Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

O objetivo geral deste procedimento é cultivar cérebros de larvas de Drosophila para microscopia de fluorescência de lapso de tempo de vários dias. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogenética de Drosophila, como alterações na expressão gênica que ocorrem em populações neuronais específicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a imagem de sondas fluorescentes com resolução de célula única no cérebro vivo ao longo de horas a dias.

Ao preparar os reagentes para este procedimento, trabalhe sob uma capa de cultura. Tanto uma alíquota do meio SAM quanto da trombina devem ser descongeladas para começar. Reserve a trombina.

Pegue uma alíquota de 2,5 mililitros de SAM, coloque o SAM restante no gelo e reserve. Em seguida, coloque a penicilina estreptomicina no SAM aliquotado e mantenha-o em temperatura ambiente. Para experimentos de imagem de longo prazo, prepare uma câmara de imagem, aplique graxa a vácuo autoclavada nas regiões plásticas ao redor do poço de um prato com fundo de vidro.

Em seguida, esterilize o prato untado com luz ultravioleta sob o capô. Agora, misture uma alíquota de SAM no fibrinogênio e transfira a mistura para 37 graus Celsius, onde não polimerizará por duas horas. Para a dissecção, limpe a pinça em duas placas de dissecação de vidro de três poços com etanol a 70%.

Em seguida, carregue quatro poços com 400 microlitros de DSS e um poço com 400 microlitros de SAM. Mantenha as placas de dissecação em um prato refrigerado. De um frasco de moscas que se propagam, retire algum meio contendo larvas de terceiro ínstar não errantes e transfira até sete com uma pinça para um poço de DSS frio.

Em seguida, passe as larvas por três dos quatro poços carregados com DSS para limpá-las. Deixe-os no poço final até serem dissecados. Use o quarto poço de DSS para dissecar os cérebros larvais com um par de pinças finas e limpas.

Use o método bem estabelecido de dentro para fora. Com proficiência, cada larva pode ser processada em cerca de 30 segundos. Após cada dissecção, use uma ponta de pipeta de 20 microlitros pré-enxaguada com DSS para transferir o cérebro em cerca de três microlitros de DSS para o poço cheio de SAM.

Prepare até sete cérebros para o procedimento de incorporação. Depois de transferir o cérebro para a solução de trabalho, dispense o cérebro e o meio na tampa de uma placa de Petri estéril. Em seguida, adicione mais 3,5 microlitros de SAM com antibióticos e adicione 3,5 microlitros de SAM quente com fibrinogênio.

É importante manter o meio SAM com fibrinogênio a 37 graus durante todo o procedimento. Em seguida, misture a solução ao redor do cérebro pipetando suavemente com a mesma ponta da pipeta e aspire dois microlitros da solução para depositar em uma lamínula para um prato com fundo de vidro. Em seguida, adicione 0,8 microlitros de trombina à gota e misture muito rapidamente para inicializar a polimerização, que ficará branca.

Em seguida, use uma pinça para pegar suavemente o cérebro e colocá-lo na matriz de fibrina polimerizante. Acho que a trombina, depois que o cérebro foi transferido para a gotícula, não é recomendada, pois complica muito o procedimento. Oriente o cérebro conforme necessário e empurre-o o mais próximo possível da lamínula.

Em seguida, pegue uma camada de fibrina polimerizada e dobre-a no topo do cérebro usando movimentos pequenos e suaves que não desprendem a matriz. Continue a dobrar camadas de fibrina polimerizada sobre o cérebro de diferentes partes do coágulo para estabilizar o cérebro. Em seguida, deposite 20 microlitros de SAM com antibióticos sobre o cérebro incorporado para interromper a atividade da trombina.

Usando este procedimento, prossiga com a incorporação de cinco a seis cérebros em um prato com fundo de vidro. Para imagens de longo prazo, mergulhe os cérebros incorporados em 600 microlitros de SAM com antibióticos. Em seguida, coloque um pedaço de membrana de PTFE sobre o meio e cole as bordas da membrana nas partes untadas do prato.

Para ensaios curtos, encha o prato com dois mililitros de SAM com antibióticos, imergindo o cérebro e omita o uso da membrana de PTFE. Usando os procedimentos descritos, os cérebros que expressam um repórter de relógio molecular acionado por um driver de neurônio de relógio foram arrastados em claro-escuro e preparados como culturas de explante. As culturas de longo prazo foram montadas durante a fase clara, pouco antes do anoitecer.

Uma pilha de SUMs contendo o neurônio de interesse foi criada na intensidade média de fluorescência da área correspondente ao neurônio foi medida após a subtração de fundo. Para determinar a ritmicidade da expressão do repórter, foram utilizadas tanto a análise espectral de entropia máxima quanto a inspeção manual. Em seguida, larvas do mesmo genótipo foram dissecadas uma hora após o amanhecer subjetivo ou uma hora após o crepúsculo subjetivo.

Os cérebros foram fotografados duas vezes em uma hora para obter uma linha de base. Em seguida, PDF ou veículo foi adicionado ao meio de cultura e os cérebros foram fotografados de hora em hora por seis horas. Em cérebros colhidos logo após o anoitecer, o perfil de expressão de PER-TDT em LNvs mostrou um aumento dependente do tempo do dia na intensidade de fluorescência após a adição de PDF.

Isso também ocorreu nos DN1s e, em menor grau, nos DN2s. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer cultura cerebral ex vivo a partir de larvas de Drosophila usando uma matriz 3D de fibrina. Uma vez dominado, todo o procedimento leva cerca de 30 minutos, desde a dissecção até a incorporação.

Antes de iniciar as dissecções, prepare a configuração da imagem para que o cérebro possa ser visualizado imediatamente após a incorporação. Após este procedimento, os cérebros adultos de Drosophila também podem ser cultivados para imagens de lapso de tempo de fluorescência, a fim de responder a perguntas adicionais.