Name: Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a realizar imunoprecipitação de cromatina nativa em neuroesferas de tumor cerebral murino para estudar modificações de histonas e alterações epigenéticas em gliomas. Este método preserva a integridade celular.

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Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; o departamento de neurocirurgia; Leah está feliz corações e Chad embora Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. é suportado pelo NIH / NIGMS concessão 5T34GM007821-37.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. geração de tumor cerebral NS e as condições de cultivo.
<ol><li>Prepare o meio de células-tronco neurais (NSC) com de Dulbecco suplemento modificado águia médio/F12B27 (1x), suplemento de N2 (1x) e um reagente antimicrobiano. Suplemento médio NSC no dia de uso com humano recombinante fator de crescimento endotelial (EGF) e fator de crescimento fibroblástico-basic (FGF) em uma concentração final de 20 ng/mL cada.</li>
	<li>Induzi o tumor cerebral no mouse usando o sistema de transposon de bela adormecida em que plasmídeos codificação oncogenes ou shRNA alvo supressores de tumor são injetados dos ventrículos laterais de recém-nascidos para gerar tumores de cérebro espontânea9. Selecione um rato com um tumor grande, o que é confirmado com imagens de bioluminescência. Nota: Informações mais detalhadas sobre os sistema de Transposon beleza dormindo e plasmídeo construções usadas podem ser encontradas em Calinescu et al 9.<ol>
<li>Para os ratos de imagem, injete 100 µ l de 30 mg/mL solução de luciferina intraperitonealmente usando uma agulha de 26 calibre.</li>
		<li>5 min após injeção de luciferina, anestesiar o animal utilizando uma câmara de anestesia com fluxo de oxigênio/isoflurano definido como 2% de isoflurano.</li>
		<li>Quando os animais são anestesiados (geralmente 2-3 min), colocar os animais na câmara de bioluminescência com isoflurano oxigênio definido como 2% de isoflurano. Se os animais ficarão sob anestesia por mais de 5 min, use uma pomada oftálmica para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.</li>
		<li>Os ratos usando um na vivo óptico sistema com os seguintes parâmetros de imagem da imagem: exposição automática, grande binning e abertura f = 1. O parâmetro para considerá-lo um grande tumor é uma bioluminescência > 106 fótons/s/cm2/sr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanásia o mouse com uma overdose de inalação de isoflurano anestésica em uma câmara fechada, verifique por pitada de dedo do pé que o animal é anestesiado e decapitar o mouse.</li>
	<li>Extrair o cérebro e dissecá-lo conforme descrito anteriormente em Calinescu et al 9.</li>
	<li>Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 10 cm. Se o tumor induzido expressa uma proteína fluorescente, uso uma fluorescente microscópio de dissecção definido para o respectivo canal fluorescente e ampliação de X 0,3, caso contrário identificar massa tumoral pelas diferenças na cor do tecido e textura. Use o bisturi e pinça para separar o tecido do tumor de cérebro normal.</li>
	<li>Picar o tumor em pedaços pequenos na prato de Petri. Coloque o tumor dissecado em um tubo de 1,5 mL com 300 µ l de meio de NSC.</li>
	<li>Use um pilão de aglomerados de plástico descartável que se adapta às paredes de um tubo cónico microcentrifuga para homogeneizar suavemente o tumor. Adicionar 1 mL de meio de desprendimento celular e incubar a amostra por 5 min a 37 ° C. Nota: O uso de um pilão pode matar algumas células. Se o leitor quer maximizar a viabilidade celular, o uso de um pilão pode ser omitido.</li>
	<li>Passe a suspensão de células da etapa 1.7 através de um filtro de célula 70 µm e lavar o filtro com 25 mL de meio de NSC.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente, decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 6 mL de meio de NSC.</li>
	<li>A suspensão de células de tumor da etapa 1.9 num frasco de cultura T-25 da placa e cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO2. Geralmente após 3 dias, haverá uma mistura de algumas células mortas, as células aderidas e algumas células formando NS que flutuam no meio.</li>
	<li>Transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL, coletar somente as células que afundam até o fundo, utilizando uma micropipeta e re-placa-los em um frasco de cultura de tecidos T-75.</li>
