Name: Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a gerar bibliotecas Hi-C de alta resolução a partir de embriões de Drosophila melanogaster em estágios precisos para estudar a arquitetura da cromatina. Este método permite investigar como a organização tridimensional do genoma influencia a expressão gênica durante o desenvolvimento.

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Esta pesquisa foi financiada pela sociedade Max Planck. C.B.H foi apoiado por uma bolsa de estudos da escola International Max Planck Research – Biomedicina Molecular. Agradecemos Shelby Blythe e Eric Wieschaus gentilmente fornecendo linha eGFP-PCNA Drosophila melanogaster.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo aqui apresentado é muito eficaz na geração de mapas de alta qualidade da arquitetura da cromatina em embriões adiantados da drosófila . Comparado a um anterior protocolo34, a abordagem descrita aqui usa um atualizado em situ Hi-C procedimento5, resultando em processamento mais rápido, maior resolução e menos uso de reagente. O procedimento geral, incluindo o protocolo em situ Hi-C é esperado para trabalhar em uma grande variedade de fases e sistemas experimentais, além de Drosophila. Desde que o protocolo tem um requisito de entrada baixo, também poderia ser usado em populações de células isoladas. Em Drosophila, quando usando o protocolo de embriões fora do intervalo descrito aqui, alguns parâmetros, nomeadamente a fixação do material, talvez precise ser ajustado. Desde que os embriões mais velhos desenvolvem uma cutícula altamente impermeável, aumentando a concentração de formaldeído e prolongar a fixação podem ser apropriados. Para coleta de embriões em estágios diferentes do ciclo nuclear 14, os tempos de incubação de embriões a 25 ° C na etapa 1.4 precisam ser ajustado da seguinte maneira: ciclo nuclear 12, 70 min; ciclo nuclear 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 03:30 h.
Durante as divisões de 13 clivagem (fase 1-4), a densidade de núcleos mais ou menos duplas com cada divisão. Os núcleos podem ser facilmente identificados por sua fluorescência de GFP. Durante a mitose, eGFP-PCNA não está localizado no núcleo, e seu sinal é dispersa em todo o embrião. Esta característica torna a identificação de embriões que estão passando por uma divisão de clivagem síncrono possível. Para estudar a conformação da cromatina, estes embriões mitóticas geralmente não são desejáveis, desde que a organização mitótica da cromatina é drasticamente diferente do que a organização de interfase35. É possível adaptar o protocolo para selecionar especificamente embriões submetidos a uma divisão mitótica síncrona. Neste caso, somente embriões com distribuição dispersa, não-nucleares de eGFP-PCNA devem ser mantidos, e todos os outros embriões devem ser descartados. Desde que a densidade nuclear não pode ser determinada, devem ser empregados métodos alternativos para o estágio de embriões por sua morfologia visualizados em microscopia de luz transmitida. Presença de células do polo e núcleos na periferia de embrião indicam que o embrião completou o ciclo nuclear pelo menos 9, Considerando que celularização visível na periferia indica ciclo nuclear 1412.
Oi-C experiências podem ser executadas com êxito usando uma grande variedade de enzimas de restrição5. As abordagens atuais normalmente usam enzimas que reconhecem ou uma sequência de 4-base, tais como MboI, ou um site de reconhecimento 6-base, tais como HindIII. A vantagem de 4-base cortadores sobre cortadores 6-base é que eles oferecem maior resolução potencial, dada a profundidade suficiente sequenciamento e uma cobertura mais uniforme dos sítios de restrição em todo o genoma. Não há nenhuma vantagem clara na hora de escolher um cortador 4-base sobre outro5,23,36,37. As duas enzimas mais comumente usadas, MboI e DpnII, ambos reconhecem o mesmo site de reconhecimento do GATC. DpnII é menos sensível a metilação de CpG, que é de nenhum interesse em Drosophila. O protocolo apresentado aqui pode também ser concluído com êxito usando DpnII como uma enzima de restrição. Na seção 4.2. enzima de restrição e reserva tem que ser ajustado para compatibilidade de DpnII, de acordo com as recomendações do fabricante.
