Name: Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar células-tronco leucêmicas em leucemia mieloide aguda primária e xenotransplantes derivados de pacientes usando citometria de fluxo. Este método padronizado é aplicável em laboratórios de hematologia/oncologia comuns.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado em parte pelo francês Associação Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centro Norte), Fondation de France (Comité de leucemia), Oncolille SIRIC e francês National Cancer Institute.

Seguimos padrões europeus para a utilização de animais para fins científicos. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local (#3097-2015120414583482v3).
1. preparação da amostra
<ol><li>Colete a medula óssea (2 mL) de novo de LMA em tubos contendo o ácido etilenodiaminotetracético anticoagulante (EDTA) em uma concentração de 1,8 mg / mL de medula óssea.</li>
	<li>Execute Ficoll, separação uma densidade gradiente para isolar células mononucleares de eritrócitos e granulócitos, como se segue. Diluir a medula óssea em 3 volumes de solução salina de tampão fosfato (PBS: NaCl 137 mM KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10mm, KH2PO4 1,8 mM). Cuidadosamente sobreposição de 1 volume de Ficoll com 1 volume de diluídos da medula óssea. Rotação de 30 minutos a 300 x g sem freio. Transferi a camada de jaleco branco buffy de células mononucleadas em um tubo estéril de novo.</li>
	<li>Lavar as células duas vezes em 10 mL de PBS) e centrifugar a 300 x g, durante 5 min, a fim de remover contaminantes componentes do soro.</li>
</ol>2. lise dos glóbulos vermelhos (RBC)
<ol><li>Adicionar 2 mL de tampão de lise (0,8% de cloreto de amônio) para a célula de Pelotas, vórtice suavemente e incubar a temperatura ambiente por 5 min. centrifugar a 300 x g durante 5 min. Nota: se necessário, repita este passo.</li>
	<li>Células de lavagem em PBS como descrito anteriormente (1.3.).</li>
</ol>3. o paciente derivada xenografts.
<ol><li>Obter a explosão células da medula óssea após a separação de Ficoll e após depleção de linfócitos usando Fima negativo seleção (CD3 para T- e CD20 de linfócitos B). Siga as instruções do fabricante.</li>
	<li>5 x 106 AML blastos Injete na veia da cauda de ratos NSG incondicionadas. Use um dispositivo de restrição para facilitar a injeção de veia da cauda. Manter ratos em condições convencionais e especialmente sob condições específicas do patógeno-livre em todos os vezes, usando gaiolas individuais de ventilada e manipulação sob capa de fluxo laminar. Cada duas semanas, leva 60 µ l de sangue pelo método submandibular coleção usando um hematócrito capilar. Lugar do capilar em um 5 mL tubo de fundo redondo. Pare o sangramento aplicando pressão suave, usando uma pequena gaze estéril. Eliminar sangue com uma seringa limpa.</li>
	<li>Adicionar 1ml de tampão de Lise e incubar durante 5min. Em seguida centrifugar a 300 x g, durante 5 min. lavagem com PBS e centrifugre a 300 x g durante 5 minutos. Remover o sobrenadante, a adicionar 100 µ l PBS com 10% albumina de soro bovino (BSA) mancha com 3 µ l ser anti-humano CD45-FITC e anti-murino 1 µ l CD45-APC e incubar a 4 ° C por 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugado de lavar duas vezes em PBS (2 mL) com 10% de BSA e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Alíquota até a 1 x 106 células por 100 µ l de PBS para tubos de citometria de fluxo.</li>
	<li>Enxertia de pesquisa a cada duas semanas por análise de quimerismo de expressão de CD45 (humano contra murino) usando citometria de fluxo (Figura 2A e B).</li>
	<li>Sacrifício (contagem periférica de explosão maior que 70% ou graves sinais clínicos de doença), coletar células mononucleares de explosão de baços esmagados e da medula óssea por rubor tíbias e fêmures com PBS como descrito anteriormente13. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical, seguindo diretrizes internacionais.</li>
