Name: Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda fotoconversão de célula única em peixe-zebra intacto para biologia do desenvolvimento usando proteína Eos. Este método minimamente invasivo permite visualizar migração celular em tempo real.

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Agradecemos a Bernard Kulemaka e membros do laboratório de Smith para seus comentários úteis e orientação de reagente, Sam Connell e Brent Redford de 3i para responder perguntas de imagem e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart para cuidados de zebrafish. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Notre Dame, a Elizabeth e Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigação de Zebrafish na Universidade de Notre e centro de células-tronco e medicina regenerativa da Universidade de Notre Dame. Todos os estudos animais foram feitos em conformidade com a Universidade de Notre Dame IACUC ao Dr. Cody Smith.

Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Notre Dame institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização.
1. preparação da amostra de Zebrafish
<ol><li>Coloque um macho adulto e um adulto feminino Tg (proteína conversível) para a câmara de acasalamento por procedimentos-padrão13. Neste manuscrito, use Tg(sox10:eos) peixe9 por causa do acesso, mas outras linhas transgénicas com proteína de photoconvertible pode ser igualmente utilizado. Configure mais de uma câmara no caso de peixe não fazer lay. Permitir que os peixes que permanecem na câmara durante a noite.</li>
	<li>Na manhã seguinte, colete ovos em caixas de Petri 100 mm. Permitem a ovos amadurecer-se à fertilização de pós 24h (hpf) antes de triagem.</li>
	<li>Se animais acima eram heterozigotos para o transgene, pratos de hpf tela 24 Tg(sox10:eos) + embriões com uma fonte de luz nm 488 e GFP filtram conjuntos em um microscópio de dissecação. Tg(sox10:eos) + embriões de isolar e permitir para amadurecer-se 48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate embriões manualmente com uma agulha ou pinça.</li>
	<li>Preparar e 5 mL de solução de ponto de agarose de baixo ponto de fusão de 0,8% no microondas.<ol>
<li>Uma vez que a agarose é frio ao toque, coloque 3-4 anestesiados Tg (sox10:eos) + 48 peixe hpf no centro de um vidro de 10mm-lamela inferior placa de Petri.</li>
		<li>Adicione suficiente agarose para cobrir a superfície da lamela, cerca de 1 mL. Use uma agulha de sonda para organizar peixe em seus lados. Permitir que a agarose solidificar para garantir a montagem de animais. Pode ser necessário para continuamente re-organizar o zebrafish até o ágar solidifies14. Solidificação leva aproximadamente 2 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois que a agarose solidificou-se por 2 min, adicione lentamente o meio de embrião contendo 0,02% éster de ácido aminobenzoico (tricaina) para prato até a superfície inferior do ágar e prato está submersa. Isto deve ser de aproximadamente 3mL.</li>
</ol>2. microscópio montagem e pre-conversão imagens
<ol><li>Confocal software aberto e selecionar os windows captura e foco [Figura 1]. Sob a janela de captura, selecione a configuração de conversão específicas do laboratório de imagem sob a captura de configuração drop-down guia [Figura 1]. Aqui, a configuração específica do laboratório é chamada de "peixe Imaging".</li>
	<li>Coloque a amostra no escopo confocal e colocar em foco usando o curso e os botões de ajuste fino.</li>
	<li>Abra a janela de foco e localizar a região desejada de interesse (ou seja, o gânglio da raiz dorsal).</li>
	<li>Selecione o laser c488 sob o menu filtro definido. Definir a exposição a 300 ms, poder para 5 laser e intensificar a 75 [Figura 2].</li>
	<li>Marque a caixa 3D na seção tipo de captura . Na seção de captura 3D , selecione usar atual posição e verificar o intervalo ao redor de corrente. Na mesma seção, defina o intervalo de 35 anos, o número de aviões a 36 e o tamanho da etapa 1. O intervalo pode ser aumentado ou diminuído para acomodar para a profundidade da área de imagem. Para a medula espinhal, um valor de intervalo entre 35-40 pilhas normalmente é suficiente [Figura 5].</li>
	<li>Selecione o local atual [Figura 5].</li>
	<li>Clique em Iniciar na parte inferior da janela de captura para adquirir a imagem.</li>
</ol>3. single-cell Photoconversion
<ol><li>Confocal software aberto e selecionar os windows captura e foco [Figura 1]. Sob a janela de captura, selecione a configuração de conversão específicas do laboratório de imagem sob a captura de configuração drop-down guia [Figura 1]. Aqui, a configuração específica do laboratório é chamada de "Peixe ablate chip completo."</li>