Se o tamanho do fragmento da biblioteca de sequenciamento diverge significativamente o intervalo, mostrado na Figura 2A, formação de cluster durante o sequenciamento pode ser menos eficiente ou falhar completamente. Neste caso, a distribuição de tamanho após a tosquia deve ser verificada e parâmetros de corte ajustada em conformidade. Picos na distribuição de fragmentos de DNA do muito pequeno (< 100 bp) ou muito grandes (> 1.000 bp) tamanhos indica problemas com a seleção de tamanho, tais como transportar ao longo de grânulos ou sobrenadante que deveriam ser descartados. Muitas vezes essas bibliotecas com pequenos picos a esses tamanhos indesejáveis, tais como o retratado, é ainda sequenciados com sucesso com apenas uma menor diminuição na eficiência de clustering.
Altas taxas de duplicação de PCR devem ser evitadas porque isso reduz drasticamente o número de leituras de sequência utilizável. A taxa de PCR duplicatas está diretamente relacionada à quantidade de material de entrada. Usar mais entrada, portanto, geralmente alivia problemas com duplicação de PCR.
Os números mais altos de leituras filtradas devido à orientação de leitura (,Figura 2B) indicam insuficiente digestão, que pode ser o resultado de usar pouca enzima, material muito entrada ou homogeneização incompleta dos embriões.

Captura de conformação da cromatina (3c) surgiu como um método extremamente útil para o estudo da topologia da cromatina no núcleo1. A variante 3C Hi-C permite medir as frequências de contato de todas as interações de cromatina que ocorrem no núcleo em um único experimento2. Aplicação do Hi-C tem desempenhado um papel importante na descoberta e caracterização de muitos princípios fundamentais de organização da cromatina, como TADs, compartimentos e loops3,4,5.
Estudos de arquitetura de cromatina no contexto das transições do desenvolvimento e diferenciação celular são cada vez mais usados para desvendar os mecanismos de regulação gênica durante estes processos6,7,8, 9. Um dos organismos modelo de grande interesse é a Drosophila melanogaster, cujo desenvolvimento e genoma são bem caracterizadas. No entanto, alguns estudos que investigam a arquitetura da cromatina em Drosophila fora em vitro tecido cultura configurações foram realizadas10,11. Em embriões, fertilização post de 16 – 18 h, Tad e compartimentos reminiscentes de estruturas semelhantes em mamíferos foram identificados10, que levanta a questão de qual o papel que eles estão jogando no Regulamento do gene durante o embrião da drosófila desenvolvimento. Especialmente nas fases iniciais de desenvolvimento, antes da gastrulação, tais estudos são tecnicamente desafiadoras. Antes de gastrulação, embriões da drosófila passam por 13 divisões nucleares síncronas que produziam a um ritmo extremamente rápido de 8 – 60 min por ciclo de12,13. Além disso, a falta de recursos visuais para distinguir as diferentes fases tornam difícil obter material de embrião firmemente encenado em quantidades suficientes.
A fim de desenvolver um protocolo que permite estudar arquitetura da cromatina no desenvolvimento adiantado de Drosophila em resolução do ciclo nuclear, nós combinamos duas técnicas existentes: em situ Hi-C, que permite a geração de alta resolução toda genoma contato mapas5e encenação de embrião usando uma linha de Drosophila transgênica expressando uma eGFP-PCNA transgene13,14. Este transgene localiza-se no núcleo durante a interfase e dispersa por toda a Drosophila sincicial durante a mitose. Usando essa propriedade, é possível facilmente distinguir diferentes fases por sua densidade nuclear e mitóticos embriões pela dispersão do sinal de GFP.
Juntas, estas técnicas permitem estudar a estrutura tridimensional da cromatina em alta resolução de até 20 embriões da drosófila . Este protocolo inclui as instruções para colheita e classificação de embriões da drosófila para obter populações de embriões de um ciclo de divisão nuclear. Mais descreve como os embriões obtidos são usados para executar em situ Hi-C. O resultado final é uma biblioteca de nucleotídeo apropriada para sequenciamento em máquinas de sequenciamento na próxima geração. As leituras de sequenciamento resultante então podem ser processadas em cromatina detalhadas interação mapas cobrindo todo o genoma de Drosophila .