	<li>Se centrifugado contém RBC, realize a Lise das células vermelhas do sangue com tampão de lise (passo 2.1).</li>
	<li>Pellet de células de lavar duas vezes em PBS (2 mL) com 10% de BSA e centrifugar 300 x g por 5 minutos.</li>
	<li>Colete células e alíquota acima de 1 x 106 células por 100 µ l de PBS em tubos de citometria de fluxo.</li>
</ol>4. coloração
<ol><li>Adicione o vórtice e anticorpos conjugados (ver passo 4.2). Incube as células durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Use o painel seguinte para humana primária ou amostras PDX, consistindo de 10 µ l de anti-CD36-FITC, 5 µ l de anti-CD19-ECD, 5 µ l de anti-CD33-PC5.5, 5 µ l de anti-CD90-APC, 5 µ l de anti-CD34-AA700, 5 µ l de anti-CD45RA-APC-H7, 5 µ l de anti-CD38-Pacific Blue, 5 µ l de anti-CD123-PC7 e 2,5 µ l de anti-CD45-KO.</li>
	<li>Remova anticorpos desacoplados lavando as células em 2 mL de PBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Ressuspender as células em 450 µ l de PBS para análise de final fluxo cytometric.</li>
</ol>5. gating estratégia para análise de citometria de fluxo
<ol><li>Realize a aquisição de dados (pelo menos 500.000 células) em um citômetro de fluxo equipado com lasers vermelhos, azuis e violetas. Verifique as configurações de citômetro diariamente para alinhamento 1) óptico, sistema 2) fluídico, sensibilidade 3) óptica e 4) padronização usando fluorospheres</li>
	<li>Siga a estratégia associada sequencial para definir a expressão de CD38 (Figura 1).<ol>
<li>Use células de amostras normais da medula óssea para definir hematogones ou células plasmáticas, que servirá como controle positivo para a expressão de CD38. Nota: este portal é especialmente importante para avaliar como populações de LSC putativos subsequentes dependem de sua definição.</li>
		<li>Defina células precursores fisiológica (normais blastos) pelos critérios de população de baixa CD45dim/SSC (dispersão lateral) (figura 1A). Dentro dessa população de explosão, definir hematogones, que exibem uma CD38 + + CD19 + fenótipo (figura 1B) e finalmente, usar expressão CD36 e CD33 definir mieloblastos e monoblastos eritroblastos (Figura 1). Determine a expressão de CD34 na hematogones como mostra a (Figura 1E). Avalie várias subpopulações de precursores dentro os blastos definidos como P6-P10 (Figura 1). Separe o compartimento de CD34 de blastos em P6, P7, P8 subpopulações de progenitor baseadas na predefinição gates CD38. Certifique-se de que o compartimento P8 contém as explosões que têm a mesma intensidade de CD38 como o hematogones, que P6 inclui células que são CD38-baseado na fluorescência CD38 menos um controle (FMO) e que as células de P7 são entre os dois extremos no que se refere a CD38 expressão (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>O CD34 + 38-(P6) células gated, separar HSC LSC putativa usando CD90 e CD45RA expressão (Figura 1F). Nota: o fenótipo HSC é CD34 + CD38-CD45RA + CD90- e os progenitores multipotentes (MPP) são definidos como CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. O fenótipo LSC putativo é CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + e a população a jusante mais imatura são os progenitores linfoides-carregado (LMPP) definidos como CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>6. MRD monitoramento por RT-PCR
<ol><li>Monitorar níveis MRD por RT-PCR, conforme descrito anteriormente,14.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Uma avaliação precisa e reprodutível de membrana ou marcadores citoplasmáticos por citometria de fluxo requer que os ajustes do instrumento são verificados todos os dias para alinhamento óptico, adequado funcionamento do sistema fluídico, sensibilidade óptica e padronização usando contas de calibração.
Detecção de populações de células de explosão na LMA CD90 e CD45RA usando análise de citometria de fluxo multi paramétrico é um método relativamente simples e confiável. Um passo crítico nesta a...

