são representados na Figura 3B. Os dados brutos da RFU são então exportados para análise. Por extrapolando curvas padrão apresentadas na Figura 2, pode ser determinada a quantidade absol...

As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que podem produzir espécies reativas de oxigênio (ROS). Liberação de sites individuais nas mitocôndrias monitoramento ROS é um desafio devido às reações colaterais indesejados. Apresentamos um método fácil e barato para avaliação direta do nativas taxas para liberação ROS usando flavoenzymes purificado e microplacas fluorometry.

Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a taxa de produção de superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH de desidrogenases mitocondriais purificadas contendo flavina usando fluorometria de microplacas. A mitocôndria pode conter até 12 locais diferentes de formação de superóxido/peróxido de hidrogênio que foram identificados usando diferentes combinações de substrato e inibidor com mitocôndrias isoladas. No entanto, algumas dificuldades ainda permanecem em relação à quantificação precisa da capacidade de liberação de locais individuais de produção em mitocôndrias isoladas.E isso está associado a reações colaterais indesejadas que também produzem espécies reativas de oxigênio, mas também à presença de antioxidantes e ao uso de inibidores que carecem de especificidade, além do uso de aditivos que podem interferir nas medições. Aqui apresentamos o método para a medição simultânea de superóxido / peróxido de hidrogênio e produção de NADH por desidrogenase mitocondrial dependente de flavina purificada. Este método é vantajoso, pois pode permitir a quantificação direta e precisa do potencial de produção de ROS de locais individuais de produção, eliminando reações colaterais indese

simultaneous-measurement-superoxidehydrogen-peroxide-nadh-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções...

Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste vídeo explica como o fluxo de oxigênio é usado para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas de mamíferos. Demonstra o uso sequencial de digitonina, substratos metabólicos, ADP, um desacoplador e um inibidor para caracterizar diferentes estados respiratórios. O perfil de fluxo de oxigênio resultante revela a função mitocondrial e a eficiência do acoplamento de energia...

Medições de fluxo de oxigênio para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

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Revelando o transporte e os efeitos xenobióticos em mitocôndrias isoladas: insights de ensaios respirométricos e enzimáticos

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Aprenda a quantificar superóxido/peróxido de hidrogênio e NADH em desidrogenases mitocondriais contendo flavina usando fluorometria de microplacas. Este método elimina reações laterais indesejadas e permite avaliar diretamente o potencial de produção de ROS de sítios individuais.

Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin

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