	<li>Manter as células em densidade relativamente alta (1-3 X 106 células em um T-25). Passagem das células quando elas são confluentes. Nota: Confluência é determinada pelo tamanho esferas. Black centros de esferas grande significa que lá são células mortas no centro e indicam que as células devem ser passadas imediatamente.</li>
	<li>Adicionar os fatores de crescimento (EGF e basic-FGF; 20 ng/mL cada) em três dias. Mude o meio, quando as células não são confluente e a médio transforma luz laranja.</li>
	<li>Para mudar o meio, recolher o meio velho e centrifugue a 300 x g, à temperatura ambiente por 5 min e ressuspender o pellet de células em meio de NSC suplementado com EGF e FGF na concentração especificada na etapa 1.1. Nota: Se as esferas são em meados-a confluência de alta, mas não está pronto para ser passadas (esfera tamanho é pequeno, com um diâmetro < 100 µm), em seguida, o sedimento pode ser dividido em dois balões.</li>
	<li>Para passagem das células, as células a 300 x g por 5 min à temperatura de centrifugação, decante o sobrenadante e incubar as células em meio de desprendimento celular por 5 min a 37 ° C.<ol>
<li>Adicionar 5 mL de solução salina equilibrada para meio de desprendimento diluído e centrifugue a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Decante o sobrenadante e ressuspender as células em 18 mL do meio de NSC dividir a suspensão igualmente em três frascos de T-25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para congelar as alíquotas de células, dissociar as células como na etapa 1.15 e congelar as células em alíquotas de 1 mL de soro bovino fetal de 90% com 10% de dimetil sulfóxido. Esfriar lentamente as células colocando as células no gelo por 10 minutos e, em seguida, mantendo as células-20 ° C por 30 min e -80 ° C durante 1 dia. No dia seguinte, transfira as células para um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido.</li>
</ol>2. nativo ChIP
<ol><li>Preparação de cromatina<ol>
<li>Depois de fazer estoque de NS derivada, cultura NS em um T-75 em 15 mL de meio de NSC a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de ar de 95% e 5% CO2 até NS se tornar confluentes. Um prato de T-75 confluente renderá 3-5 X 106 células.</li>
		<li>Quando as células se tornam confluentes, centrifugar NS a 300 x g durante 5 min, decantar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio de dissociação celular. Incubar as células a 37 ° C por 5 min. Adicione 5 mL de meio e contar as células usando um hemocytometer10. Nota: 1 x 106 células são necessários por reação de imunoprecipitação (IP). Observe que um soro pre- imune ou controle de IgG também deve ser incluído11.</li>
		<li>Centrifugue o NS em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL a 300 x g por 5 min, decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet NS com 1 mL de solução salina equilibrada e transferir a suspensão para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL de ligação de baixa proteína.</li>
		<li>NS de centrifugação a 300 x g por 5 min, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 95 µ l de tampão de digestão (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2, 0,2% polietileno glicol octilfenil éter) por 1 x 106 células suplementadas com protease inibidor de cocktail em uma concentração elevada (1: 100). Imediatamente Pipetar as células acima e para baixo, para evitar a aglutinação e evitar a criação de quaisquer bolhas.</li>
		<li>Resuspenda MNase em 50% de glicerol para fazer 1 mg/mL solução (1,15 unidades / µ l, armazenado a-20 ° C) que será referida como estoque "1x". Fazer um "0.1 x" estoque fazendo uma diluição de 1:9 segunda com 50% de glicerol (EG., 900 µ l de "1x" MNase e 100 µ l de glicerol a 50%) e armazená-lo a-20 ° C.</li>
		<li>Mistura de 5 µ l de "0,1 x" MNase e 145 µ l de tampão de digestão. Manter a enzima no gelo todas as vezes. Adicione 5 µ l de MNase diluída em tampão de digestão por 1 x 106 células. Filme do tubo para misturar e coloque o tubo no bloco de 37 ° C por exatamente 12 min. processo as amostras de um de cada vez para garantir um tempo de incubação precisos 12 min.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de 10 x MNase parar de Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM EDTA) por 1 x 106 células. As amostras devem ser mantidas no gelo a partir deste momento.</li>