Leucemia mieloide aguda (LMA) é a causa mais comum de mortalidade associada a leucemia. Inicialmente, a AML é uma doença clonal de células-tronco hematopoiéticas (HSC) caracteriza-se pela detenção de diferenciação, subsequente acúmulo de blastos e reduziu a produção de elementos funcionais hematopoiéticas. Recentemente, clonal heterogeneidade da população celular explosão estabeleceu essencialmente usando estratégias de sequenciamento (NGS) na próxima geração e demonstrar a existência de evolução intra clonal de células de tumor1.
Heterogeneidade estende-se à presença de células leucêmicas (LSC). Supor que este compartimento celular dinâmico evolui para superar várias pressões de seleção impostas durante o tratamento e a progressão de leucemia. Portanto, LSC são suposto ser resistente aos regimes quimioterápicos atuais e mediar a recaída da doença, com profundas implicações clínicas2. Vários marcadores têm sido descritos para caracterizar LSC como CD1233, CLL-14, CD975 ou TIM-36. O CD34 + CD38-compartimento de blastos é considerado para ser enriquecido para LSC7 mas também inclui o HSC normal. CD90 e CD45RA expressão aplicada para o CD34 + CD38-compartimento (P6) (Figura 1) permite segregar os vários estágios de precursores hematopoiéticos normais e malignas8. Especificamente, normais CD34 + CD38-CD45RA + CD90-linfócitos, multipotentes progenitores (MPP) como as células CD34 + CD38-CD90dimCD45RA e CD34 + CD38-CD90-CD45RA + células progenitoras multipotentes linfoides-carregado (LMPP) podem ser determinadas na maioria dos AML casos8 ,9. A intensidade de fluorescência média (IFM) do CD38 é particularmente importante a ser considerado dentro do compartimento de células CD34 +. Porque CD38 intensidade define três compartimentos celulares novo respectivas: CD38 negativo (P6), CD38 ofuscante (P7) e brilhante CD38 (P8) (Figura 1). O IFM de CD38 podem ser determinadas usando hematogones e/ou células de plasma como um controle interno positivo, como estas células expressam fortemente CD38.
O modelo do ratonula (NSG) NOD/SCID/IL2Rγc imunodeficientes é amplamente utilizado para enxertia de normal e hematopoiético maligno humanos células10,11. Ensaios de Xenoenxerto serial são usados para validar experimentalmente LSC ou HSC função. Estes estudos foram analisados extensivamente por abordagens de sequenciamento em larga escala. No entanto, menos é sabido sobre a LSC e HSC imunofenótipo de população de explosão AML incorporada em camundongos NSG comparados com sua LMA primária (Figura 2).
Os números da LSC são inerentemente baixos assim, identificação e quantificação da LSC são desafiadores e o método descrito aqui pode ser usado como um ensaio de cytometric do fluxo, no diagnóstico e no acompanhamento clínico para avaliar a resposta de quimioterapia (como LSC residual pode causa recidiva da LMA). A presença de LSC pode indicar doença residual mínima positiva (MRD). Até à data, MRD monitoramento principalmente na LMA dependem de métodos moleculares (i.e., RT-PCR, NGS)10,12. No entanto, neste protocolo detectarmos expressão de proteínas simultâneo de vários marcadores HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) em células de explosão primárias da LMA humana por citometria de fluxo Multiparamétrico2,8,9. Esta combinação de anticorpos pode ser aplicada em qualquer laboratório de citometria de fluxo padrão e este ensaio do MRD de fluxo é particularmente interessante quando MRD por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) não é possível, ou seja, se moleculares específicos de leucemia marcadores não são detectáveis na amostra de LMA de diagnóstico. Além disso, este protocolo, é complementar as técnicas mais sensíveis de MRD moleculares, vez que visa detectar e quantificar as células progenitoras hematopoiéticas anormal que representa uma característica funcional da célula (Figura 3).
Nós mostramos como quantificar a três populações de progenitoras hematopoiéticas e o compartimento de LSC putativo com diferentes graus de maturação por citometria de fluxo com anticorpos disponíveis na maioria dos laboratórios clínicos. Além disso, nós confirmou a presença desses compartimentos celulares no correspondentes paciente-derivada-xenografts (PDX) e no tratamento de acompanhamento.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de hemácias (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>solução de lise de hemácias A: 8,29 g de NH4Cl + 0,037 g de Na2EDTA em 100 mL de solução estéril de H2O e lise de hemácias B: 1 g de KHCO3 em 100 mL de H2O</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2R&gamma estéril; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; ratos</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>Nº de estoque: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco da life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - Tampão de Separação</td><td>MACS Tampão MACS Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (clone 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Set</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep kit de seleção de PE humano</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; ímã&nbsp;</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

