Name: Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda ensaios de fluxo laminar para investigar recrutamento de leucócitos em células vasculares e plaquetas. Este método econômico e versátil auxilia pesquisadores em imunologia e biologia vascular.

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Agradecemos os Drs Martin M. Schmitt e linha Fraemohs. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Holanda para a investigação científica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fundação para pesquisa de transfusão de sangue (LSBR n. º 1638) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) atribuído a R.R.K.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela ética médica e Animal placas de ética da Universidade de Maastricht.
1. baseado em fluxo de ensaio com células humanas
<ol><li>
Isolamento de plaquetas do sangue humano
	<ol>
<li>Tirar sangue venoso em anticoagulante citrato (3,2%).</li>
		<li>Adicionar 15/1 volume de ácido citrato Dextrose (ACD: citrato trissódico 80mm, ácido cítrico de 52mm e glicose 183 mM) para o sangue.</li>
		<li>Centrifugar a 350 g de x sem freio por 15 min obter plasma rico de plaquetas (PRP).</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL e adicionar o volume de 1/20 do ACD.</li>
		<li>Centrifugar a 1.110 g sem freio por 15 min obter plasma pobre de plaquetas (PPP).</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante. Cortar a extremidade da ponta da pipeta (P. 1000), tornando-o grande furo, que auxilia na prevenção da ativação plaquetária e cuidadosamente suspender o sedimento de plaquetas no mesmo volume que o PRP em plaquetas tampão de pH 6,6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, albumina de soro bovino 0,1% e 0,1% de glicose). Adicionar o volume de 1/20 do ACD e misture suavemente.</li>
		<li>Granule as plaquetas no 1.110 g sem freio por 15 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e cuidadosamente suspender as plaquetas como acima em 1 mL de tampão de plaquetas (pH 7,5).</li>
		<li>Medir a concentração de plaquetas em uma diluição de 1/10 com um analisador de hematologia automatizada.</li>
		<li>Ajuste o volume com tampão de plaquetas (pH 7,5) para alcançar uma contagem de 2 x 107/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento de células polimorfonucleares de sangue humano (adaptado de Brinkmann et al 11 .)
	<ol>
<li>Desenhe 24 mL de sangue em heparina (10 U/mL) como anticoagulante.</li>
		<li>Adicionar 6 mL de meio de diatrizoate de polysucrose de sódio de densidade 1,077 g/mL (ver Tabela de materiais) para um tubo cônico de 15 mL e cuidadosamente a camada 5-6 mL sangue na parte superior.</li>
		<li>Centrifugar por 20 min a 800 x g sem freio.</li>
		<li>Aspire e descartar a camada superior claro amarelada e transferir a fase inferior avermelhada contendo granulócitos em frescos tubos cônicos de 15 mL. Lave as células adicionando PBS contendo 2 mM EDTA até um volume final de 14 mL e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g sem freio.</li>
		<li>Entretanto, preparar um meio de gradiente de densidade (por exemplo, percoll, consulte Tabela de materiais) solução de trabalho misturando meio gradiente de densidade de 18 mL com 2 mL 10 x solução de PBS. Diluir esta solução do trabalho com PBS (1 x) para obter 4,25 mL de cada uma das soluções médias gradientes de 85%, 80%, 75%, 70% e 65%.</li>
		<li>Prepare 2 tubos cónicos com o gradiente de densidade por camadas de 2 mL de cada percentual médio em cima do outro. Comece com a maior concentração e continuar em ordem decrescente. Marca as camadas do tubo com um marcador à prova de água.</li>
		<li>Camada cuidadosamente 2 mL das suspensões celulares para cada um dos dois gradientes preparados.</li>
