Name: Medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana Nasal (NPD) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a medir a diferença de potencial nasal padronizada para avaliar a função dos canais CFTR e ENaC em pesquisa sobre fibrose cística. Este método oferece insights sobre transporte iônico e respostas terapêuticas.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo grupo de trabalho para a função de CFTR do Comitê de padronização (rede de ensaios clínicos, da sociedade europeia de fibrose cística) e o grupo nacional de recursos centro trabalhando (rede de desenvolvimento de terapêuticas, fibrose cística Fundação). Apoio adicional foi fornecido pela Fundação CF (Clancy FY09 para GMS) e NIH (DK072482 para ARM e GMS).

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

In vivo, NPD fornece uma única medição que pode ser executada repetidamente em uma base longitudinal e demonstra que, com medidas repetidas, resultados longitudinais semelhantes são observados em uma base individual e armazenando14, 15. Há fortes evidências que o NPD tem validade excelente discriminação para distinguir CF do não-CF. 25 estudos consistentemente demonstraram uma diferença estatisticamente significativa na Cl– e condutância at+ entre pacientes com FC e controles saudáveis10. Enquanto vários índices previamente desenvolvidos demonstram essa capacidade, prevemos que novas atualizações são necessárias dada a recentes padronizações de metodologia7,8.
Modificações e solução de problemas
Este teste requer várias etapas-chave para assegurar medições precisas. Isso inclui o deslocamento de loop fechado de eletrodos e cateteres para garantir que o sistema está executando aos padrões recomendados. Os pacientes devem ainda permanecem e abster-se de falar como isso minimiza artefatos e desalojamento de cateter. Isto dificulta o teste em pacientes não-cooperativos e a técnica só tem sido relatada em um estudo em crianças abaixo de 6 anos de idade7.
Inspecção preliminar do epitélio nasal é necessária garantir que não existem crostas ou muco no epitélio, que pode afetar as medidas.
Muito importante, deve-se salientar que o local de colocação do cateter é objecto de debate. O SOP aqui apresentada utiliza medição sob corneto inferior (IT). A colocação do cateter sob o que foi padronizada e realizada em ensaios multicêntricos e, portanto, esta é a técnica recomendada. Medição sob o IT é executada com o cateter de lado-buraco, que pode ser difícil de manter em contato firme com a mucosa nasal, enquanto estar em contato com as soluções. Outros grupos podem medir o PD no chão nasal, que é tecnicamente mais fácil. Importante, Vermeulen (2011) demonstrou que os 2 métodos são comparáveis16.
O aquecimento das soluções, é uma questão de debate entre europeus e centro-norte-americano de17,18. Tem sido advogava que usar soluções a 37 ° C, em vez de 22 ° C aumenta a resposta de cloreto total observado por cerca de 25% e a resposta de isoproterenol dependentes cloreto por aproximadamente 95%18. No entanto, o aquecimento aumenta variabilidade, avaliada pelo maior desvio padrão do cloreto total resposta17. Portanto, como o aquecimento das soluções é um factor adicional de variabilidade, é aconselhável não aquecer as soluções, a menos que exigido em uma base de estudo.
Temos anteriormente em relação a ambas as técnicas de eletrodo e encontrado que o AgCl e o calomelano sistemas de eletrodo operavam da mesma forma nas correntes basais e estimuladas em indivíduos normais,13.
Limitações da técnica
Este teste está sujeito a significativa dentro de variabilidade. A variabilidade de marcar um gol é especialmente prevalente em pacientes com traçados indeterminados e este deve ser contabilizado no aplicativo de diagnóstico19. Fatores de variabilidade incluem infecção aguda do trato respiratório superior, extensa polipose nasal, cirurgia prévia do seio e CF-relacionados a inflamação, que diminuem a sua especificidade e sensibilidade20,10. Além disso, interpretação de traçados pode ser diferente entre os leitores, embora leitores especialistas demonstram excelente acordo de Pontuação quantitativa e interpretabilidade em CF e traçados não-CF, contrastando com uma variabilidade significativa na confiança dos rastreamento19.
