Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

O objetivo geral deste procedimento é estimar as células-tronco da leucemia na leucemia mielóide aguda e em xenoenxertos derivados do paciente por citometria de fluxo no diagnóstico e no acompanhamento do tratamento. Este método pode responder a questões-chave no campo da hematologia/oncologia, como a relevância clínica da avaliação quantitativa de células-tronco leucêmicas por citometria de fluxo na leucemia mieloide aguda. A principal vantagem dessa técnica é que ela é aplicável à maioria dos laboratórios de hematologia/oncologia com anticorpos comumente usados.

Este procedimento será demonstrado por Thomas, um pós-doutorado, Fanny, uma estudante de pós-graduação, e Adeline, uma engenheira do meu laboratório. Para começar, colete dois mililitros de medula óssea de AML de novo em tubos contendo 1,8 miligramas por mililitro do anticoagulante EDTA. Isole as células mononucleares dos glóbulos vermelhos e granulócitos diluindo primeiro a medula óssea em três volumes de PBS.

Em seguida, cubra cuidadosamente um volume de ficol com um volume de medula óssea diluída. Gire o gradiente de densidade em 300g por 30 minutos sem interrupção. Em seguida, transfira a camada de revestimento branco de células mononucleadas para um novo tubo estéril.

Para remover os sobrenadantes que contaminam os componentes do soro, adicione 10 mililitros de PBS e centrifugue as células a 300g por cinco minutos antes de repetir a lavagem. Lise os glóbulos vermelhos adicionando dois mililitros de tampão de lise ao pellet celular e vore suavemente. Em seguida, incube as células em temperatura ambiente por cinco minutos.

Centrifugue as células a 300g por cinco minutos e remova o sobrenadante. Em seguida, use PBS para lavar as células. Depois de isolar as células blásticas da medula óssea de acordo com o protocolo de texto, sob uma capa de fluxo laminar, insira um camundongo NSG não condicionado em um dispositivo de contenção e injete cinco vezes 10 nas sextas células blásticas da LMA na veia da cauda.

Retorne o camundongo a uma gaiola individual ventilada sob condições convencionais e específicas livres de patógenos. A cada duas semanas, use um método de coleta submandibular com um capilar de hematócrito para coletar 60 microlitros de sangue. Transfira o capilar para um tubo de cinco mililitros e, em seguida, com uma gaze estéril, aplique uma leve pressão para estancar o sangramento.

Adicione um mililitro de tampão de lise ao tubo e bata suavemente. Em seguida, incube as células em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugue as células a 300g por cinco minutos.

Em seguida, após remover o sobrenadante, adicione 100 microlitros de PBS com 10% BSA, três microlitros de FIT CD45 anti-humano, incube por 30 minutos. Em seguida, lave o pellet celular duas vezes em PBS, dois mililitros, com 10% de BSA e centrifugue a 300g por cinco minutos. A cada duas semanas, use citometria de fluxo para analisar o enxerto por análise de quimerismo da expressão de CD45 humano versus murino.

Quando a contagem de blastos for superior a 70% ou forem observados sinais clínicos graves de doença, sacrifique o animal e colete células blásticas mononucleares de um baço esmagado e da medula óssea usando PBS para lavar tíbias e fêmures, conforme descrito anteriormente. Para realizar a coloração do painel, combine anticorpos conjugados com amostras de xenoenxerto primário humano ou derivado do paciente, ou PDX, e faça um vórtice dos tubos. Em seguida, incube as células no escuro em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos.

Remova os anticorpos não ligados usando dois mililitros de PBS para lavar as células. Ressuspenda as células em 450 microlitros de PBS e, em seguida, prossiga para a análise de citometria de fluxo e monitoramento de MRD. Para avaliar com precisão e reprodutibilidade a membrana dos marcadores citoplasmáticos por citometria de fluxo, verifique o alinhamento óptico.

O ajuste adequado do sistema 3D e a sensibilidade óptica e estomatização usando a calibração de estomazina batem todos os dias. Use medula óssea normal para definir os portões para CD38. São necessários um mínimo de 500.000 eventos e verifica-se que cada fluxo é regular e homogêneo.

Além disso, os gibões, bem como as células mortas e os detritos celulares são eliminados. As células hematopoiéticas imaturas são definidas por serem intermediárias CD45, SSC baixas. E o controle CD38 positivo ou hematogônico, são CD19/CD38 duplamente positivo.

Em seguida, P8 ou CD38 positivo, P7 ou CD38 intermediário e P6 ou CD38 negativo são definidos. As células P6 podem ser subdivididas em HSC, MPP e LSC. Por ser uma medula óssea normal, é LSC negativo.

Usando citometria de fluxo multiparamétrica, verificou-se que a fração blástica CD34 positiva e CD38 negativa foi maior no PDX em comparação com a amostra diagnóstica do paciente. Curiosamente, uma porcentagem maior de LSC putativo foi encontrada no PDX em comparação com a amostra primária do paciente, sugerindo um possível enriquecimento de células progenitoras malignas nos tecidos hematológicos neste modelo de camundongo. Após a comparação das populações de progenitores blóticos em duas amostras diferentes de pacientes, a fração CD34 positiva e CD38 negativa aumentou de 0,06% no diagnóstico para 3,33% no primeiro acompanhamento do tratamento no primeiro paciente.

Em contraste, a fração CD34 positiva e CD38 negativa diminuiu no segundo paciente de 7,8% no diagnóstico para 2,27% no primeiro acompanhamento do tratamento. Consequentemente, a fração LSC putativa aumentou no primeiro paciente de 0% no diagnóstico para 0,65% e diminuiu no segundo paciente de 6,57% no diagnóstico para 1,44% no acompanhamento do tratamento. O monitoramento mínimo da doença residual ou MRD, usando como marcadores moleculares a mutação NPM1 no paciente um e a fusão do gene CBF-beta MYH11 para o paciente dois, mostrou que o MRD molecular diminuiu menos no primeiro paciente em comparação com o segundo paciente para o primeiro ponto de acompanhamento do tratamento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante verificar as configurações de citometria de fluxo e a medição de CD38. Após este procedimento, métodos adicionais podem ser realizados, como classificação de células por citometria de fluxo, a fim de responder a perguntas adicionais, como avaliação funcional de células-tronco de leucemia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar e quantificar células-tronco de leucemia em amostras de pacientes em xenoenxertos derivados de pacientes. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de pacientes pode ser perigoso e precauções como diretrizes do GOP e procedimentos de segurança institucional devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.