Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino

O objetivo geral deste procedimento é identificar o enriquecimento de marcas de histonas em um local genômico específico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como como mutações em reguladores epigenéticos que alteram as modificações de histonas afetam o transcriptoma das células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que as células não são reticuladas, portanto, estão em um estado mais natural, o que pode ajudar na especificidade dos anticorpos.

Comece dissecando o tumor induzido experimentalmente do cérebro de um camundongo em uma placa de Petri de 10 centímetros. Se o tumor expressar uma proteína fluorescente, visualize o tumor através de um microscópio de dissecação fluorescente ajustado para o canal fluorescente apropriado com ampliação de 0,3 vezes. Use um bisturi e uma pinça para separar o tecido tumoral do cérebro normal e pique o tumor em pequenos pedaços na placa de Petri.

Transfira o tumor dissecado para um tubo de 1,5 mililitro com 300 microlitros de meio NSC e use uma seringa descartável para homogeneizar suavemente o tumor. Em seguida, adicione um mililitro de meio de descolamento celular e incube a amostra por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 mícrons para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Em seguida, lave o filtro com 25 mililitros de meio NSC e centrifugue a suspensão a 300 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a decantação do sobrenadante, ressuspender o pellet em seis mililitros de meio NSC e transferir a suspensão de células tumorais para um balão de cultura T25. Cultive as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos com uma atmosfera de 95% de ar e 5% de dióxido de carbono até que as neuroesferas sejam formadas.

Uma vez que as neuroesferas são colhidas, centrifugue uma vez 10 para as seis células da neuroesfera por precipitação de amino a 300 vezes G por cinco minutos. Após centrifugação, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento da neuroesfera em um mililitro de solução salina equilibrada. Transfira a suspensão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas e centrifugue como antes.

Em seguida, decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 95 microlitros de tampão de digestão, suplementado de um a 100 com coquetel de inibidores de protease por uma vez 10 as seis células. Pipete imediatamente as células para cima e para baixo para evitar aglomeração e evitar a criação de bolhas. Em seguida, misture cinco microlitros de nuclease microcócica 0,1X em 145 microlitros de tampão de digestão e adicione cinco microlitros de nuclease microcócica diluída por um vezes 10 às seis células.

Agite o tubo para misturar e coloque o tubo em um bloco de calor de 37 graus Celsius por exatamente 12 minutos. A digestão da nuclease microcócica para fragmentar a cromatina é a etapa mais crítica. A fragmentação adequada da cromatina é importante para obter uma alta resolução para ChIP.

Para garantir que a etapa seja bem-sucedida, incube várias amostras, uma de cada vez, para garantir que não ocorra digestão excessiva. Após 12 minutos, adicione 10 microlitros de tampão de parada de nuclease microcócica 10X por um vezes 10 às seis células. As amostras devem ser mantidas em gelo a partir deste ponto.

A análise do bioanalisador da amostra digerida pela nuclease microcócica demonstra que a maior parte do DNA foi fragmentada em mono, di e trinucleossomos. Em seguida, adicione 110 microlitros de tampão ripa 2X suplementado de um a 100 com coquetel inibidor de protease por um vezes 10 às seis células. Agite o tubo para misturar e centrifugue por 15 minutos a quatro graus Celsius em 1700 vezes G.Transfira o sobrenadante que contém a cromatina para um tubo de microcentrífuga regular de 1,5 mililitro e coloque no gelo.

Use tampão ripa suplementado com inibidores de protease de um a 1000 para diluir a cromatina, de modo que cada IP tenha um volume de 100 a 200 microlitros. Em seguida, remova uma alíquota equivalente a 10% do volume ChIP como a amostra de entrada. Prepare a entrada adicionando 100 microlitros de tampão TE suplementado com proteinase K e incube a 55 graus Celsius por uma hora.

Depois de purificar a entrada com um kit de purificação por PCR, medir a concentração da entrada usando um espectrofotômetro de micro volume. Registre os resultados em um caderno. Adicione 10 microlitros de esferas magnéticas de proteína A e G lavadas por IP que serão realizadas em cada amostra e incube por uma hora a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM.

Coloque a amostra em um suporte magnético e deixe as contas se separarem, depois transfira o volume necessário para novos tubos de 1,5 mililitro. Adicione o anticorpo desejado a cada tubo e, em seguida, envolva as tampas com filme plástico de parafina para evitar a evaporação. Incube as amostras durante a noite a 4 graus Celsius com rotação como antes.

No dia seguinte, gire os tubos a 2000 vezes G por 10 segundos, depois adicione 10 microlitros de grânulos a cada IP e incube por 3 horas a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM. Em seguida, coloque as amostras em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante, adicione 150 microlitros de tampão ripa com inibidores de protease a cada IP e incube a 4 graus Celsius a 20 RPM por cinco minutos.

Após o período de incubação, coloque as amostras em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem. Use uma pipeta para remover o sobrenadante, adicione 150 microlitros de tampão de cloreto de lítio suplementado com inibidores de protease em baixa concentração a cada IP e incube a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM por cinco minutos. Após o período de incubação, coloque as amostras em um suporte magnético e deixe as esferas magnéticas se separarem, depois use uma pipeta para remover o sobrenadante.

Em seguida, adicione 150 microlitros de TE frio sem inibidores de protease aos grânulos e incube a 4 graus Celsius com rotação a 20 RPM por cinco minutos. Após a etapa final de lavagem, ressuspenda a amostra em 100 microlitros de tampão TE suplementado com a concentração final de 0,5 miligramas por mililitro de proteinase K e incube a 55 graus Celsius por uma hora. Finalmente, purifique o DNA amino precipitado usando um kit de purificação por PCR.

Em seguida, para verificar se o IP é bem-sucedido, realize uma qPCR com primers direcionados para regiões de controle positivo e negativo. qPCR foi realizada com DNA de IGG ChIP, DNA de ChIP de histona-3-liceno-4-trimetilado e DNA de ChIP de histona-3-liceno-27-trimetilado, usando primers para gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase. Resultados representativos demonstram que Gapdh, um gene de limpeza, é enriquecido apenas com a modificação H3K4me3 associada à transcrição ativa, e não a modificação H3K27me3 associada à cromatina reprimida.

Após este procedimento, outros métodos como ChIP-C podem ser realizados para identificar alterações nas marcas de histonas, em todo o genoma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar ChIP nativo em neuroesferas para identificar a marca de histonas em locais específicos do gene.