Variabilidade intrínseca contra limiares significativos
Muito importante, a variabilidade fisiológica da medição é considerável, como ilustrado em diferentes estudos10, tais como os testes de terapia do gene CFTR que demonstrou variabilidade considerável em mudanças no transporte total de cloreto e amilorida variam de21,22. Avaliação transversal sugere que zero Cl– além disso isoproterenol resposta acima do limiar de -5 a -7 mV é o limite entre CF e assuntos não-CF10.
No entanto, carecemos de conhecimento claro sobre a magnitude da mudança desse parâmetro, que representa uma correção de CFTR eficaz em ensaios de fase II com doença modificando terapias. Para avaliar a resposta individual, repetidos testes de monitoramento da resposta a uma intervenção podem ser necessária para distinguir alterações significativas da variabilidade intrínseca. Muito importante, futuros estudos de longo prazo com doença modificando drogas precisam demonstrar que melhora da função CFTR correlaciona-se com melhoria nos resultados clinicamente relevantes ou substituto resultados (tais como a melhoria no VEF1) da CF doença. Com efeito, uma recente fase II Ivacaftor estudo demonstrou marcada benefício clínico, apesar de uma pequena melhoria da secreção de cloreto23.
Esses estudos irão ajudar a estabelecer-se um valor de corte de melhoria na condutância de Cl–trans-epitelial pode ser um parâmetro substituto para benefício clínico. Isto seria um parâmetro importante para orientar o desenvolvimento de CFTR modificando terapias.
Importância no que diz respeito a métodos existentes: teste de suor e medições atual Intestinal (ICM)
Em pacientes com ' questionável ' fibrose cística, como avaliado por um intermediário suor Cl– concentração entre 30 e 60 mM, golo de NPD composto fornecido uma ferramenta altamente sensível para diagnosticar pacientes como 'CF-provável ' e ' CF-improvável '10 . Medição atual intestinal (ICM), que fornece uma medição ex vivo do líquido Cl– fluxos através do epitélio retal, também permite determinação da função CFTR residual com uma alta sensibilidade porque CFTR é altamente expresso em Este epitélio.
Considerando a modificação da função CFTR por moduladores CFTR, a relação entre estes diferentes alterações de biomarcador CFTR é actualmente pouco claras. Apesar de recente trabalho baseado em Ivacaftor determinou que teste NPD e suor são correlacionados4, não ainda estabeleceu-se uma medição no tracto respiratório é melhor preditor de resultado respiratório do que, por exemplo, o suor teste24 , 25 ou mudança na ICM. Além disso, drogas de modificador também podem diferir em suas eficácias específicas do órgão. Em relação a NPD, é importante notar que as alterações em resposta basal de PD e amilorida expressam transporte at+ , enquanto mudanças no Cl 0– e o isoproterenol resposta expressam transporte Cl– . É ainda necessário estabelecer qual delas é mais importante para a melhoria da doença.
Futura aplicação desta técnica
O uso desta técnica é esperado fora do campo de CF. Uma vez que esta técnica é excepcionalmente adequada para demonstrar at+ e Cl– canal iônico, que pode ser aplicado para demonstrar a disfunção em doenças de vias respiratórias, incluindo asma26, bronquite crônica,27, não-CF Bronquiectasia28 e pancreatite recorrente29. Além disso, modificações desta técnica tem sido usadas nas vias aéreas inferiores (LAPD) para demonstrar a disfunção centrada em vias aéreas inferior CFTR em portadores de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) bronquite crônica30.
NPD fornece um biomarcador sensível na vivo da função CFTR, o que pode ser usado tanto no diagnóstico e, também, para estudos de prova de conceito, com o objetivo de corrigir CFTR e ENaC canal atividade em pesquisa translacional. Isto permite a avaliação longitudinal da função trans-epitelial e é uma promessa como estratégia de medicina personalizada costurar o corrector mais eficiente para cada paciente com FC.