	<li>Selecione o laser c488 e c541 sob o menu filtro definido. Se não utilizar o mesmo software de microscópio, encontre o menu para selecionar diferentes lasers e selecione o 488 nm e 541 lasers de nm. Definir os riscos relativos a 300 ms, poder para 5 laser e intensificar a 75 [Figura 2]. Essas configurações do laser são selecionadas com base na produção suficiente sinal fluorescente sem causar fotobranqueamento ou toxicidade. Se toxicidade ou fotobranqueamento é visualizado, reduza a potência do laser ou exposição.</li>
	<li>Abra a janela de foco e clique na guia photomanipulation na janela de foco. Ajuste os parâmetros do laser em conformidade. Mudar a potência da pilha do laser para 2 e clique em ir. Alterar o tamanho de bloco de Raster para 1 e clique em definir. Altere o tamanho de clique duplo para 4. Altere a linha de laser para v405 [Figura 3].</li>
	<li>Abra as configurações de captura avançada na janela de captura. Selecione a guia photomanipulation e alterar as repetições de clique duplo para 2. Clique Okey [Figura 4].</li>
	<li>Selecione a guia XY na janela de foco. Verifique os parâmetros do laser da etapa 2 na guia photomanipulation [Figura 3, Figura 4]. Definir configurações do laser para photoconvert a célula de interesse sem photoconversion das células circundantes.<ol>
<li>Se houver photoconversion de células adjacentes, reduza a potência do laser. Se photoconversion de células não ocorre, poderes do laser podem ser aumentados. Idealmente, conjunto potência do laser para photoconvert apenas a região de interesse e não áreas circunvizinhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Marque a caixa de timelapse sob o tipo de captura. Em seguida, clique em Iniciar [figura 6A].</li>
	<li>Uma vez que abre a janela de timelapse ao vivo, selecione a ferramenta círculo na barra superior [Figura 7]</li>
	<li>Desenhe um círculo na região centermost da célula. O círculo desenhado com o botão direito, selecione a região FRAPe aguarde 3 segundos. A área selecionada deve tornar-se redutor [Figura 8]. Clique em parar captura.</li>
	<li>Se mais de um animal de imagem, volte para o guia XY no foco menu e selecione posição 2. Em seguida, repita etapas 4.1-4.6.</li>
	<li>Para converter uma população de células, segui os parâmetros de protocolo e laser para etapas 4.1-4.4 exceto em vez de um círculo para FRAP a região de interesse, use a ferramenta de linha de desenho. Desenhar uma linha na região de interesse e FRAP região usando os mesmos parâmetros listados acima.</li>
</ol>4. post-photoconversion Imaging
<ol><li>Uma vez que todos os pontos são photoconverted. Selecione a pilha de imagem padrão de laboratório específicas configuração descrita na precoversion de imagem passo 3. Isto é encontrado sob a captura de configuração drop-down guia na janela de captura [Figura 5].</li>
	<li>Selecione o laser c488 e definir a exposição a 300ms, poder para 5 laser e intensificar a 75 [Figura 2].</li>
	<li>Selecione o laser c541 encontrado sob o mesmo menu como o laser c488. Definir a exposição de 500 ms, poder para 10 laser e intensificar a 75 [Figura 9].</li>
	<li>Marque a caixa 3D na seção tipo de captura . Na seção de captura 3D , selecione usar atual posição e verificar o intervalo ao redor de corrente. Na mesma seção, defina o intervalo de 35 anos, o número de aviões a 36 e o tamanho da etapa 1. O número de série pode aumentar ou diminuir para acomodar a desejada profundidade de imagem [Figura 5].</li>
	<li>Se houver vários pontos no guia de foco XY, selecione a opção lista multiponto na janela de captura. Se não, selecione o local atual.</li>
	<li>Clique em Iniciar na parte inferior da janela de captura para adquirir a imagem.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
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<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
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<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
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<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Em tecidos complexos, distintos tipos de células organizam em domínios específicos. Recentemente, as técnicas têm sido utilizadas para células individuais de etiqueta dentro destes tecidos grandes estruturas1,2,3. Aqui vamos demonstrar duas técnicas que podem ser utilizadas da mesma forma para visualizar tanto interações célula única e interações de população celular dentro de tecidos complexos. A vantagem da técnica photoconver...