		<li>Centrifugar por 20 min a 800 x g sem freio em uma centrífuga cuidadosamente equilibrada.</li>
		<li>Após a centrifugação, remover a camada superior e a maioria dos 65% da camada (primeiro anel) com PBMC e coletar em tubos de novos o branco permanecendo interface até a camada de 85% (segundo anel, PMN).</li>
		<li>Lave as células por encher os tubos com PBS 2 mM EDTA e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g sem freio.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e suspender as células sedimentadas (tipicamente ≥ 95% são PMN) em 1 mL de tampão de Hank (pH 7,45), contendo 10 mM Hepes e 0,2% de albumina humana (buffer de ensaio).</li>
		<li>Contar as células usando um hemocytometer e suspender as células em 1 x 106/mL.</li>
		<li>Continue com a rotulagem fluorescente e perfusão dos leucócitos (passo 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de plaquetas aderentes - e célula vasculares-monocamadas
	<ol>
<li>
Preparação de prato de cultura celular (células cultivadas)
		<ol>
<li>Pre-revesti os pratos de cultura de célula de 35mm com 1 mL de colágeno de cauda de rato diluída (30 µ g/mL diluído em PBS, filtrado por um filtro de 0,2 µm).</li>
			<li>Incubar durante 30 min a 37 ° C, descartar a solução de colágeno e lave o prato uma vez com PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Cultura de células vasculares em pratos de cultura
		<ol>
<li>Desanexe primária (por exemplo, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) ou imortalizadas células vasculares (por exemplo, EA. Hy926, SVEC) crescido a confluência em balão T75 1,5 mL solução de desprendimento de células (por exemplo, accutase). Adicione 4,5 mL de meio de cultura apropriado para neutralizar a solução de desprendimento de célula e determinar a concentração de células com uma célula de contagem câmara. Suspenda as células em 0,5 x 105 células/mL em meio de cultura apropriado (por exemplo, meio de crescimento de célula endotelial completa).</li>
			<li>Adicione 2 mL de suspensão de células para cada prato de 35 mm. Cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% CO2 até confluência (tendo 24 – 48 h, dependendo do tipo de célula).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparação da lamela de vidro (plaquetas aderentes)
		<ol>
<li>Mergulhe a lamela de vidro uma vez em HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).</li>
			<li>Enxágue a lamela 2 vezes em água ultrapura.</li>
			<li>Seque a lamela sob N2.</li>
			<li>Pré-revestimento a lamela de vidro com 100 µ l, em conformidade com a posição do canal da câmara de perfusão de colágeno de cauda de rato diluídos tipo I (30 µ g/mL diluído em PBS, filtrado por um filtro de 0,2 µm).</li>
			<li>Incubar durante 30 min à RT, descartar a solução de colágeno e lave a lamela 3 x com PBS.</li>
			<li>Bloco a lamela de colágeno revestido com 1% de BSA em HEPES para 0,5 h no RT</li>
			<li>Lave e seque a lamela e montá-lo na câmara de perfusão. Isole as plaquetas de humano ou sangue de rato, conforme descrito no passo 1.1 e 2.1, respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Imobilização de plaquetas
		<ol>
<li>Adicionar 70 µ l de uma suspensão de plaquetas 2 x 107/mL por canal e incube por 1,5 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
			<li>Cuidadosamente, substitua as plaquetas não-aderente com solução de bloqueio (5% BSA em HEPES) pelo menos 30 min em RT. Continue com rotulagem fluorescente e perfusão dos leucócitos (passo 3.3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Estimulação da monocamada de células vasculares
		<ol>
<li>Estimula as células vasculares, substituindo os meios de comunicação com a mídia fresca contendo 10 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNFa) por 4 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. baseado em fluxo de ensaio com células murino