		<li>Adicionar 110 µ l "buffer de x RIPA 2" (280 mM NaCl, 1,8% polietileno glicol octilfenil éter 0,2% sulfato dodecyl de sódio (SDS), 0,2% Deoxycholate at-do, 5mm glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA); armazenadas a 4 ° C) suplementado com inibidor de protease cocktail em concentração elevada (1: 100) por 1 x 106 células. Agite o tubo para misturar.</li>
		<li>Centrifugar os tubos por 15 min em uma microcentrífuga a 4 ° C e 1700 x g transferir o sobrenadante para um novo tubos de microcentrifuga regular 1,5 mL (tubos de microcentrifuga de ligação de baixa proteína não são mais necessários) e armazená-los no gelo. Descarte a pelota.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunoprecipitação (IP)<ol>
<li>Mix de proteína A e proteína G grânulos magnéticos em uma proporção de 1:1. Para cada IP, prepare 25 µ l de grânulos.</li>
		<li>Lave os grânulos, adicionando 1 mL de tampão RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM de NaCl, 1% de polietileno glicol octilfenil éter, 0,1% SDS, 0,1% at-Deoxycholate do; armazenadas a 4 ° C) suplementado com inibidores de protease em baixa concentração (1: 1000).</li>
		<li>Use um ímã para permitir que contas separar a solução de lavagem e decantar a solução de lavagem (aproximadamente 1 min). Execute a etapa de lavagem, duas vezes.</li>
		<li>Re-suspenda as contas para o volume original usando o amortecedor de RIPA suplementado com inibidores de protease (1: 1000).</li>
		<li>Se necessário, diluir a cromatina usando amortecedor de RIPA suplementado com inibidores de protease (1: 1000) para que cada IP tem um volume de 100 a 200 µ l. reserva 10% do volume utilizado por IP da cromatina para a entrada. Nota: por exemplo, se 200 µ l são usados por IP, 20 µ l de cromatina diluída deve ser reservada para a entrada. Para um total de quatro IPs, volume de cromatina total deve ser diluído a 820 µ l.</li>
		<li>Prepare a entrada. Adicionar 100 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) suplementado com proteinase K (0,5 mg/mL) para a entrada e incubar a entrada a 55 ° C, durante 1 h. Nota: 2.2.6-2.2.7 etapas podem ser executadas junto com etapas 2.3.4 e 2.4.1.</li>
		<li>Purificar a entrada usando um kit de purificação de PCR seguindo as instruções do fabricante e eluir em 50 µ l de tampão de eluição fornecido no kit.</li>
		<li>Medir a concentração de entrada usando um spectrophotometer microvolume e registre os resultados em um notebook. Em branco com o tampão de eluição do kit. Nota: Em neurospheres de rato, usamos cerca de 6 µ g de DNA para cada IP.</li>
		<li>Executar entrada em um gel de 1% ou 1 µ l em um Bioanalyzer de DNA usando as configurações padrão de carga. Guarde o restante para uso como entrada em aplicações a jusante.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de proteína lavada A & grânulos magnéticos G para cada IP e IP, incubar durante 1 h a 4 ° C. Nota: por exemplo, adicione 30 µ l de proteína A & grânulos magnéticos G para três IPs.</li>
		<li>Colocar as amostras em um ímã e permitir grânulos separar. Divida a cromatina transferindo o montante previamente determinado em um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione o anticorpo e embrulhar as tampas com filme plástico parafina para evitar a evaporação. Incube as amostras durante a noite a 4 ° C com rotação a 20 rpm. Nota: Concentração deve ser determinada empiricamente, seguindo as recomendações do fabricante.</li>
		<li>No dia seguinte, gire os tubos usando uma mini centrífuga à temperatura ambiente, 2000 x g, por 10 s. Em seguida adicionar 10 µ l de grânulos para cada IP e incubar IP durante 3 h a 4 ° C com rotação a 20 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavagens IP e digestão de proteínas<ol>
<li>Adicionar 150 µ l de tampão RIPA suplementado com inibidores de protease em baixa concentração (1: 1000) para cada IP e IP, incubar a 4 ° C, com rotação a 20 rpm durante 5 min. lugar a amostra num suporte magnético e permitem que os grânulos magnéticos separar. Use uma pipeta para retirar o sobrenadante. Repita este lavagens cinco tep.</li>