Várias células distintas interagem para construir e manter o complexos tecidos animais e vegetais. Estas células são frequentemente intercalados e difícil de distinguir de vizinhos em um nível de célula única sem microscopia de alta resolução que exigem a fixação do tecido. No entanto, para compreender a forma como estes tecidos, são mantidas e tornar-se doente, tem sido essencial para investigar como single as células dentro do tecido estão interagindo ao longo do tempo. Idealmente, estas experiências exigem a rotulagem de células únicas dentro de um tecido de forma não-invasiva, sem a exigência de fixação. Os cientistas agora desenvolveram inúmeras técnicas para realizar esta tarefa1,2,3,4.
A descoberta e a implementação da proteína medusas verde fluorescente (GFP) foi uma abordagem interessante que permitiu para a rotulagem de células distintas em um ambiente de tecido1. Usando promotores de célula específica, é possível geneticamente, selecionar um subconjunto de células que são rotulados1. Alternativamente, viral induzida expressão de GFP pode ser utilizada para usuário-selecionado expressão de GFP3,4. Embora bastante útil, expressão mediada genética de GFP não permite expressão selecionado pelo usuário dentro de um subconjunto de células no tecido; e a expressão viral de GFP, apesar de vantajoso, pode ser invasiva. Com o advento de técnicas inteligentes como Brainbow expressar proteínas fluorescentes distintas mais escassa dentro de tecidos e derivados GFP, tornou-se possível visualizar células únicas e as interações entre eles em tecido complexo2, 5. no entanto, essas abordagens rotular as células de uma forma aleatória. Se o experimento desejado requer a visualização de uma única célula ou a população de células é definido pelo experimentador, são, portanto, limitados. Com tais experiências, seria vantajoso ter uma proteína fluorescente geneticamente expressa que pode ser manipulada para distinguir, de forma única célula, que de outras células não-fluorescente fluorescentes.
Para atingir esse objetivo e visualizar a biologia celular de células únicas dentro de um tecido vivo complexo, a comunidade científica usa única célula photoconversion de proteínas fluorescentes distintas6,7,8. Usando geneticamente controlado a expressão de uma proteína de photoconvertible (i.e., eos, kaede, etc.) que transita de um verde para vermelho estado fluorescente quando exposto aos raios UV (488 nm) a luz, podemos distinguir uma única célula de sua fluorescente etiquetadas vizinhos de7,6,8. Esta abordagem utiliza um aparelho ligado ao nosso microscópio confocal que pode direcionar a luz de uma pilha de laser para uma região de difração limitada de interesse. Com esta técnica, podemos rotular ou células únicas ou maiores populações em uma maneira definida pelo usuário9,10,11. A técnica é minimamente invasiva em comparação com injeções de célula única de GFP viral. Como uma prova de conceito, mostramos que podemos photoconvert células únicas dentro de um gânglio no sistema nervoso periférico e as maiores populações de photoconvert como células localizadas no lado ventral da medula espinhal9,10, 11,12. Podemos então Visualizar estas photoconverted populações de células 24h mais tarde para ganhar a introspecção em seu movimento e diferenciação durante o desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) animais peixe-zebra</td><td></td><td></td><td>Os peixes foram obtidos e cruzados a partir da instalação de peixes da Universidade de Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> <td>embrionárioO meio embrionário é feito semanalmente e fornecido pela instalação de peixes da Universidade de Notre Dame contendo 5L de água RO, 30uL de azul de metileno e 200mL de sal.</td></tr><tr><td>0,8% Baixo Ponto de Fusão Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm placa de Petri com fundo de lamínula</td><td>de vidro Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr>Sonda <td></td><td></td><td></td><td>de dissecação de agulha</td></tr><tr><td>0,002% éster de ácido 3-aminobenzóico (tricaína)</td>Microscópio de dissecação <td>fluorescente Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>com filtros GFP</td> Microscópio confocal <td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com lasers para excitar conjuntos de filtros GFP e RFP</td><td>3i disco giratório confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz UV (laser) para fotoconversão</td><td>405 nm laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photoconversion de célula única no zebrafish intacta vida