<ol><li>
Isolamento de plaquetas do sangue de rato
	<ol>
<li>Sorteio de sangue por punção cardíaca, usando uma agulha 21G (~ 1 mL) de anestesiados (cetamina 80 mg/kg e medetomidina 0,3 mg/kg) de 6-8 semanas-ratos velhos (C57Bl/6) no citrato (3,2%) como anticoagulante.</li>
		<li>Adicione o volume de 1/6 da ACD.</li>
		<li>Centrífuga a 220 x g, freio médio por 5 min obter plasma rico de plaquetas (PRP).</li>
		<li>Transferir o sobrenadante (~ 600 µ l) mais 1/3 das células vermelhas do sangue para um tubo novo</li>
		<li>Centrifugar a 95 x g sem freio para 6 min.</li>
		<li>Transfira o sobrenadante (PRP) e medir a concentração de plaquetas em uma diluição de 1/10 no buffer de Tyrode (buffer de TH: 136 mM de NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, albumina de soro bovino 0,1% e 0,1% glicose) com um analisador de hematologia automatizada.</li>
		<li>Lave as plaquetas, adicionando o volume de 1/25 da ACD + 0.1 Apirase U/mL e centrifugar a 2.870 g, freio médio por 2 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 600 µ l TH buffer, volume 1/10 do ACD e 0.1 Apirase U/mL. Cortar a ponta da pipeta (P. 1000), tornando-o grande furo, que auxilia na prevenção da ativação plaquetária e suspender suavemente a pelota.</li>
		<li>Centrífuga a 2.870 g, freio médio por 2 min</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e suspender suavemente as plaquetas no buffer de TH.</li>
		<li>Ajuste o volume com buffer de TH para alcançar uma contagem de 2 x 107/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de monocamadas de plaquetas aderentes
	<ol>
<li>Prepare a lamela de vidro (plaquetas aderentes) conforme 1.3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imobilização de plaquetas
	<ol>
<li>Adicione 100 µ l de uma suspensão de plaquetas 2 x 107/mL por canal e incube por 1,5 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Cuidadosamente, substituir as plaquetas não-aderente com solução de bloqueio (5% BSA em HEPES) pelo menos 30 min em RT. Continue com rotulagem fluorescente e perfusão dos leucócitos (passo 3.3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimulação de monocamadas de plaquetas de rato
	<ol>
<li>Antes da perfusão dos leucócitos (passo 3.3), estimular as plaquetas por perfusão de trombina (0,5 nM) no buffer HHHSA para 3 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fluorescentes rotulagem e perfusão dos leucócitos (PMN ou THP-1 para humanos e RAW264.7 ou Mouse principal monócitos para ensaio baseado em fluxo murino)
<ol><li>
Etiquetando fluorescente
	<ol>
<li>Rotule os leucócitos (1 x 106/mL) com a mancha de ácido nucleico verde fluorescente de célula-permeant (1 µM). Incube as celulas por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar as células com PBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min e suspender as células a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL (5 mL por condição de teste, dependendo da taxa de fluxo) no buffer de ensaio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de ensaio de câmara de fluxo
	<ol>
<li>Para adesão de leucócitos em uma monocamada de células, descartar o meio de cultura celular do prato e montá-lo na câmara de fluxo. Conecte o tubo para a seringa. Para adesão de leucócitos em plaquetas imobilizadas, conecte o micro slide para a seringa. Pré-aquecer o banho-maria a 37 ° C.</li>
		<li>Pegue uma seringa de perfusão (50 mL), seringa de instalação no suporte de seringa e conjunto de retirar a bomba na modalidade. Definir o volume da bomba para 0 mL e definir o diâmetro de 26,70 mm para a seringa de 50 mL.</li>