<table><tbody><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimerase I Fragmento de Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>T4 DNA Ligase Tampão incluído</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de protease completos sem EDTA</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEB Oligos Multiplex para Illumina&nbsp;( Conjunto de Primers de Índice 1)</td> Adaptador de Sequenciamento <td>E7335</td> <td>da New England Biolabs</td><td>, Primer de PCR Direto (não indexado) e Primer de PCR Reverso (indexado) e enzima USER usados na seção de preparação da Biblioteca</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de Preparação da Biblioteca de DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645</td><td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix e Polymerase Master Mix usados na seção de preparação da Biblioteca são componentes deste kit</td></tr><tr><td>Sistema Covaris S2 AFA</td> Tubos <td>LoBind DNA Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1.5 mL</td><td>Filtro de</td> células <td>Eppendorf</td> 0030108051 <td></td></tr><tr><td>Falcon 100 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cestos de coleta de embriões</td></tr><tr><td>37% formaldeído</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>Heptano</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC microscópio estéreo fluorescente</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC DFC câmera</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal micro pilão</td><td>Carl Roth</td><td>P985.1</td><td>Usado para lisar embriões em passo 4.1.4</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>Contas magnéticas revestidas com estreptavidina</td></tr><tr><td>Contas Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA voa</td><td>Presente de S. Blythe e E. Wieschaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio 13%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Tris pH 8,0 (1 M) para biologia molecular</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>SDS para biologia molecular</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Tampão enzimático de restrição</td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814362001</td><td>Não modificado dCTP, dGTP, dTTP</td></tr><tr><td>BSA, Grau de Biologia Molecular</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M solução para biologia molecular</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio 3 M pH 5,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Suporte magnético</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Pequenas Gaiolas de Coleta de Embriões</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100</td><td>Gaiola de coleta de ovos</td></tr><tr><td>Centrífuga 5424&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>tiras de tubo PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 DNA Polimerase tampão</td></tr></tbody></table>

geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigando a arquitetura tridimensional da cromatina oferece inestimável insight sobre os mecanismos de regulação gênica. Aqui, descrevemos um protocolo para a realização da cromatina conformação captura técnica em situ Hi-C na encenado populações do embrião de Drosophila melanogaster . O resultado é uma biblioteca de sequenciamento que permite o mapeamento de todas as interações de cromatina que ocorrem no núcleo em uma única experiência. Classificação do embrião é feito manualmente, usando um microscópio estéreo fluorescente e uma linha de mosca transgénica contendo um marcador nuclear. Usar esta técnica, as populações de embrião de cada ciclo de divisão nuclear e com o status do ciclo celular definido, pode ser obtido com altíssima pureza. O protocolo também pode ser adaptado para classificar os embriões mais velhos além da gastrulação. Classificada de embriões usados como entradas em situ Hi-C. Todos os experimentos, incluindo sequenciamento preparação da biblioteca, podem ser concluídos em cinco dias. O protocolo tem requisitos de entrada baixos e funciona usando confiantemente 20 embriões de estágio de Drosophila como material de entrada. O resultado final é uma biblioteca de sequenciamento para sequenciamento de próxima geração. Após o sequenciamento, os dados podem ser processados em mapas de interação de todo o genoma da cromatina que podem ser analisados usando uma ampla gama de ferramentas disponíveis para obter informação sobre topologicamente associando a estrutura de domínio (TAD), loops de cromatina e cromatina compartimentos durante o desenvolvimento da drosófila .

Classificados de populações de embrião no ciclo nuclear, 12, 13 e 14 (correspondente a 01:30, 01:45 e 02:10 horas pós fertilização, respectivamente12) e fertilização de post de 3-4 h (hpf) foram obtidos de acordo com os procedimentos descritos no protocolo. Tirando fotos do sinal de cada lote de embriões classificados eGFP-PCNA, é possível documentar o status de palco e ciclo celular preciso de cada embrião único que é usado em experimentos a jusante. Fotos de exemplo de embriões de populações classificadas são mostradas na figura 1B-E. A saída do protocolo em situ Hi-C é uma biblioteca de nucleotídeo pronta a ser sequenciado em máquinas de sequenciamento na próxima geração. Para este efeito, uma concentração final de biblioteca de pelo menos 2-4 nM é geralmente necessária. Usando as quantidades recomendadas de material de entrada, esta concentração é confiável alcançado (tabela 1).
A distribuição de tamanho esperado de fragmentos de DNA após seleção de tamanho entre 300 – 600 bp, com um máximo em cerca de 500 bp (Figura 2A), dependendo do corte exato e parâmetros de seleção de tamanho. Para sequenciamento, recomendamos emparelhado-final leituras pelo menos 75 comprimento de bp para minimizar o número de fragmentos de restrição não mapeável no genoma. Mapas de alta resolução com tamanho 1-2 kb podem ser obtidos leituras 400 milhões. Recomendamos que várias repetições biológicas a uma menor profundidade de 150 milhões de sequenciamento lê cada um, em vez de um único replicar a profundidade muito elevada de sequenciamento. Isto permite a avaliação da variação biológica e leva a um menor número de leituras descartados devido a duplicação de PCR. Para uma representação visual, as réplicas podem ser combinadas. Antes de cometer a uma amostra de alta profundidade de sequenciamento, recomendamos executar amostras usando sequenciamento superficial (alguns milhões de leituras por exemplo) para determinar os parâmetros de qualidade da biblioteca básica como na Figura 2B.