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Tecidos animais e vegetais é composto de populações distintas de células. Estas células interagem ao longo do tempo para construir e manter o tecido e podem causar doenças quando interrompido. Os cientistas desenvolveram técnicas inteligentes para investigar características e dinâmica natural dessas células no tecido intacto por expressar proteínas fluorescentes em subconjuntos de células. No entanto, às vezes, experiências exigem mais selecionada visualização de células dentro do tecido, às vezes a forma unicelular ou população de células. Para alcançar este objectivo e Visualizar células únicas dentro de uma população de células, os cientistas têm utilizado a célula única photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demonstrar essa técnica, mostramos aqui como direcionar a luz UV para uma célula Eos-expressando um interesse de uma intacta, vivendo zebrafish. Nós então imagem essas células de Eos+ photoconverted 24h depois para determinar como eles mudaram no tecido. Descrevemos duas técnicas: única célula photoconversion e photoconversions das populações de células. Estas técnicas podem ser usadas para visualizar interações célula-célula, célula-destino e diferenciação e migrações de célula, tornando-se uma técnica que é aplicável em numerosas questões biológicas.

Photoconversion de proteínas fluorescentes pode ser usado para rotular células distintas dentro de um tecido de6. Para demonstrar isso, Tg(sox10:eos) peixe9 foram usados para expressar a proteína photoconvertible Eos sob as sequências reguladoras de sox10. Os animais Tg(sox10:eos) em 48 hpf foram montados primeiro e então fotografada para detectar qualquer photoconversion não-específicos que possam ter ocorrido. O ...

Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

O objetivo geral desta técnica de fotoconversão é distinguir células únicas em um único animal de outras populações de células fluorescentes. Esse método pode ajudar a responder às principais questões de desenvolvimento no campo e nos permitir visualizar a migração de uma única célula ao longo do tempo. A principal vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva e pode ser usada para rotular células únicas ou populações maiores.Além disso, o usuário pode selecionar a região específica de interesse e converter a foto do alvo desejado. Depois de acasalar o peixe-zebra transgênico macho e fêmea expressando uma proteína fotoconversível e coletando os ovos de acordo com o protocolo de texto, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz de 488 nanômetros e conjuntos de filtros GFP para rastrear 24 embriões hpf. Usando uma agulha ou pinça, descorione manualmente os embriões.Prepare no microondas, cinco mililitros de solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8%. Uma vez que a agarose é resfriada ao toque, coloque três a quatro peixes transgênicos sox10 eos positivos 48 hpf anestesiados no centro de uma placa de Petri com fundo de lamínula de vidro de dez milímetros. Adicione aproximadamente um milímetro ou agarose suficiente para cobrir a superfície da lamínula.Em seguida, use uma agulha de sonda para arrumar os peixes de lado, ajustando-os conforme necessário, enquanto a agarose se solidifica, o que levará cerca de dois minutos. Depois que a agarose solidificar por dois minutos, adicione lentamente o meio embrionário contendo 0,02% de ácido aminobenzóico éster tricaína ao prato, até que a superfície inferior do ágar e do prato esteja submersa. Para realizar a microscopia confocal, abra o software confocal e selecione as janelas de captura e foco.Para realizar a geração de imagens de pré-conversão, na janela de captura e na guia suspensa de configuração de captura, selecione os parâmetros de imagem. Aqui estão as configurações de pilha específicas do laboratório chamadas de imagens de peixes. Coloque a amostra no microscópio confocal e use os botões de ajuste grosso e fino para colocá-la em foco.Em seguida, abra a janela de foco e