		<li>Adicionar 150 µ l de tampão de LiCl (250 mM LiCl, pH de Tris 10 mM, 8.0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% at-Deoxycholate do; loja a 4 ° C) suplementado com inibidores de protease em baixa concentração (1: 1000) para cada IP e IP, incubar a 4 ° C, com rotação a 20 rpm durante 5 min. lugar a amostra em um magnético fique e permitir grânulos magnéticos separar. Use uma pipeta para retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 150 µ l de TE frio (sem inibidores de protease) e incubar a amostra a 4 ° C com rotação a 20 rpm durante 5 min. lugar a amostra num suporte magnético e permitir grânulos magnéticos separar. Use uma pipeta para retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Após a etapa de lavagem final, re-suspender a amostra em 100 µ l de tampão TE suplementado com proteinase K (0,5 mg/mL) e incubar a amostra a 55 ° C, durante 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de DNA e PCR em tempo real quantitativo de ChIP (qPCR)<ol>
<li>Purifica DNA immunoprecipitated usando um kit de purificação de PCR. Após a adição de tampão de ligação de DNA do kit para cada amostra, colocar o tubo em um ímã e espere até magnéticas contas agregadas, depois transfira o sobrenadante para a coluna de limpeza. Siga as instruções do fabricante e eluir em 50 µ l de tampão de eluição fornecido no kit.</li>
		<li>Para verificar se o IP for bem-sucedida, execute um qPCR. Idealmente, as primeiras demão devem ser projetadas para as regiões de controle positivo e negativo. Nota: por exemplo, para um IP realizada com H3K4me3 e H3K27me3, os exemplos a seguir devem ser executados em qPCR: H3K4me3, H3K27me3 e IgG ChIP DNA, DNA e uma sem controle do modelo (NTC) utilizando primers para regiões de ser enriquecido com H3K4me3 de entrada (controle positivo) e regiões de ser enriquecido com H3K4me3 (controle negativo); da mesma forma, para H3K27me3.</li>
		<li>Segui protocolos padrão para executar qPCR12. Brevemente, execute um qPCR usando SYBR verde mistura mestre, 0,5 µ l de concentração de trabalho 10 µM de cada primer frente e verso e 2 µ l de ChIP ou entrada de DNA. Ler placas usando um sistema de PCR em tempo Real. Sequências da primeira demão são fornecidas na tabela 2. As sequências de cartilha de Gapdh de Hwang et al. foram utilizados13.</li>
		<li>Analisar os dados do ChIP em relação a entrada, ou seja, por cento entrada método (% PI)14. Calcule a porcentagem de entrada usando as seguintes fórmulas: Ajustado de entrada = ct média (entrada)-log2(DF) onde DF é o factor de diluição da entrada inicial e DF = volume total de IP / volume de entrada IP % = 100 × 2 ^ (ajustado a entrada - Ct (IP)) onde Ct é o fator de limiar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Schwartzentruber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driver+mutations+in+histone+H3.3+and+chromatin+remodelling+genes+in+paediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.</a> Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).</li>
<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
<li>Bender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+H3K27me3+and+DNA+hypomethylation+are+major+drivers+of+gene+expression+in+K27M+mutant+pediatric+high-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.</a> Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).</li>
<li>Maleszewska, M., Kaminska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+glioblastoma+an+epigenetic+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Is glioblastoma an epigenetic malignancy?</a> Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).</li>
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<li>Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+native+chromatin+immunoprecipitation+to+interrogate+histone+variant+protein+deposition+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediumted+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+separable+roles+for+EZH2+in+neurogenic+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia.</a> Elife. 3, e02439(2014).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo aqui apresentado permitirá que o usuário realizar ChIP nativo no NS derivada de tumores cerebrais geneticamente modificados. Em contraste com o cross-linking do ChIP, este protocolo é limitado para o estudo de proteínas que associam firmemente com DNA6. O número de células utilizado pode ser modificado conforme necessário e o protocolo pode ser ampliado. Nós usamos 1 X 106 células por IP, no entanto, o ChIP nativo também pode ser efectuado com tão pouco quanto 4 x 104</...