Análise de dados Hi-C requer significativa experiência computacional de recursos e bioinformática. Como uma visão geral de áspera, o lê emparelhado é mapeado independentemente para o genoma de referência, os alinhamentos resultantes são filtrados para qualidade e orientação, em seguida, uma matriz de contatos em um nível de resolução ou fragmento de dado bin pode ser gerado de filtrada alinhamentos. A matriz de contato é a base para a análise de tudo mais a jusante explorando TADs, loops e compartimentos. Para a análise inicial do sequenciamento diz, várias condutas de Bioinformática estão disponíveis que permitem processamento de crus leituras em matrizes contatos sem muita bioinformática especializado conhecimento18,19, 20,21,22,23. Como é realizada uma análise mais aprofundada depende em grande parte a pergunta exata biológica em estudo e podem exigir significativa experiência em programação e scripting em R ou Python. No entanto, várias ferramentas e algoritmos de chamar TADs estão disponíveis5,24,25,26,,27,28, bem como software para analisar e Explore dados Hi-C no navegador da web e como stand-alone aplicações desktop29,30,31,32.
Uma vez processadas, a qualidade da biblioteca pode ser determinada usando métricas diferentes (Figura 2B). Primeiro, a taxa de duplicatas PCR, que é o número de pares de leitura sequenciadas decorrentes da mesma molécula original, deve ser tão baixa quanto possível limitar a quantidade de leituras de sequência desperdiçado. No entanto, mesmo as bibliotecas com &gt; 40% duplicação de PCR pode ser processada em contatos mapas de alta qualidade se as duplicatas são filtradas. Em segundo lugar, a taxa de leituras filtradas devido à sua orientação, conforme descrito em4, deve consistentemente ser inferior a 10% dos pares leitura alinhados.
Durante o desenvolvimento pré-gastrular de Drosophila entre ciclo nuclear 12 e 14, a arquitetura nuclear é drasticamente remodelada33 (Figura 3). No ciclo nuclear 12, TADs poucos são detectados, e a distribuição geral de contatos é muito lisa e sem muitas características perceptíveis. Isto é dramaticamente alterado no ciclo nuclear 13 e 14, quando TADs são cada vez mais proeminentes e inespecíficos contatos de longo alcance estão esgotados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figura 1: fotos representativas dos embriões eGFP-PCNA durante a classificação. Sinal de PCNA-eGFP (A) de uma população não seleccionada de embriões após 60 min coleção e incubação de 2 h a 25 ° C (B-E) exemplos de embriões de populações classificadas no ciclo nuclear 12 (B), nuclear ciclo 13 (C), 14 (ciclo nuclear D) e de embriões submetidos a mitose síncrona (E). Escala de barras = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figura 2: Exemplos em situ Hi-C biblioteca de métricas de qualidade. Traços Bioanalyzer (A) mostrando a distribuição de tamanhos de fragmento de DNA de uma bem sucedida Hi-C library (biblioteca de 1, superior) e de uma biblioteca que exibe um pico de fragmentos que são demasiado grandes para sequenciamento (biblioteca 2, inferior). Biblioteca 2 com êxito foi sequenciada, mas ainda maiores quantidades de fragmentos de DNA indesejadas podem levar à diminuição da sequenciação de rendimentos. (B) filtragem estatísticas de duas bibliotecas de Hi-C: exibido é o número de pares de leitura alinhados que são excluídos da análise adicional devido à leitura orientação e distância (interno, externo)4 ou duplicação de PCR (duplicada). Em cada bar, o número de leituras, passando o filtro (restante) e falhando (filtrado) é plotado. A percentagem de leituras passando o filtro além disso é mostrada como texto. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figura 3: interação C mapas a partir de embriões encenados. Interação C mapas são guardados em resolução de 10 kb e equilibrados como descrito antes33. Mostrada é uma região no cromossomo 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Biblioteca</td>
			<td>Estágio</td>
			<td>Número de embriões</td>
			<td>Quantidade de DNA antes de cisalhamento (ng)</td>
			<td>Ciclos PCR</td>
			<td>Concentração final de biblioteca (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>ciclo nuclear 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>ciclo nuclear 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>ciclo nuclear 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>ciclo nuclear 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>ciclo nuclear 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>ciclo nuclear 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ciclo nuclear 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>ciclo nuclear 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>ciclo nuclear 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: lista de estatísticas de biblioteca de sequenciamento representativa. Para cada biblioteca na lista, o número de embriões que foram usados para sua geração, a quantidade de DNA total antes de biotina pulldown e distorção medido pelo Qubit, o número de PCR ciclos utilizados para a amplificação e a concentração final da biblioteca de sequenciamento após a seleção de purificação e tamanho são indicados.