O objectivo geral deste método é medir a diferença de potencial nasal (NPD) que visa investigar o transporte trans-epitelial íon na vivo1. Esta técnica permite a medição de sódio (Na+) e transporte de cloreto (Cl.–). NPD tem sido utilizado como ferramenta de pesquisa desde a década de 1980 e foi aceito como um procedimento diagnóstico em 1998, pela Fundação de fibrose cística (CFF) consenso instrução2 e em 2017 nas diretrizes do diagnóstico da Fundação de fibrose cística (CFF) consenso 3. com efeito, disfunção biológica de CFTR, que é a causa da CF, é evidenciada por uma maior absorção de at+ na membrana apical e um defeito na secreção de Cl– . Este teste funcional oferece a vantagem de uma ferramenta de diagnóstico adicionais quando genética é não-conclusivo em pacientes com teste de suor intermédio indeterminado resultados3. Embora essas informações podem também ser obtidas por biópsias de medição atual intestinal (ICM), o ICM é, no entanto, somente disponível em alguns centros globalmente e precisa mais padronização. NPD é mais disponível em aproximadamente 60 centros globais e, além disso, metas do epitélio respiratório que é o principal local da doença.
Tendo em conta as informações que ele fornece na atividade CFTR, também é usado em estudos de prova de conceito, com o objetivo de avaliar a recuperação funcional da proteína CFTR pelo modulador terapias4,5,6,7, 8. De facto, dados de estudos com edição de mRNA/gene CFTR, potenciador de CFTR e terapias de corrector, realçar alterações significativas na Cl– e at+ transporte com terapia6,9 e confirma que o NPD pode ser um ponto de extremidade responsivo em ensaios clínicos. Como temos falta pontos finais clínicos sensíveis capazes de detectar uma sutil mudança no estado clínico do paciente, a curto prazo, este biomarcador pré-clínica pode ser altamente informativa. O campo das terapias de modulador CFTR amplia rapidamente e precisamos urgentemente de testes na vivo que são capazes de decifrar rapidamente compostos ativos antes de ir para a grande fase 3 ensaios10.
A lógica fisiológica da técnica baseia-se na medição da diferença potencial entre o epitélio das vias aéreas na narina e o compartimento subcutâneo. Atividades do canal de íon são exploradas, medindo a diferença de potencial máxima de linha de base estável (PD), suas alterações após bloquear a ENaC relacionadas a absorção at+ e secreção de Cl– de condução através de diferentes transportadores apicais de Cl– incluindo a CFTR. Disfunção CFTR é mostrada por uma mudança mínima na diferença de potencial sobre estimulação da secreção de Cl– com um acampamento caminho dependente e um aumento ENaC mediada por absorção at+ detectadas por uma diferença de potencial mais negativa da linha de base e uma resposta reforçada para amilorida. A base mecanicista para CF versus normal PD está resumida na Figura 1.
<img alt="Diagrama de gradiente eletroquímico, atividade de CFTR/ENaC, transporte epitelial, análise de patologia de FC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: figura Resumo da actividade do canal iônico. Íon (A) atividade em demonstrar o epitélio respiratório equilibrado atividade de ENaC e CFTR em indivíduos normais e (B) perda de atividade CFTR, resultando em maior transporte de sódio ENaC mediada e reduzida dependente cloreto CFTR transporte. ENaC: canal de sódio epitelial, at+: sódio, CFTR: fibrose cística regulador transmembrana, CL–: cloreto, mV: milivolts, PD: diferença de potencial, min: minuto/s <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57006/57006fig1large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
No entanto, este teste demonstra algum grau de variabilidade tanto em medidas repetidas no mesmo paciente e entre os pacientes com o mesmo genótipo. Isto é de extrema importância para facilitar a interpretação das mudanças após o tratamento do modulador. Além disso, falta-nos ainda validados limiares discriminar entre CF e indivíduos saudáveis. Isto pode ser parcialmente devido às diferenças entre a disponibilidade de instalações clínicas e as técnicas empregadas. Portanto, um considerável esforço internacional destinado a padronização do teste está em andamento. Tanto nos CFF-TDN (rede de desenvolvimento de terapêutica-Fundação de fibrose cística) e o ECF-CTN (rede europeia de fibrose cística-sociedade clínica ensaios) criaram um procedimento operacional padrão do NPD (SOP) para o uso nos julgamentos multicêntrico e pesquisa. Este recente trabalho colaborativo pelo CTN e TDN resultou em um SOP combinada, internacional, reunindo os conhecimentos do CTN e TDN (2014)11. Este artigo apresenta as técnicas de protocolo e teste para empregar NPD para diagnóstico de CF ou para ensaios de prova de conceito iniciado pelo investigador. Cada centro de aplicação da técnica é responsável pela aplicação de sua Comissão de ética de pesquisa humana institucional para aprovação.
<img alt="Diagrama de neurociências; bombas de seringa, eletrodos, interface de computador; medição do potencial nervoso." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: diagrama esquemático de todo recomendado configuração NPD. Observe que a configuração recomendada é mostrada, incluindo bombas de perfusão sequencial e a configuração de série 4-paragem-pau. Conexões específicas e exemplos de componentes são mostrados na SOP. (Diagrama modificado com permissão de Salomão, no peito, G.M. 201013) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57006/57006fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O fluxo geral experimental é descrito na Figura 2, pelo qual o NPD é medido entre a ponte explorando posicionada sobre a ponte de superfície e referência de epitélio colocada no espaço subcutâneo, ambos conectados a eletrodos e uma alta impedância voltímetro.
Isso é assegurado por 2 sistemas diferentes: existem 2 configurações de eletrodo de referência aceitável: (i) equilibrado eletrodos de Ag/AgCl e uma ponte de creme do eletrocardiograma (ECG) ligado ao espaço subcutâneo por ligeira abrasão ou (ii) saturado de calomelano semicélulas e um ágar cheio de 22 a 24-agulha introduzida por via subcutânea. O contato com a mucosa nasal é ativado por um cateter de duplo lúmen. Um lúmen é preenchida com ágar-ágar ou creme de ECG e ligado ao eléctrodo de medição, a outra permite a perfusão na mucosa nasal das diferentes soluções.
A ponta do tubo de explorar é colocada na mucosa respiratória sob o inferior nasal corneto (Figura 3).
<img alt="Processo de colocação de cateter; diagrama de endoscopia nasal mostrando a configuração dos cornetos inferiores e médios." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: colocação de tubos no mucosa respiratória a explorar. (A) colocação de apresentando visão externa. (B) vista rinoscópico demonstrando a colocação. (C) diagrama indicando a localização anatômica para colocação do cateter. PD: diferença de potencial
Para estudar a resposta do PD para vários medicamentos, as soluções superfusion são aplicadas através do segundo lúmen do cateter. Existem várias etapas-chave sobre a preparação e realização das medições do NPD, que são detalhadas abaixo no protocolo, desde a preparação inicial através de análise de dados.
Após a preparação de soluções e eletrodos, testes de qualidade adequada dos eletrodos e cateteres permite o comportamento básico do teste. São realizadas medições basais ao longo do corneto, inferior que permite a seleção do melhor local para a medição, geralmente que a medição mais negativo. Então perfusions sequenciais determinam at+ (ENaC) e Cl– fluxo de iões (CFTR-dependente) através de uma mudança de tensão entre o epitélio nasal.