Eventos epigenéticos são frequentes em gliomas e provavelmente desempenham um papel importante na patogênese do tumor. Com efeito, em pediátrica glioma de alto grau, mutações em genes que codificam as variantes de histona H3.3 e H3.1 ocorrem com frequência1. As mutações afetam modificações do histone e tem importantes consequências epigenéticas2,3. No adolescente ao espectro de adulto, mutações recorrentes isocitrato desidrogenase gene 1/2 (IDH1/2), uma mutação que inibe a histona dependente de α-KG e DNA de-methylasaes e alterações genéticas em outros reguladores de cromatina como ATRX e DAXX ocorrem 4. portanto, é de fundamental importância para o estudo de como as mutações que afetam epigenéticos reguladores alteram estrutura da cromatina e modificações do histone regulamentar, que, por sua vez, têm um impacto dramático do transcriptoma as células do tumor.
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta usada para avaliar o impacto das modificações epigenéticas no genoma5,6,7. No ChIP nativo, cromatina é digerida com nuclease micrococcal (MNase), immunoprecipitated usando um anticorpo da proteína de interesse, e então DNA é purificado a partir do complexo de cromatina immunoprecipitated6. As células não são fixas durante o procedimento, para que esta técnica só é aplicável para o estudo de proteínas que interagem fortemente com DNA6. A ausência de cross-linking auxilia a especificidade do anticorpo desde que anticorpos são produzidos geralmente contra unfixed peptídeos ou proteínas7. Além disso, desde que não há nenhuma etapa do cross-linking, isso reduz as chances de interações proteína-ADN transientes que são inespecíficos e não regulamentar7,8de fixação. ChIP pode ser usado para identificar o enriquecimento das modificações do histone em uma região específica do genoma. Aqui, detalhamos um protocolo para executar ChIP nativo em neurospheres (NS) gerados a partir de geneticamente projetado modelos de rato de glioma.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalisador</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td>bioanalisador</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R, refrigerado</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 camundongo</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Aldrich</td><td>22350-6</td><td>tampão reagente</td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sal de Potássio</td><td>Goldbio</td><td>LuckK-1g</td><td></td></tr><tr><td>A cremalheira magnética Diamag1.5</td><td>Diagenode</td><td>B04000003</td><td>para lavagens magnéticas do grânulo</td></tr><tr><td>DiaMag Rotator EU</td><td>Diagenode</td><td>B05000001</td><td>rotador</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NSC componente</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>proteína A contas magnéticas</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>proteína G contas magnéticas</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>preparar 20 &mu; g/mL em 0,1% BSA e alíquota.</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>tampão reagente</td></tr><tr><td>etilenoglicol-bis(&beta;-aminoetil éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético) (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>tampão reagente</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td>qPCR reagente</td></tr><tr><td>Fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>para congelamento de células</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>Prepare 20 &mu; g/mL em 0,1% BSA e alíquota.</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>para dissecção de glicerol</td></tr><tr><td>tumoral, MB Grau</td><td>EMD- Millipore</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Millipore</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>solução salina balanceada</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>anestésico inalatório</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>in vivo sistema de imagem óptica</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td><td>meios de descolamento de células</td></tr><tr><td>Reagente tampão</td><td>de cloreto de lítio</td><td>Sigma</td><td>L8895</td></tr><tr><td>Microtubos de baixa ligação Corning</td><td>Costar</td><td>CLS3207</td><td>tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher</td><td>21-402-903</td><td>tubo de microcentrífuga regular</td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Thermo Fisher Scientific, Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>cada lote pode ser diferente; compre quantidade suficiente para experimentos e alíquota.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>NSC componente</td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG</td><td>Millipore</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>agente antimicrobiano, use a 0,1 mg / mL.</td></tr><tr><td>NP-40 (Igepal CA-630)</td> <td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>tampão</td></tr><tr><td>reagente Kimble Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Coquetel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>alíquota e armazenar a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Protinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>faz estoque de 10 mg / mL em água; alíquota e armazenamento a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kit de purificação de DNA</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-16</td><td>para dissecção de tumor Cloreto de</td></tr><tr><td>sódio</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td><td>tampão reagente</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D670-25G</td><td>tampão reagente</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L-4390</td><td>reagente tampão</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Bp152-1</td><td>reagente tampão</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td>éter octilfenílico de polietilenoglicol</td></tr> Mini <tr><td>Centrífuga Padrão</td><td>Fisherbrand</td><td>12-006-901</td><td>mini centrífuga padrão</td></tr><tr><td>Microscópio SZX16</td><td>Microscópio de dissecação fluorescente</td> <td>Olympus</td><td>SZX16</td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real ViiA 7 com biossistemas aplicados em bloco rápido de 96 poços</td><td></td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

