Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Descobrimos que o HLA-I é epigeneticamente para baixo regulado em uma subpopulação de células cancerosas que exibem propriedades de células-tronco e capacidade de início de tumor. A baixa regulação do HLA-I está diretamente relacionada à fuga imunológica, proporcionando vantagens de sobrevivência para células-tronco cancerosas, tornando assim a negatividade HLA-I um marcador funcional preciso para essas células. Demonstrando o procedimento será Sudeh Izadmehr, um pós-doutor do nosso laboratório.

Após a aquisição da amostra, coloque o tecido em uma placa de Petri de 100 milímetros em um armário de bio segurança esterilizado, e adicione 500 microliters de PBS estéril ao prato. Use um bisturi estéril para triturar mecanicamente o tecido em pequenos pedaços até que nenhum fragmento seja maior que 0,1 milímetro. Transfira todo o volume de 500 microliter de PBS através de um coador de células poros de 35 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.

Adicione mais 500 microliters de PBS aos fragmentos de tecido, e pique os tecidos novamente. Em seguida, filtre o supernascer através do coador celular no mesmo tubo de coleta, e continue a picar os pedaços de tecido até que a amostra seja completamente dissociada. Quando o último volume de células tiver sido coletado, gire as células tumorais por centrifugação, e suspenda a pelota em cinco mililitros de tampão de hemólise.

Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, colete as células com outra centrifugação, e lave a pelota com outros cinco mililitros de PBS. Suspenda a pelota em um mililitro da PBS, e conte as células viáveis. Diluir as células para uma única vezes 10 a sete células por 200 microliters de concentração de PBS no gelo, e adicionar 200 microliters de matriz de membrana de porão às células com mistura suave.

Em seguida, injete a matriz de membrana de suspensão celular subcutânea no flanco de um rato gama scid scid nod, e verifique o crescimento do tumor no local da injeção duas vezes por semana. Quando o tumor atingir um centímetro de diâmetro, corte o tumor ao meio e fixe metade do xenoenxerto com 4% de paraformaldeído durante a noite para análise histológica. Processe a segunda metade do tumor como apenas demonstrado para alcançar uma única suspensão celular, e dilua as células para duas vezes 10 para as seis células por mililitro de PBS suplementado com concentração de 5% de FBS.

Mantenha as células no gelo por 30 minutos antes de dividir a suspensão celular entre um controle isótipo e um tubo de anticorpos. Observe o número de células em cada tubo, e misture as células no tubo de anticorpo com anticorpos anti-HLA e as células no tubo de controle do isótipo com um anticorpo de controle anti-isótipo apropriado para uma incubação de 90 minutos no gelo. Ao final da incubação, coletar ambas as populações celulares por centrifugação, seguida por duas lavagens pbs de 10 mililitros por centrifugação.

Após a segunda lavagem, suspenda as pelotas em 10 microgramas por mililitro de DAPI para uma única vezes 10 às sete células por concentração mililitro. Em seguida, filtre cada suspensão celular através de um filtro de poros de 35 micrômetros em tubos individuais de poliestireno de 12 por 75 milímetros. Após a triagem celular ativada pela fluorescência, dilui as populações celulares HLA-I-negativas e positivas para indivíduos uma vez 10 a cinco concentrações celulares em 15 mililitros do meio de crescimento da sarcósfera por subconjunto.

Diluir as células em uma vez 10 para a quarta, 10 para a terceira, e 10 para a segunda concentrações em 15 mililitros de crescimento fresco sarcosfera médio por diluição, e adicionar 100 microliters de células de cada diluição a cada poço de uma placa de cultura celular de 96 poços ultra-baixos por diluição. Coloque as placas em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono de 37 graus Celsius, 5%, monitorando a formação da sarcosfera diariamente por microscopia leve e adicionando fator de crescimento de fibroblasto básico fresco e fator de crescimento epidérmico a cada poço sem alterar o meio a cada três dias. Após três semanas, conte o número de poços positivos e sarcosfera-negativos para cada diluição celular de células HLA-I-negativas e HLA-I-positivas para permitir o cálculo da frequência celular formadora de esferas com base em uma distribuição de probabilidade de Poisson.

Tipicamente, os xenerxertos de sarcoma derivados do paciente humano consistem em duas populações distintas de HLA-I-positivo e negativo, com uma histologia semelhante à demonstrada pelo tumor primário parental. A triagem celular ativada pela fluorescência de células cancerígenas derivadas do paciente sarcoma, como demonstrado, facilita o enriquecimento de um alto número de células HLA-I-negativas da população celular parental. As células HLA-I-negativas são capazes de formar esferas com uma entrada inicial de apenas 10 células e apresentar uma maior capacidade de formação tumoral do que o paciente hla-i-positivo sarcoma chegou células que iniciam tumores de xenoenxerto.

A injeção do mesmo número de células negativas e positivas HLA-I subcutâneas em flancos opostos do mesmo rato demonstra que as células HLA-I-negativas possuem uma capacidade significativamente maior de formação de tumores. Enquanto os xenoenxertos formados por subpopulações negativas e positivas do HLA-I são tumores celularmente heterogêneos. Além disso, a análise da expressão genética das células iniciadoras do tumor revela que as células HLA-I-negativas expressam marcadores de diferenciação de células-tronco e podem ser induzidas a se diferenciar ao longo das vias lipogênicas e osteogênicas, demonstrando fortes manchas e cultura de Óleo-Vermelho-O e Alizarin-Red-S.

Este método pode ser usado para isolar células-tronco cancerígenas em vários cânceres humanos. A carbonização molecular, por exemplo, pelo sequenciamento de próxima geração pode revelar marcadores comuns para atingir as células terapeuticamente. Nossa descoberta demonstra que a restauração do HLA-I é um passo crítico para o sucesso das estratégias de aumento de células imunes da unidade funcional.