		<li>Conecte um conector luer em cotovelo para uma extremidade da tubulação. Coloque um acoplador de trava luer na seringa e conecte o tubo com o conector luer cotovelo para o acoplador de fechamento de luer. Conecte a extremidade livre do tubo para a câmara de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adesão e perfusão dos leucócitos
	<ol>
<li>Para adesão de leucócitos em uma monocamada de células, descartar o meio de cultura celular do prato e montá-lo na câmara de fluxo. Conecte o tubo para a seringa. Para adesão de leucócitos em plaquetas imobilizadas, conecte o micro slide para a seringa.</li>
		<li>Para perfusão de leucócitos e adesão sobre um vascular- ou monocamada de plaquetas, coloque o tubo de segundo em um tubo cônico de 50 mL contendo o buffer de ensaio e preenchimento de tubos com pipeta de 1 mL, em seguida, apertar o tubo e conectá-lo a uma câmara de fluxo.</li>
		<li>Antes da perfusão dos leucócitos, adicionar 3 mM CaCl2 e 2 mM MgCl2 à suspensão de células e incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Perfundir buffer de ensaio antes da perfusão de células para remover possível ar da sala e a tubulação.</li>
		<li>Fechar as extremidades do tubo apertando-os firmemente e trocar o tubo de buffer de ensaio à suspensão de células, impedindo que as bolhas de ar sendo preso. Perfundir células com tensão de taxa/cisalhamento do fluxo adequado até que cheguem as primeiras células.</li>
		<li>Perfundir células com estresse de cisalhamento/taxa fluxo apropriado por 2 min e capturar pelo menos 6 fotos entre 2-6 min de rolamento e aderentes de células com um microscópio de fluorescência/contraste de fase invertida (por exemplo, EVOS-FL) usando a ampliação de 100 X conectado para uma câmera digital CCD ou CMOS. Nota: Stress/tensão de corte de taxa de fluxo depende de dimensões de câmara de fluxo e viscosidade do perfusato. Para a câmara de perfusão usada aqui (veja a Tabela de materiais): Τ =η* 97.1*Φ Τ: tensão de cisalhamento (1 dyn/cm2) Η: viscosidade (0.015 dyn * s/cm2) Φ: taxa de fluxo (0,67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A adesão de leucócitos
	<ol>
<li>Para de-adhesion, trocar tubulação de suspensão de células para buffer de ensaio apertando o tubo, impedindo que as bolhas de ar tornando-se presa.</li>
		<li>Separe células por perfusão com buffer de ensaio com uma tensão de taxa/cisalhamento do fluxo apropriado (ver 3.3.7 nota).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmigração de leucócitos
	<ol>
<li>Para transmigração de leucócitos, perfundir leucócitos (etapa 3) até que uma quantidade adequada de leucócitos aderem (campo de ~ 50 células/modo de exibição).</li>
		<li>Substitua a suspensão de leucócitos com buffer de ensaio.</li>
		<li>Gravar reencarnando células por lapso de tempo a cada 10-15 s para 30 a 60 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
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<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
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<li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li>
<li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα.</a> Nature communications. 8, 15559(2017).</li>
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<li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386106013061">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este ensaio em vitro é um método simples para investigar os mecanismos subjacentes de recrutamento de leucócitos durante a inflamação vascular, mas existem alguns pontos críticos a ser anotadas. O primeiro requisito para executar com êxito este ensaio é a perfusão de leucócitos sobre uma intacta e confluente vasculares ou monocamada de plaquetas. Isto pode ser conseguido pela prévia do revestimento das superfícies com colágeno tipo eu. Em geral, quando se trabalha com células vasculares primárias, é importante d...