Este trabalho descreve um protocolo para a geração de alta resolução em situ Hi-C bibliotecas de encenado firmemente pre-gastrulação Drosophila melanogaster embriões.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da arquitetura da cromatina, como como a estrutura 3D da cromatina pode influenciar a expressão e o desenvolvimento genético. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma visão de alta resolução da arquitetura cromatina e de embriões de mosca precisamente encenados. Embora este método possa fornecer insights sobre a organização e o desenvolvimento da cromatina, também se pode usar linhas existentes de bibliotecas de moscas transgênicas para testar seu efeito na organização da cromatina.Para iniciar o protocolo, ajuste o volume total de embriões coletados anteriormente para dois mililitros com PBST. Adicione seis mililitros de heptano e 100 microliters de 37% de formaldeído na água. Depois de adicionar formaldeído, agite vigorosamente o tubo para cima e para baixo por um minuto.A fase aquosa e orgânica se combinará para formar uma consistência semelhante a um shampoo. Agitar a mistura em uma batedeira rotativa por 10 minutos. Centrifugar o tubo a 500 vezes g por um minuto à temperatura ambiente para coletar embriões na parte inferior do tubo.Aspire todo o líquido tipo xampu e descarte-o, tomando cuidado para não aspirar nenhum embrião. 15 minutos após a adição de formaldeído, resuspende os embriões em cinco mililitros de PBST com 125 glicina milimiliar. Agite os embriões para cima e para baixo vigorosamente por um minuto.Depois de centrifugar, aspire o supernante. Usando uma pipeta de 1.000 microliter, transfira um lote de 100 embriões para um pequeno vaso de vidro adequado para a classificação, de preferência em um fundo escuro e coloque-o no gelo. Classifique embriões por densidade nuclear e status de ciclo celular usando uma agulha ou ponta de seringa.Remova todos os embriões mitóticos reconhecíveis por sua distribuição dispersa e não nuclear de EGFP PCNA e embriões que mostram parcialmente um sinal GFP não nuclear. Para auxiliar na classificação, forre os embriões de referência nos ciclos nucleares 12, 13 e 14 em cada lote para combinar embriões com um dos embriões de referência. Pipeta até os embriões desejados usando uma pipeta de 1.000 microliter.Transfira-os para um tubo fresco e coloque-os no gelo. Continue até que embriões suficientes sejam classificados para o experimento planejado. Gire tubos brevemente a 100 vezes g à temperatura ambiente.Remova o sobrenante e certifique-se de que os embriões estejam o mais secos possível para congelar. Os embriões congelam flash submergindo os tubos em nitrogênio líquido e armazenam a menos 80 graus Celsius. Coloque os tubos com embriões congelados no gelo.Resuspense os embriões em 500 microliters de tampão de lise gelada. Espere um minuto para permitir que o embrião se instale no fundo do tubo. Em seguida, triture os embriões com um micro pilão metálico pré-resfriado no gelo que foi projetado para caber firmemente um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Para evitar agitar os embriões, insira o pilão lentamente até tocar a parte inferior do tubo. Empurre para baixo e, em seguida, moer girando o pilão duas vezes em ambas as direções. Levante o pilão um pouco.Empurre para o fundo do tubo novamente e repita o procedimento de moagem 10 vezes ou até que os embriões estejam completamente liseados. A solução deve ser homogênea e não restam grandes pedaços residuais de embriões. Incubar a suspensão homogeneizada no gelo por 15 minutos.Gire a 1.000 vezes g quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e lave a pelota reutilizando em 500 tampão de lise gelada de 500 microliter e pipetando para cima e para baixo. Depois de outra rotação, descarte o supernaspe.Resuspend a pelota lavada em 100 microlitres de 0,5% Sulfato de Dodecyl de Sódio ou SDS. Em seguida, permeabilize os núcleos incubando a amostra por 10 minutos a 65 graus Celsius em um bloco de aquecimento. Adicione 50 microliters de 10% Triton X100 e 120 microliters de água.Flick o tubo para misturar o conteúdo e incubar o tubo a 37 graus Celsius por 15 minutos em um bloco de calor. Adicione 25 microliters de tampão