imunoprecipitação da cromatina nativa usando neurospheres de tumor de cérebro murino

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Modificações epigenéticas podem estar envolvidas no desenvolvimento e progressão de glioma. Mudanças na metilação e acetilação de promotores e regiões reguladoras de oncogenes e supressores de tumor podem levar a mudanças na expressão gênica e desempenham um importante papel na patogênese de tumores cerebrais. Imunoprecipitação da cromatina nativa (ChIP) é uma técnica popular que permite a detecção de modificações ou outras proteínas rigidamente vinculadas ao DNA. Em contraste com o reticulado ChIP, no ChIP nativo, as células não são tratadas com formaldeído para ligar covalentemente proteínas para DNA. Isto é vantajoso, porque às vezes reticulação pode fixar as proteínas que apenas transitoriamente interagem com o DNA e não têm significado funcional na regulação gênica. Além disso, os anticorpos geralmente são disparados contra péptidos não fixados. Portanto, a especificidade do anticorpo é aumentada em ChIP nativo. No entanto, é importante manter em mente que o ChIP nativo só é aplicável para estudar as histonas ou outras proteínas que se ligam firmemente ao DNA. Este protocolo descreve a imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.

Uma representação esquemática de tumor NS gerados a partir de um tumor cerebral, onde as células do tumor de cérebro são Katushka positiva é apresentada na Figura 1. A Figura 2 é uma representação esquemática da técnica ChIP inteira. A Figura 3 mostra os resultados representativos da cromatina de tumor cerebral NS digerido com MNase para 12 min, rendendo uma maioria de mono, di- e tri-os nucleossomas...

Mecanismos epigenéticos são frequentemente alterados no glioma. Imunoprecipitação da cromatina pode ser usada para estudar as consequências de alterações genéticas no glioma que resultam de mudanças nas modificações do histone que regulam a transcrição de gene e a estrutura da cromatina. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.

Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar o enriquecimento de marcas de histonas em um local genômico específico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como como mutações em reguladores epigenéticos que alteram as modificações de histonas afetam o transcriptoma das células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que as células não são reticuladas, portanto, estão em um estado mais natural, o que pode ajudar na especificidade dos anticorpos.Comece dissecando o tumor induzido experimentalmente do cérebro de um camundongo em uma placa de Petri de 10 centímetros. Se o tumor expressar uma proteína fluorescente, visualize o tumor através de um microscópio de dissecação fluorescente ajustado para o canal fluorescente apropriado com ampliação de 0,3 vezes. Use um bisturi e uma pinça para separar o tecido tumoral do cérebro normal e pique o tumor em pequenos pedaços na placa de Petri.Transfira o tumor dissecado para um tubo de 1,5 mililitro com 300 microlitros de meio NSC e use uma seringa descartável para homogeneizar suavemente o tumor. Em seguida, adicione um mililitro de meio de descolamento celular e incube a amostra por cinco minu

native-chromatin-immunoprecipitation-using-murine-brain-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Fonte: Mendez, F. M. et al., Imunoprecipitação de cromatina nativa usando neuroesferas de tumor cerebral murino. J. Vis. Exp. (2018). Este vídeo demonstra o isolamento de complexos proteína-DNA de células neuroesféricas derivadas de um tumor cerebral de camundongo usando imunoprecipitação de cromatina nativa. Ele detalha as etapas de preparação da cromatina, imunoprecipitação, lavagem e digestão de proteínas para liberar DNA para análise posterior.

Imunoprecipitação da cromatina nativa de células da neuroesfera

Fonte: Núñez, F. J., et al. Avaliação de biomarcadores em glioma por imuno-histoquímica em culturas de neuroesferas de glioma 3D embebidas em parafina. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra uma técnica imuno-histoquímica para rotular biomarcadores tumorais em neuroesferas tumorais cerebrais embebidas em parafina. As seções da neuroesfera são submetidas à remoção e reidratação da parafina, seguida de tratamento para expor os locais dos biomarcadores. Anticorpos primários e secundários são...

Coloração imuno-histoquímica de biomarcadores em seções de neuroesferas de tumores cerebrais

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Aqui descrevemos um protocolo eficiente e versátil para induzir, monitorar e analisar novos glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que absorvem o plasmídeo, transformam-se, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

O desenvolvimento de modelos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos requer precisão meticulosa, usando um dispositivo estereotáxico para implantar células cancerígenas com precisão. A metodologia apresentada aqui descreve as etapas envolvidas na preparação de células tumorais cerebrais, na realização de injeções intracranianas e na implementação de um sistema de monitoramento pós-operatório para avaliar o enxerto de tumor cerebral.

Estabelecimento de modelos ortotópicos de xenoenxerto derivados de pacientes para tumores cerebrais usando um dispositivo estereotáxico

Aprenda a realizar imunoprecipitação de cromatina nativa em neuroesferas de tumor cerebral murino para estudar modificações de histonas e alterações epigenéticas em gliomas. Este método preserva a integridade celular.

Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino

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