<table><tbody><tr><td>Bomba de infusão KD Scientific (ou equivalente - como bombas de infusão programáveis fornecidas pela instituição / hospital)</td> <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 4/30</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMA-200 AC / DC bioamplificador portátil</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IS0-Z isolamento headstage para BMA-200</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC compatível com Windows - Requisitos mínimos do Windows XP ou superior</td><td>Vários softwares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AD Instruments: GLP Client V6 (Windows) ou superior</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECG eletrodo (terra para o sujeito do estudo)</td> <td>Padrão</td><td></td><td></td>hospitalar</tr><tr><td>2 mini eletrodos de referência de calomelano</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-620-79</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio KCl, Granular - USP, peso da fórmula 76, quantidade: 500 g</td><td>de</td> recipiente estéril Spectrum <td></td><td></td></tr><tr><td>(como recipiente de coleta de amostras ou similar) para ser usado para banho de calomelano KCl, com orifícios cortados na tampa para manter os eletrodos no lugar. (Se não for fornecido pelo fabricante do eletrodo.)</td><td>Padrão</td><td></td><td></td>hospitalar</tr><tr><td>2 eletrodos: Ag/AgCl 8 mm TP eletrodo</td><td>BIOPAC Systems</td><td>UNSHLD-EL258</td><td></td></tr><tr><td>2 eletrodos Ag/AgCl, B0194, plugue 4 mm</td><td>SLE Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signacreme&reg; Creme de eletrodo condutor</td><td>Fisher Scientific</td><td>Parker Labs ref # 17-05</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de abrasão da pele</td><td>PROMED Feeling</td><td>Ref 374901</td><td></td></tr><tr><td>Hi Di 541 M, brocas dentárias com ponta de diamante</td><td>Instrumentos de cinza</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Tubulação Becton Dickinson PE 50</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação Becton Dickinson PE 90</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de Silastic, 0,062" IDENTIFICAÇÃO, 0,095" OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>508-007</td><td></td></tr><tr><td>Fita Cirúrgica Micropore Papel (25 mm x 9,1 m)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Cateter de duplo lúmen Marquat Comprimento: 80 cm; Diâmetro externo: 2,5 mm; Diâmetro interno dos canais: 0,8 mm; Distância dos orifícios laterais até a ponta: 2 mm. Etiqueta da UE Acordo para NPD: I0202US</td><td>Marquat</td><td>I0202US</td><td></td></tr><tr><td>fita de seda de 1" X 10 jardas</td> Tubo de extensão <td>3M Durapore</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>IV (30", 50/caixa)</td><td>International Limited</td><td>IMN30</td><td></td></tr><tr><td>Torneira de três vias (50/caixa)</td><td>Medex</td><td>MX5311L</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéreis (ANOTOP 25 estéril 50 pk; 0,22-&mu; m ou filtros menores; ou equivalente)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-926-7</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20 G, para conexão ao PE90 se estiver usando cateter nasal produzido no local do estudo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>427564</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson 23 G, 0.75" Aspirador (" borboleta") agulhas (0.6 mm x 19 mm; 50 U/caixa) (para conexão ao PE50) se estiver usando cateter nasal produzido no local do estudo)</td><td>Seringa Fisher Scientific</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson 60 mL sem agulha Ponta Luer-Lok (40/Caixa)</td><td>Seringa Fisher Scientific</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson 10 mL sem agulha Ponta Luer-Lok (100/Caixa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes estéreis de uso único (por disponibilidade institucional)</td><td>Padrão</td><td></td><td></td>hospitalar</tr><tr><td>70% EtOH (1 pint), número