de enzima de restrição 10X e 20 unidades de cinco unidades por microliter MBO1. Flick o tubo para misturar o conteúdo e incubar o tubo em um bloco de calor para digerir o DNA.Adicione mais 20 unidades de MBO1. Continue a incubação por 90 minutos. Após a segunda incubação de 90 minutos, incubar a amostra a 62 graus Celsius por 20 minutos para inativo o MBO1.Em seguida, adicione 18 microliters de 0,4 milimilitros biotina 14-dATP, 2,25 microliters de um fragmento de 3,3 mililitros dCTP-dGTP-dTTP não modificado, e oito microliters de cinco unidades por microliter DNA polymerase I klenow fragmento. Flick o tubo para misturar o conteúdo e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 90 minutos. Em seguida, adicione 657 microliters de água, 120 microliters de 10X T4 DNA ligase buffer, 100 microliters de 10%Triton X100, seis microliters de 20 miligramas por mililitro de soro bovino de mililitro, e finalmente cinco microliters de cinco unidades por microliter T4 LIGASE de DNA.Em seguida, gire o tubo suavemente a 20 RPM em temperatura ambiente por duas horas. Adicione mais cinco microliters de cinco unidades por microliter T4 LIGA LIGASe de DNA. Continue girando por mais duas horas, depois gire os núcleos a 2.500 vezes g por cinco minutos.Após a centrifugação, descarte o supernasce. Resuspengue a pelota em 500 microliters de tampão de extração e adicione 20 microliters de 20 miligramas por proteína mililitro K.Flick o tubo e incubar o tubo para digerir a proteína. Adicione 130 microliters de cinco cloreto de sódio molar e incubar durante a noite para descruzar.No dia seguinte, pipeta a amostra em um novo tubo de dois mililitros com baixas características de ligação de DNA. Adicione 0,1X de volume de três acetatos de sódio molar e dois microliters de 15 miligramas por mililitro GlycoBlue. Adicione 1,6 volumes de etanol absoluto puro e inverta o conteúdo, em seguida, incubar a amostra a menos 80 graus Celsius por 15 minutos.Após a incubação, centrifugar o conteúdo. Localize a cápsula de DNA que só pode ser vista pelo GlycoBlue. Remova o supernatante cuidadosamente, movendo a ponta da pipeta para o tubo ao longo da parede oposta da pelota de DNA.Lave a pelota com 800 microliters de 70% de etanol. Misture a amostra invertendo-a e centrifuá-la a 20.000 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos. Remova as gotículas restantes durante esta etapa e as seguintes lavadas empurrando-as para fora dos tubos com uma ponta P10 e, em seguida, abra a tampa para secar o ar por até cinco minutos.Uma vez que não reste líquido, adicione 50 microliters de 10 mililitros tris cloreto. Repetidamente pipeta a solução sobre a área onde a pelota estava localizada para solubilizar o DNA. Adicione um microliter de 20 miligramas por mililitro RNase A.Mix apertando o tubo.Incubar a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos para digerir RNA. Por fim, guarde a amostra no congelador ou geladeira até a preparação da biblioteca. Imagens do sinal PCNA EGFP de cada lote de embriões classificados revelam estágios precisos e status de ciclo celular de cada embrião para experimentos a jusante.Traços bioanalyzer mostram que a distribuição de tamanho dos fragmentos de DNA após a seleção de tamanho está entre 300 e 700 pares de base com um máximo em torno de 450 pares de base. Mapas de interação hi-C mostram que no ciclo nuclear 12, poucos Domínios Topologicamente Associados ou TADs são detectados que mudam drasticamente nos ciclos nucleares 13 e 14 quando os TADs são cada vez mais proeminentes e contatos de longo alcance inespecíficos são esgotados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar as contas completamente e não prolongar os tempos de incubação desnecessariamente especialmente em altas temperaturas, uma vez que isso pode levar a bibliotecas Hi-C de baixa qualidade.Esta técnica que combina encenação precisa e mapeamento de confirmação de cromatina de alta resolução abriu caminho para pesquisadores do campo da epigenética explorarem o papel da organização tridimensional de cromatina em um cenário in vivo de desenvolvimento.

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

JoVE Journal

Genetics

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