fluxo cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Leucemia mieloide aguda (LMA) é uma heterogênea e se não tratada, a doença fatal. É a causa mais comum de mortalidade associada a leucemia em adultos. Inicialmente, LMA é uma doença das células-tronco hematopoiéticas (HSC) caracteriza-se pela detenção de diferenciação, subsequente acúmulo de células de leucemia blast e reduziu a produção de elementos funcionais hematopoiéticas. Heterogeneidade que se estende para a presença de células-tronco leucemia (LSC), com esta dinâmica celular compartimento evoluindo para superar várias pressões de seleção imposta durante o tratamento e a progressão de leucemia. Para definir ainda mais a população do LSC, a adição de CD90 e CD45RA permite a discriminação dos linfócitos normais e progenitoras multipotentes dentro do compartimento de células CD34 + CD38. Aqui, nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de vários marcadores LSC putativos (CD34, CD38, CD45RA, CD90) em células de explosão primárias da LMA humana por citometria de fluxo Multiparamétrico. Além disso, mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts. Este método de deteção e quantificação da LSC putativa podem ser utilizados para o acompanhamento clínico da resposta de quimioterapia (i. e., doença residual mínima), como LSC residual pode causar recidiva da LMA.

Aqui nós apresentamos um método para determinar as populações do progenitor em amostras de medula óssea humana normal e maligno. Nós coletadas da medula óssea e baço de um bem sucedido PDX e realizada citometria de fluxo Multiparamétrico conforme descrito acima. Nós comparamos várias subpopulações de blastos entre amostra do diagnóstica do paciente e o correspondente PDX e particularmente, o compartimento de CD34 + CD38-progenitoras, notavelmente enriquecidos no LSC putativa. Achamos que a fração de CD34 + CD38-explosão ...