Após lesão, inflamação ou infecção, leucócitos respondem rapidamente ao patógeno ou dano-associada molecular padrões (PAMPs, represas), mudar para um estado ativado e mover fora do fluxo de sangue para locais de inflamação e tecido danos. A capacidade dos leucócitos de interagir com seu ambiente celular e molecular é essencial para a sua correta função como células do sistema imunológico, como destacado por desordens genéticas, como a adesão de leucócitos deficiência1. Adesão de leucócitos tem sido objecto de intensa investigação durante as últimas décadas, e isto resultou no conceito de cascata de adesão de leucócitos no início da década de 1990,2,3. Adesão de leucócitos é iniciada pela captura selectina-mediada dos leucócitos ao endotélio, fazendo com que as células a rolar sobre a superfície vascular. Este rolamento permite leucócitos procurar pistas migratórias endotélio-limite, por exemplo, quimiocinas, que induzem a ativação das integrinas. Posteriormente, as integrinas activadas mediam a ligação a ligantes endoteliais, resultando na prisão de leucócitos firme. Leucócitos podem posteriormente Prepare-se para extravasate rastejando e espalhando-se, antes de penetrar a monocamada endotelial e reencarnando no tecido subjacente. O conceito básico da cascata canônico leucócito tem permaneceram praticamente inalteradas desde a sua introdução, com algumas etapas intermediárias adicionado4. No entanto, os mecanismos moleculares exatos e os papéis de muitos jogadores envolvidos no recrutamento de leucócitos não foram clarificados, até agora, e recrutamento de leucócitos continua a ser um tema importante no campo da infecção, inflamação e (auto-) imune pesquisa.
Por exemplo, durante doenças inflamatórias vasculares como aterosclerose, aumentou o recrutamento de leucócitos para o vaso parede drives placa desenvolvimento. Ateroma instável pode se romper, levando à enorme ativação de plaquetas e o sistema de coagulação e posteriormente à oclusão do vaso5. Isso pode resultar em graves resultados cardiovasculares como infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral. Além disso, por exemplo, após implante de stent de uma artéria coronária, desnudamento endotelial que ocorre clinicamente, conduz a uma infinidade de interações de leucócitos e plaquetas para o interior de parede vaso expostas (por exemplo, componentes de matriz e liso as células do músculo) e de leucócitos com plaquetas cobrindo a lesão vascular. Essas interações são importantes para o desenvolvimento da doença como interações monócito plaquetas podem conduzir neointima formação6,7. Além disso, as interações leucócito-plaquetas mediada por leucócitos integrina Mac-1 (M. α β2) e plaquetas GPIbα recentemente foram identificados como drivers de romance de trombose em ratos8.
Dada a ampla disponibilidade de sangue humano e animal como fonte de leucócitos e plaquetas para pesquisa e o amplo espectro de moléculas isoladas de matriz e linhas de célula imortalizado de origem vascular e leucócitos, é possível simular leucócitos interações sob fluxo em um laboratório de configuração, usando câmaras de perfusão de fluxo especialmente concebidos. Muitas variantes foram projetadas nas últimas décadas, variando de orientado a vácuo para câmaras de perfusão autoadesivo. Todas as variantes têm em comum que a parte imóvel (por exemplo, culturas de células vasculares ou proteínas da matriz) é montada em uma câmara de estanques maior equipada com um canal predefinido permitindo a perfusão dos fluidos sobre a parte do imóvel. Além disso, os avanços na tecnologia de moldagem permitiram o desenvolvimento de soluções sob medidas com base em polímeros de silicone9. A viscosidade e a taxa de fluxo do líquido perfundido e a altura do canal principalmente determinam as características de tensão de cisalhamento do fluxo da perfusão dispositivo10. Neste artigo, apresentamos uma in vitro método para estudar os mecanismos subjacentes da adesão, de adesão e transmigração de leucócitos sob regimes de fluxo arterial e venoso. A vantagem dos métodos apresentados aqui é que eles podem ser executados usando um microscópio de fluorescência conectado a câmera comum e não exigem um experimentadores possuir alta proficiência técnica. O ensaio em vitro podem ser manipulado de várias maneiras (por exemplo, adicionando inibidores ou bloqueando os anticorpos) e, portanto, é aplicável em diferentes modelos de inflamação vascular e permite a investigação de adesão funções de proteína ou o avaliação de compostos específicos.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida, por exemplo, EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba e.g. modelo: 210-CE&</td><td>nbsp; World Precision Instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 50 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone&nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Conector Luer de Cotovelo Macho</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador Luer Lock Fêmea</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Fluxo</td> Hospital <td>Universitário RWTH Aachen</td><td></td><td>DE10328277A1 de patentes: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml; ngen an Zelloberfl&auml; Chen. 2005.&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide adesivo Ibidi VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas para slides pegajosas&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I, cauda de rato</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>TNF humano recombinante-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Ativador do Receptor de Trombina para Peptídeo 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 verde fluorescente mancha de ácido nucleico</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solução salina balanceada 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES 1M, líquido</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albumina, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Água para injeção</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apirase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana Primária (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais (Pronto para uso)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Células Endoteliais Aórticas Humanas Primárias (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Meio Basal de Células Vasculares</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Crescimento de Células Endoteliais-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Células Musculares Lisas Aórticas Humanas Primárias (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Crescimento de Células Musculares Lisas Vasculares</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Linha de células endoteliais humanas, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Meio de Eagle modificado (DMEM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Linha de células endoteliais de camundongo, SV 40 transformado (SVEC4-10)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular monocítica humana, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 com ultra-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F / U1</td><td></td></tr><tr><td>Monócito de camundongo / macrófago RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Tubos de Coleta de Sangue de Plástico Vacutainer com Heparina de Sódio</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulação citrato de sódio 3.2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>mistura de HCl/EtOH (1,2 mol/L de HCl e 50% de etanol) em água</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Prepare misturando 0,3L de HCl (4 mol/L) com 0,7L de etanol a 70% v/v em uma capela</td><td></td> de exaustão</tr></tbody></table>

ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

O recrutamento de leucócitos após lesão ou inflamação a locais de lesão ou dano tecidual foi investigado durante décadas recentes e resultou no conceito de cascata de adesão de leucócitos. No entanto, os mecanismos moleculares exatos envolvidos no recrutamento de leucócitos ainda não foram totalmente identificados. Desde o recrutamento de leucócitos continua a ser um tema importante no campo da infecção, inflamação e (auto) imune pesquisa, apresentamos um ensaio simples baseada em fluxo laminar para estudar os mecanismos subjacentes da adesão, de adesão, e transmigração de leucócitos sob regimes de fluxo arterial e venoso. O ensaio em vitro pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre leucócitos e seus parceiros celulares em diferentes modelos de inflamação vascular. Este protocolo descreve um ensaio baseado em fluxo laminar, utilizando uma câmara de fluxo paralelo e um microscópio de contraste de fase invertido conectado a uma câmera para estudar as interações de leucócitos e células endoteliais ou plaquetas, que podem ser visualizadas e gravadas em seguida análise off-line. Células endoteliais, plaquetas ou leucócitos podem ser pré-tratados com inibidores ou anticorpos para determinar o papel de moléculas específicas durante este processo. Condições de cisalhamento, ou seja, arterial ou venosa tensão de cisalhamento, podem ser facilmente adaptadas pela viscosidade e vazão dos fluidos perfundidos e a altura do canal.

Para estudar a adesão endotelial de leucócitos, células de THP-1 fluorescente etiquetadas foram perfundidas sobre uma monocamada endotelial TNFa - ou não-estimulada por 2 min em 3 Dina/cm2. O número total de células monocítica aderentes foi determinado após 2 min de perfusão capturando 6 campos independentes durante um período de 2-6 min. As células aderentes foram quantificadas pelo menos 6 imagens capturadas com um microscópio de fluorescência/contraste de fase invertida (<em...

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

O objetivo geral deste experimento é investigar os mecanismos por trás das interações dos leucócitos com células vasculares aderentes ou plaquetas sob condições de fluxo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como a forma como os leucócitos são recrutados para locais de inflamação. A principal vantagem dessa técnica é que ela é econômica, fácil de usar e permite a investigação de uma grande variedade de condições experimentais.Este método pode fornecer informações sobre a adesão leucocitária. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como a adesão de células tumorais a células imobilizadas ou substratos em condições de fluxo. Demonstrando o procedimento estará Annemiek Dickhout, engenheira e estudante de doutorado que trabalha em meu laboratório.Depois de obter amostras de sangue, adicione 1/15 do volume de citrato ácido dextrose ao sangue. Em seguida, centrifugue a amostra de sangue acionando os freios em 350 vezes g por 15 minutos para obter plasma rico em plaquetas. Em seguida, transferir o sobrenadante obtido para um tubo cónico de 15 mililitros e adicionar-lhe 1/10 do volume de citrato ácido dextrose.Mais uma vez, centrifugue a suspensã

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar a interação de leucócitos e parceiros celulares, como células endoteliais. Este método fornece informações dinâmicas sobre adesão, desadesão e transmigração de leucócitos quando perfundidos sobre uma camada intacta e confluente de células vasculares.

Um ensaio baseado em fluxo laminar para estudar as interações entre leucócitos e células endoteliais

O vídeo demonstra um método para investigar o impacto das células estromais no recrutamento de leucócitos. Em um modelo de câmara de fluxo de placas paralelas, citocinas pró-inflamatórias induzem a expressão de receptores de adesão pelas células endoteliais, facilitando o recrutamento e a migração de neutrófilos. A conversa cruzada entre células estromais e células endoteliais diminui o recrutamento de neutrófilos para as células endoteliais.

Uma investigação de fluxo in vitro do efeito das células estromais no recrutamento de leucócitos

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Este protocolo passo a passo fornece uma descrição detalhada da instalação experimental e análise de dados para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs e a análise da adesão de leucócitos sob fluxo fisiológico.

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Aprenda ensaios de fluxo laminar para investigar recrutamento de leucócitos em células vasculares e plaquetas. Este método econômico e versátil auxilia pesquisadores em imunologia e biologia vascular.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

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