Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

O objetivo geral deste procedimento é realizar com sucesso uma microinjeção em embriões de nasonia vitripennis para facilitar a manipulação genômica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas à biologia da nasonia vitripennis, como na produção de veneno e na determinação do sexo. A principal vantagem de usar essa técnica é que ela permite a manipulação direta do genoma da vespa e oferece uma ampla variedade de modificações genômicas avançadas.

Demonstrando o procedimento estará Ming Li, um pós-doutorado do nosso laboratório. Para começar, monte várias colônias de N. vitripennis colocando de 200 a 500 adultos com uma proporção de três para um de fêmeas para machos em gaiolas de dormitórios de insetos. Mantenha as vespas a 25 graus Celsius para mais ou para menos com 30% de umidade relativa e um ciclo claro/escuro de 12 a 12.

Por dois dias, permita que as fêmeas acasaladas se alimentem de pupas frescas de S. bullata, bem como pequenas gotículas de uma solução de água de sacarose de um a dez volumes. Nos dois dias seguintes, remova as pupas da mosca varejeira para privar as vespas fêmeas de um local de oviposição, tornando-as muito grávidas. Para manter os hospedeiros de pupas de S.bullota frescos, armazene-os a 4 graus Celsius imediatamente após obtê-los e remova-os apenas quando necessário.

Diferencie entre hospedeiros jovens que têm um pupário de cor vermelha e hospedeiros mais velhos que têm um pupário de cor mais escura. Permita que as vespas fêmeas parasitem o hospedeiro jovem, colocando pupas individuais frescas de S.bullata em uma rolha de espuma com um orifício do tamanho de pupas cortado no centro. Para concentração máxima de parasitização e coleta de embriões mais fácil, exponha apenas cerca de 0,2 centímetros da extremidade anterior do hospedeiro, que é arredondada, em comparação com a extremidade posterior, que é mais espessa e contém uma abertura semelhante a uma cratera.

Coloque as pupas hospedeiras neste arranjo na gaiola e espere cerca de 45 minutos para permitir que as vespas as parasitem. Remova os hospedeiros parasitados recuperando-os manualmente e batendo suavemente ou soprando quaisquer vespas residuais. Substitua-os por hospedeiros frescos aproximadamente a cada 15 minutos para continuar coletando os óvulos em estágio inicial durante as injeções.

Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça para descascar cuidadosamente a extremidade posterior do pupário externo de um hospedeiro recém-parasitado para expor os ovos de N. vitripennis. Em seguida, prepare uma lâmina de alinhamento de embriões usando adesivo líquido para colar uma lamínula em uma lâmina de vidro limpa. Com um pincel úmido de ponta fina, escove cuidadosamente os embriões do hospedeiro, certificando-se de não danificar a pele macia e pupal do hospedeiro.

Em seguida, com o pincel úmido, transfira aproximadamente 20 embriões, um a um, para a lâmina, imediatamente adjacente ao lado da lamínula. Oriente a extremidade anterior do embrião contra a borda da lâmina de cobertura, de modo que as extremidades posteriores do embrião fiquem apontadas na mesma direção. Isso permitirá uma maior precisão de injeção na mesma posição entre todos os embriões.

Depois de puxar as agulhas de injeção de acordo com o protocolo de texto, chanfre a ponta da agulha tocando levemente a ponta em uma placa abrasiva de diamante a 25 graus Celsius por aproximadamente 10 segundos. Preparar a mistura injectável constituída por reagentes de modificação do genoma e mantê-la congelada. Use uma ponta de microcarregador para carregar a agulha de injeção com dois microlitros de mistura de injeção.

Em seguida, coloque a lâmina de vidro com os embriões alinhados no palco de um microscópio composto. Insira cuidadosamente a agulha na extremidade posterior do embrião com um ângulo vertical de 25 a 35 graus. Em seguida, injete de um a cinco picolitros da mistura de injeção e certifique-se de que o embrião incha ligeiramente com a injeção.

Se ocorrer entupimento, tente chanfrar novamente as agulhas. O citoplasma dos embriões de N. vitripennis é incomumente viscoso e pegajoso, o que leva ao entupimento frequente da agulha. Injete aproximadamente 20 a 40 óvulos de cada vez e pare.

Transfira os ovos injetados com um pincel úmido tocando levemente nos ovos injetados e coloque-os em um hospedeiro. Em seguida, continue injetando, usando um lote de ovos frescos e recém-postos. Idealmente, esta etapa é mais eficaz quando uma pessoa está coletando e alinhando óvulos, enquanto outra pessoa está injetando componentes de modificação do genoma e transplantando embriões injetados em pupas hospedeiras.

Após a microinjeção, use um pincel úmido para colocar cuidadosamente até 40 embriões G zero injetados, um de cada vez, em pupas de S.bullata previamente picadas. Coloque as pupas hospedeiras em uma placa de Petri com papel de filtro úmido e bolas de algodão e incube-as a 25 graus Celsius com aproximadamente 70% de umidade até que os embriões injetados eclodam em cerca de um a dois dias. É importante ressaltar que os hospedeiros podem ficar com um pupário descascado, e os ovos de N. vitripennis se desenvolverão normalmente, desde que sejam incubados em uma câmara umidificada para evitar a dessecação.

Após a eclosão dos embriões G zero, transfira as pupas hospedeiras para uma nova placa de Petri e incuba-as a 25 graus Celsius e 70% de umidade. Monitore as pupas do hospedeiro e as larvas G zero injetadas diariamente. Se as pupas do hospedeiro tiverem um cheiro desagradável, transfira as larvas injetadas para novas pupas hospedeiras saudáveis.

Para penetração eficaz da agulha e microinjeção em embriões de N. vitripennis, diferentes extratores de micropipeta foram testados com vários tipos de agulhas de vidro capilar com filamentos, incluindo quartzo, aluminossilicato e borossilicato, para ter uma ponta longa semelhante a hipodérmica desejada, eficaz para microinjeção de embriões de N. vitripennis. Os componentes de modificação do genoma usados aqui foram RNAs guia mistos e proteína cas9 para edição de genoma mediada por crisper. Neste experimento, um sgRNA direcionado ao gene cinábrio foi injetado em quantidades variadas, juntamente com a proteína cas9, em N. vitripennis.

Esta tabela mostra que as taxas de sobrevivência foram dependentes da dose, pois o aumento da concentração de sgRNA e proteína cas9 levou à diminuição das taxas de sobrevivência. Ao tentar este procedimento, é importante tomar cuidado para não perfurar nem dessecar os embriões de vespas durante a manipulação ou transferência, usando cuidadosamente um pincel umedecido de ponta fina ou um palito de embriões. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como recuperar, microinjetar e transplantar embriões de vespas com eficiência para realizar com sucesso modificações avançadas no genoma.