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

O objetivo geral deste procedimento é estimar as células-tronco da leucemia na leucemia mielóide aguda e em xenoenxertos derivados do paciente por citometria de fluxo no diagnóstico e no acompanhamento do tratamento. Este método pode responder a questões-chave no campo da hematologia/oncologia, como a relevância clínica da avaliação quantitativa de células-tronco leucêmicas por citometria de fluxo na leucemia mieloide aguda. A principal vantagem dessa técnica é que ela é aplicável à maioria dos laboratórios de hematologia/oncologia com anticorpos comumente usados.Este procedimento será demonstrado por Thomas, um pós-doutorado, Fanny, uma estudante de pós-graduação, e Adeline, uma engenheira do meu laboratório. Para começar, colete dois mililitros de medula óssea de AML de novo em tubos contendo 1,8 miligramas por mililitro do anticoagulante EDTA. Isole as células mononucleares dos glóbulos vermelhos e granulócitos diluindo primeiro a medula óssea em três volumes de PBS.Em seguida, cubra cuidadosamente um volume de ficol com um volume de medula óssea diluída. Gire o gradiente de densidade em 300g por 30 minutos sem interrupção. Em seguida, transfira a camada de revestimento branco de células mononucleadas para um novo tubo estéril.Para remover os sobrenadantes que contaminam os componentes do soro, adicione 10 mililitros de PBS e centrifugue as células a 300g por cinco minutos antes de repetir a lavagem. Lise os glóbulos vermelhos adicionando dois mililitros de tampão de lise ao pellet celular e vore suavemente. Em seguida, incube as células em temperatura ambiente por cinco minutos.Centrifugue as células a 300g por cinco minutos e remova o sobrenadante. Em seguida, use PBS para lavar as células. Depois de isolar as células blásticas da medula óssea de acordo com o protocolo de texto, sob uma capa de fluxo laminar, insira um camundongo NSG não condicionado em um dispositivo de contenção e injete cinco vezes 10 nas sextas células blásticas da LMA na veia da cauda.Retorne o camundongo a uma gaiola individual ventilada sob condições convencionais e específicas livres de patógenos. A cada duas semanas, use um método de coleta submandibular com um capilar de hematócrito para coletar 60 microlitros de sangue. Transfira o capilar para um tubo de cinco mililitros e, em seguida, com uma gaze estéril, aplique uma leve pressão para estancar o sangramento.Adicione um mililitro de tampão de lise ao tubo e bata suavemente. Em seguida, incube as células em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugue as células a 300g por cinco minutos.Em seguida, após remover o sobrenadante, adicione 100 microlitros de PBS com 10% BSA, três microlitros de FIT CD45 anti-humano, incube por 30 minutos. Em seguida, lave o pellet celular duas vezes em PBS, dois mililitros, com 10% de BSA e centrifugue a 300g por cinco minutos. A cada duas semanas, use citometria de fluxo para analisar o enxerto por análise de quimerismo da expressão de CD45 humano versus murino.Quando a contagem de blastos for superior a 70% ou forem observados sinais clínicos graves de doença, sacrifique o animal e colete células blásticas mononucleares de um baço esmagado e da medula óssea usando PBS para lavar tíbias e fêmures, conforme descrito anteriormente. Para realizar a coloração do painel, combine anticorpos conjugados com amostras de xenoenxerto primário humano ou derivado do paciente, ou PDX, e faça um vórtice dos tubos. Em seguida, incube as células no escuro em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos.Remova os anticorpos não ligados usando dois mililitros de PBS para lavar as células. Ressuspenda as células em 450 microlitros de PBS e, em seguida, prossiga para a análise de citometria de fluxo e monitoramento de MRD. Para avaliar com precisão e reprodutibilidade a membrana dos marcadores citoplasmáticos por citometria de fluxo, verifique o alinhamento óptico.O ajuste adequado do sistema 3D e a sensibilidade óptica e estomatização usando a calibração de estomazina batem todos os dias. Use medula óssea normal para definir os portões para CD38. São necessários um mínimo de 500.000 eventos e verifica-se que cada fluxo é regular e homogêneo.Além disso, os gibões, bem como as células mortas e os detritos celulares são eliminados. As células hematopoiéticas imaturas são definidas por serem intermediárias CD45, SSC baixas. E o controle CD38 positivo ou hematogônico, são CD19/CD38 duplamente positivo.Em seguida, P8 ou CD38 positivo, P7 ou CD38 intermediário e P6 ou CD38 negativo são definidos. As células P6 podem ser subdivididas em HSC, MPP e LSC. Por ser uma medula óssea normal, é LSC negativo.Usando citometria de fluxo multiparamétrica, verificou-se que a fração blástica CD34 positiva e CD38 negativa foi maior no PDX em comparação com a amostra diagnóstica do paciente. Curiosamente, uma porcentagem maior de LSC putativo foi encontrada no PDX em comparação com a amostra primária do paciente, sugerindo um possível enriquecimento de células progenitoras malignas nos tecidos hematológicos neste modelo de camundongo. Após a comparação das populações de progenitores blóticos em duas amostras diferentes de pacientes, a fração CD34 positiva e CD38 negativa aumentou de 0,06% no diagnóstico para 3,33% no primeiro acompanhamento do tratamento no primeiro paciente.Em contraste, a fração CD34 positiva e CD38 negativa diminuiu no segundo paciente de 7,8% no diagnóstico para 2,27% no primeiro acompanhamento do tratamento. Consequentemente, a fração LSC putativa aumentou no primeiro paciente de 0% no diagnóstico para 0,65% e diminuiu no segundo paciente de 6,57% no diagnóstico para 1,44% no acompanhamento do tratamento. O monitoramento mínimo da doença residual ou MRD, usando como marcadores moleculares a mutação NPM1 no paciente um e a fusão do gene CBF-beta MYH11 para o paciente dois, mostrou que o MRD molecular diminuiu menos no primeiro paciente em comparação com o segundo paciente para o primeiro ponto de acompanhamento do tratamento.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante verificar as configurações de citometria de fluxo e a medição de CD38. Após este procedimento, métodos adicionais podem ser realizados, como classificação de células por citometria de fluxo, a fim de responder a perguntas adicionais, como avaliação funcional de células-tronco de leucemia.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar e quantificar células-tronco de leucemia em amostras de pacientes em xenoenxertos derivados de pacientes. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de pacientes pode ser perigoso e precauções como diretrizes do GOP e procedimentos de segurança institucional devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

flow-cytometry-to-estimate-leukemia-stem-cells-primary-acute-myeloid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Aqui, um método baseado em citometria de fosfofluxo é descrito para analisar a sinalização a jusante das vias mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide humana aguda xenoenxertadas em camundongos e obtidas de aspirados de medula óssea. Os níveis de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 são medidos simultaneamente usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade.

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.

In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

Aprenda a quantificar células-tronco leucêmicas em leucemia mieloide aguda primária e xenotransplantes derivados de pacientes usando citometria de fluxo. Este método padronizado é aplicável em laboratórios de hematologia/oncologia comuns.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até (Vídeo) | JoVE Journal

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Explorar mais vídeos