de catálogo Aaper Alcohol and Chemical Co. NC9274019 (ou equivalente)</td>Filtros de garrafa estéreis de uso <td>único Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning, 0,22 &mu; m tamanho do poro (0,15 - 1,0 L volumes aceitáveis)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>430624</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Cert Ph 10,00 (1 L Sn04332) - para calibração do medidor de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) - para calibração do medidor de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) - para calibração do medidor de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofadas descartáveis (almofadas azuis; 23" x 36" 150/caixa; ou equivalente por padrão hospitalar)</td> <td>SureCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>23 G, 0,75" Vacutainer " borboleta" agulhas (0,6 mm x 19 mm; 50 U/caixa)</td><td>Ágar Becton Dickinson</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>Difco Laboratories (Noble 100 g 0142-15-2; ou equivalente)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (ou equivalente)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Welch Allyn Bateria de cabo conversível 72300 (ou equivalente) OU Otoscópio com bateria</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apoio de cabeça e queixo (ou equivalente; opcional)</td> <td>Richmond Products, Inc</td><td>629R</td><td></td></tr><tr><td>Static Dissipative Anti-Fatigue Matting&nbsp; (ou equivalente)</td><td>Fisher Scientific</td><td>No. 791</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS PARA SOLUÇÕES MISTURADAS NO LOCAL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio, Granular &ndash; Peso</td> da fórmula <td>do espectro</td><td></td> de NaCl da USP<td>: 58; Tamanho: 500 g</td></tr><tr><td>de cloreto de cálcio CaCl2 &bull; 2H2O &ndash; Peso</td> da fórmula do <td>espectro</td><td></td> USP<td>: 147; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Cloreto de Magnésio Hexahidratado Cristal, MgCl2&bull; 6H2O &ndash; Peso</td> da fórmula do <td>espectro</td><td></td> USP<td>: 203; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Fosfato de Potássio Dibásico, Anidro, Granular, KH2PO4 &ndash; Peso</td> da fórmula do <td>espectro</td><td></td> USP<td>: 174; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Cristais Monobásicos de Fosfato de Potássio - ndash; NF (KH2PO4)</td><td>Peso</td> da Fórmula do Espectro<td></td><td>: 136; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Gluconato de Sódio- USP (sal monossódico)</td><td>Peso</td> da Fórmula do Espectro<td></td><td>: 218; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Gluconato de Cálcio - ndash; USP (Pó Anidro)</td> Peso da Fórmula <td>do Espectro</td><td></td><td>: 430; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Gluconato de Potássio- USP (Anidro)</td>Peso da Fórmula do <td>Espectro</td><td></td><td>: 234; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>de Sulfato de Magnésio Heptahidratado &ndash; USP MgSO4&bull; Peso da</td> Fórmula do <td>Espectro</td><td></td> 7H2O<td>: 246; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>Amiloride HCl - ndash; Peso</td> da fórmula do <td>espectro</td><td></td> USP<td>: 302; Tamanho: 5gm</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP) (Sal dissódico)</td><td>Fórmula do Espectro</td><td></td><td>Peso: 551; Tamanho: 5 g</td></tr><tr><td>de Cloreto de Magnésio, Hexahidratado, Cristal - ndash; USP MgCl2&bull; Peso da</td> Fórmula do <td>Espectro</td><td></td> 6H2O<td>: 203; Tamanho: 500 gm</td></tr><tr><td>Água Duplamente Destilada (ddH2O)</td><td>Fórmula de Farmácia</td><td></td><td>Hospitalar Peso: NA; Tamanho: 1 L</td></tr><tr><td>Injeção de Isoproterenol HCL - USP 1 mg/5 mL ampola</td><td>Fórmula de Farmácia</td><td></td> Hospitalar <td>Peso: 248; Tamanho: injeção de ringers de uso único</td></tr><tr><td>, USP ou Ringers Irrigation</td><td>Hospital Pharmacy</td><td></td><td>Formula Peso: NA; Tamanho: 5 L</td></tr></tbody></table>

medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana nasal (npd)

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

Nós descrevemos uma medição padronizada da diferença de potencial nasal (NPD). Nesta técnica, regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e a função de canal (ENaC) epiteliais de sódio são monitorados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após o superfusion de soluções que modificar o canal iônico atividade. Isto é permitido a medição da diferença de potencial entre o compartimento subcutâneo e o epitélio das vias aéreas na narina, utilizando um cateter em contacto com o corneto nasal inferior.
O teste permite a medição da tensão de linha de base estável e as alterações sucessivas tensão líquida após a perfusão de 100 µM amilorida, um inibidor de reabsorção de Na+ em solução de Ringer; uma solução de cloreto livre contendo amilorida a secreção de cloreto de unidade e 10 µM isoproterenol em uma solução de cloreto livre com amilorida para estimular o adenosina monofosfato cíclica (cAMP)-condutância cloreto dependentes relacionados a CFTR.
Esta técnica tem a vantagem de demonstrar as propriedades eletrofisiológicas de dois componentes-chave que institui a hidratação do líquido das vias respiratórias superfície do epitélio respiratório, ENaC e CFTR. Portanto, é uma ferramenta útil de pesquisa para a fase 2 e comprovante de ensaios conceito agentes CFTR e ENaC atividade para o tratamento da doença de pulmão fibrose cística (CF) de destino. É também um procedimento de acompanhamento chave para estabelecer a disfunção CFTR quando genética e teste de suor são equívocos. Ao contrário de cloreto de suor, o teste é relativamente mais demorado e caro. Ele também requer treinamento do operador e expertise para realizar o teste de forma eficaz. Variabilidade intere intra - subject relatou nesta técnica, especialmente em indivíduos jovens ou não cooperativos. Para ajudar com esta preocupação, interpretação foi melhorada através de um algoritmo recentemente validado.

No epitélio normal das vias respiratórias, absorção at+ é a actividade de transporte de íon primário. Isso resulta em uma diferença de potencial negativa das vias respiratórias superfície no que se refere o interstício. Perfusão da amilorida de bloqueador de canal de ENaC leva a uma diferença de potencial menos negativa. Em seguida, superfusion de Cl–-solução livre cria um gradiente químico para Cl-, que cria uma diferença de potencial mais negativa e ativa todos os transportadores de Cl– , incluindo CFTR. Isoproterenol, o que aumenta o cAMP intracelular, mais aumenta a secreção de Cl– ativando especificamente CFTR e aumenta a diferença de potencial.
Por outro lado, nos indivíduos CF, ausente ou disfuncional CFTR resulta em um aumento ENaC mediada at+ absorção12. Como resultado, a diferença de potencial de base é mais negativa. A despolarização observada com aplicação de amilorida é maior, Considerando que há mínima ou nenhuma mudança na diferença potencial sobre a estimulação da secreção de Cl– , através de vias dependentes de CFTR. Isto pode ser visto em traçados representativos na Figura 8, mostrando 'saudáveis' vs traçados 'CF'.
<img alt="Gráfico de eletrofisiologia, alteração da DP em saudáveis, F508del; amilorida, estágios Cl/Iso, análise de pesquisa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: traçados representativos da matéria 'saudável' e o assunto com CF PD: diferença de potencial, ΔAmiloride: delta amilorida, /Iso Cl 0––: cloreto de baixa: a mudança em PD entre e perfusão de solução #4, S1-S4 desta solução #2: linha verde de estágios 1-4, em gráficos A e B indicam o rastreamento NPD e preto as setas indicam a diferença na diferença de potencial

