Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma maneira viável de obter células do epitélio pigmentar da retina de olhos de camundongos e cultivá-las in vitro, mantendo suas propriedades originais. Este método ajudará os pesquisadores de RPE a obter habilidades de dissecação necessárias para o estabelecimento de culturas de células de RPE de camundongos e a demonstrar como fazer isso de maneira fácil. A principal vantagem desse procedimento é que ele é simples e viável.

A única coisa necessária é a prática, e a demonstração visual do isolamento do EPR e da microscopia demonstra literalmente como obter as habilidades necessárias. Para isolar os globos oculares dos camundongos, primeiro eutanasiar dois camundongos usando qualquer método aprovado e, usando luvas, coloque-o em uma almofada absorvente. Posicione o polegar e o indicador ao redor do olho e empurre suavemente a pele para projetar o globo ocular.

Uma vez que o globo ocular esteja saliente, coloque a ponta de uma tesoura angular entre a pele e o globo ocular e corte cuidadosamente o tecido ao redor do olho até que ele seja liberado. Em seguida, mergulhe brevemente o olho isolado no etanol a 70% e mergulhe-o em PBS em uma placa de Petri. Depois de coletar os dois olhos de cada um dos camundongos, prossiga com a dissecação.

Sob o microscópio de dissecação, remova cuidadosamente a maior parte do tecido conjuntivo ao redor do olho. Não é necessário manter o olho submerso durante esta etapa. Para fazer isso, use uma pinça de sutura para levantar os tecidos conjuntivos do globo ocular e corte-os com uma tesoura Vannas.

Não corte a esclera porque é praticamente impossível obter as oculares posteriores intactas se a esclera for cortada. Depois de limpar o tecido conjuntivo, mergulhe os globos oculares em PBS e passe a trabalhar em um gabinete de fluxo laminar em condições estéreis. Agora, use uma pinça para transferir os olhos para um prato de DMEM quente contendo uma alta concentração de glicose.

Após 20 a 30 segundos, substitua a solução de lavagem por aspiração para uma segunda lavagem. Transfira os globos oculares para a solução de trabalho 2%Dispase II aquecida em tubos de 15 mL e deixe os olhos incubarem a 37 graus Celsius por 45 minutos para dissociar. Após a incubação, os globos oculares devem ser macios.

Em seguida, lave os olhos duas vezes no mesmo recipiente com meio de crescimento aquecido. Após a segunda lavagem, substitua o meio de crescimento por meio fresco e transfira os globos oculares e o meio para um novo prato para continuar a dissecção. Continue trabalhando em uma bancada limpa com a ajuda de um microscópio de dissecação.

Comece a dissecção prendendo o olho com uma pinça e faça uma incisão ao redor da ora serrata usando uma tesoura Vannas. Mantendo o globo ocular na solução, remova cuidadosamente a córnea anterior, estendendo o corte ao redor da circunferência da ora serrata. Depois de concluir o corte, retire a córnea anterior.

Em seguida, remova a cápsula da lente e o epitélio pigmentado da íris associado, puxando-o suavemente para fora da ocular usando uma pinça dentada. Em seguida, repita a dissecção nos olhos restantes e incube as oculares posteriores em meio de crescimento por 20 minutos a 37 graus Celsius para facilitar a separação da retina neural do EPR. Após 20 minutos, corte as oculares posteriores em quatro pétalas.

Faça os cortes longos o suficiente para achatar a ocular, mas curtos o suficiente para manter as pétalas conectadas. Em seguida, alise a ocular para remover a retina neural. Prenda o complexo de esclera coróide RPE restante com a mão não dominante e puxe suavemente a retina das bordas.

Uma vez que a retina neural é removida, transfira o complexo de esclera coróide EPR esquartejado para uma nova placa de cultura estéril preenchida com meio de crescimento quente. Na placa de Petri, prenda uma pétala do complexo de esclera coróide EPR esquartejado com uma pinça superfina e, usando uma faca crescente microcirúrgica, retire suavemente as folhas intactas de EPR da membrana basal subjacente. O EPR acastanhado deve ser claramente distinguível da coróide escura, pegajosa e fofa.

Em seguida, molhe uma ponta de micropipeta p200 com meio de crescimento e use a ponta para transferir as folhas de RPE para o novo prato contendo meio de crescimento aquecido. Agora, lave as folhas de RPE três vezes em meio de crescimento aquecido. Após cada etapa de lavagem, colete cuidadosamente as folhas de EPR, evitando outros tecidos, como detritos da retina ou coroide.

Após a última lavagem, transfira as folhas de EPR para um tubo de 1,5 mL e deixe-as sedimentar por gravidade. Em seguida, no gabinete de fluxo laminar, remova o meio de crescimento extra e ressuspenda as células em meio de crescimento quente recém-feito. Agora, triture suavemente o tecido usando uma micropipeta p200 sem fazer bolhas.

Triturar entre 40 e 50 vezes, apenas o suficiente para fazer uma única suspensão celular. Tenha cuidado, pois muita trituração pode ser letal. Agora, coloque as células RPE coletadas de ambos os camundongos em uma inserção de membrana de poliéster de 12 mL no poço de uma placa de cultura de 12 poços.

Uma alta densidade celular é desejada para que as células RPE mantenham sua forma hexagonal e pigmentação. Uma cultura primária de EPR de camundongo estabelecida a partir de dois camundongos em uma inserção de membrana de poliéster de 12 mm atingiu 90 a 95% de confluência após uma semana em cultura. Após duas semanas em cultura, as células estavam 100% confluentes e começaram a formar um mosaico de células hexagonais pigmentadas e binucleadas.

Na terceira semana, as células continuaram a mudar de forma e pigmentação. No entanto, após quatro semanas, uma parte das células tornou-se hiperpigmentada. A pureza da cultura primária de células RPE foi avaliada usando o anticorpo RPE65, que marca a isomerohidrolase retinóide, uma enzima crítica para o ciclo visual dos vertebrados.

A integridade das junções célula a célula e a forma hexagonal da célula foram demonstradas pela coloração com faloidina. As junções apertadas foram visualizadas pela análise da expressão da proteína ZO-1, que pôde ser visualizada usando uma coloração de aminoácidos e validada por western blotting. No geral, as culturas são capazes de proliferar, reter a pigmentação e sua forma hexagonal enquanto formam junções apertadas e expressam marcadores funcionais, como RPE65.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células RPE dos olhos do camundongo e cultivá-las adequadamente in vitro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre manter os olhos molhados e tentar operar o mais rápido possível.