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para medir a diferença de potencial nasal (NPD). Regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e de sódio epitelial (ENaC) de canal função são avaliados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após superfusion de soluções que modificam a atividade do canal de íon, fornecendo um medida de resultado.

Medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana Nasal (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de FC e transporte iônico sobre se os pacientes com FC podem montar uma resposta significativa à ativação ou restauração da função CFTR. A principal vantagem dessa técnica é que ela mede a atividade coordenada do CFTR e do canal epitelial de sódio no epitélio das vias aéreas. Embora esse método possa fornecer informações sobre a fibrose cística, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de doenças, como distúrbios genéticos da função do canal epitelial de sódio hiperativo. Demonstrando o procedimento estarão Thao Nguyen, biólogo, e Aur

standardized-measurement-nasal-membrane-transepithelial-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Campo elétrico externo induz uma tensão na membrana de uma célula, chamado de tensão de membrana induzida (ΔΦ). Usando o corante potenciométrica di-8-ANEPPS, é possível medir a ΔΦ não invasiva. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS.

Medir a tensão de membrana induzida com Di-8-ANEPPS

Este manuscrito descreve o uso de técnicas de absorção nasal e brônquica, especificamente usando matrizes absorventes sintéticas (SAM) para o fluido de mucosa (MLF) das vias aéreas superiores e inferiores da amostra. Esses métodos fornecem melhor padronização e tolerabilidade do que as técnicas de amostragem respiratória existente.

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em ratos. O teste quantifica a função de transportadores transmembrana de íons como o regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e o canal de sódio epitelial. É valioso para avaliar a eficácia de novas terapias para a fibrose cística.

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

O epitélio intestinal confere não apenas absorção de nutrientes, mas proteção contra substâncias nocivas. A junção intercelular mais epitelial apical, ou seja, a junção apertada, regula soluto paracelular e permeabilidade de íons. Aqui, é descrito um protocolo para a preparação de folhas mucosas e avaliação da seletividade de íons de junções apertadas usando a técnica da câmara de Ussing.

Avaliação funcional da barreira de junção apertada intestinal e permeabilidade de íons em tecido nativo pela técnica da câmara de ussing

Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.

Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

Células Epiteliais Nasais Humanas Primárias: Biobanco no Contexto da Medicina de Precisão

O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os patógenos respiratórios. Aqui, descrevemos métodos para usar células epiteliais nasais primárias cultivadas como culturas de interface ar-líquido (LPA) para caracterizar interações coronavírus-hospedeiro humano em um sistema fisiologicamente relevante.

Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) combina entrega consistente e de alto rendimento com alta viabilidade celular. A introdução de medições de impedância elétrica transepitelial (TEEI) fornece informações sobre os processos intermediários do PSEP e permite a entrega sem rótulos. Este artigo discute um método para realizar experimentos de entrega de PSEP e análise de medição TEEI simultaneamente.

Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

A cultura de interface ar-líquido é comumente usada para desenvolver epitélio pseudoestratificado das vias aéreas, diferenciando células epiteliais brônquicas humanas normais primárias que imitam o lado apical das vias aéreas pulmonares. Aqui, descrevemos um protocolo fácil para determinar sua qualidade monitorando suas propriedades biofísicas, como função ciliar e integridade da membrana.

Determinando a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas pulmonares

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a medir a diferença de potencial nasal padronizada para avaliar a função dos canais CFTR e ENaC em pesquisa sobre fibrose cística. Este método oferece insights sobre transporte iônico e respostas terapêuticas.

Medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana Nasal (NPD)

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