localize a região de interesse desejada, como o gânglio da raiz dorsal. No menu do conjunto de filtros, selecione o laser c488, defina a exposição para 300 milissegundos, a potência do laser para cinco e a intensificação para 75. Em seguida, na seção de tipo de captura, marque a caixa 3D.Na seção Captura 3D, selecione usar posição atual e marque o intervalo em torno da corrente. Na mesma seção, defina o intervalo como 35, o número de planos como 36 e o tamanho do passo como um. Selecione o local atual e clique em iniciar na parte inferior da janela de captura para adquirir uma imagem.Antes do processo de fotoconversão, certifique-se de verificar duas e três vezes os parâmetros do laser. Às vezes, é necessário reajustar as configurações de conversão, quando a janela de conversão está aberta. Na janela de captura, na guia suspensa de configuração da janela de captura, selecione a configuração de imagem de conversão específica do laboratório.Aqui, a configuração específica do laboratório é chamada de peixe ablação de chip completo. No menu de filtros, selecione os lasers c488 e c541. Defina as exposições para 300 milissegundos, a potência do laser para cinco e a intensificação para 75, o que produzirá sinal fluorescente suficiente sem causar fotobranqueamento ou toxicidade.Na janela de foco, clique na guia de fotomanipulação e altere a potência da pilha de laser para dois e clique em ir. Altere o tamanho do bloco raster para um e clique em definir. Em seguida, altere o tamanho do clique duplo para quatro e a linha do laser para v405.Em seguida, na janela de captura, abra as configurações avançadas de captura. Selecione a guia de fotomanipulação e altere as repetições de clique duplo para duas e clique em OK. Selecione a guia xy na janela de foco.Na guia de fotomanipulação, verifique novamente os parâmetros do laser. Em seguida, defina as configurações do laser para fotoconverter a célula de interesse, sem fotoconversão das células circundantes. Em Tipo de captura, marque a caixa de lapso de tempo e clique em Iniciar.Quando a janela de lapso de tempo ao vivo for aberta, selecione a ferramenta de círculo na barra de ferramentas superior. Desenhe um círculo na região mais central da célula, clique com o botão direito do mouse no círculo desenhado, selecione Região FRAP e aguarde três segundos. A área selecionada deve ficar mais escura quando clicar em parar captura.Se estiver criando mais de um animal, volte para a guia xy no menu de foco e selecione a posição dois. Em seguida, repita a fotoconversão. Para converter uma população de células, siga o protocolo e os perametros a laser abrindo a janela de lapso de tempo.Agora, em vez de desenhar um círculo para FRAP a região de interesse, use a ferramenta de linha para desenhar uma linha na região de interesse. Em seguida, faça o FRAP da região usando os mesmos parâmetros que acabamos de demonstrar. Depois que todos os pontos forem fotoconvertidos, na guia suspensa de configuração de captura na janela de captura, selecione a configuração de pilha padrão específica do laboratório descrita anteriormente neste vídeo.Selecione o laser c488 e defina a exposição para 300 milissegundos, a potência do laser para cinco e a intensificação para 75. Selecione o laser c541 e defina a exposição para 500 milissegundos, a potência do laser para dez e a intensificação para 75. Na seção de tipo de captura, marque a caixa 3D.Na seção Captura 3D, selecione usar posição atual e marque o intervalo em torno da corrente. Na mesma seção, defina o intervalo como 35, o número de planos como 36 e o tamanho da etapa como um. O número do intervalo pode aumentar ou diminuir, para acomodar a profundidade de imagem desejada.Se houver pontos de multiplicação na guia de foco xy, na janela de captura, selecione a opção de lista de vários pontos. Caso contrário, selecione o local atual. Por fim, na parte inferior da janela de captura, clique em iniciar para adquirir uma imagem.Esses painéis mostram uma única célula de pré-conversão foto, dentro de um gânglio de um peixe-zebra transgênico, expressando a proteína eos fotoconversível, sob controle da sequência regulatória sox10. Após a fotoconversão, o eos estava distintamente presente na região de interesse, enquanto nenhuma célula vizinha foi marcada. Para demonstrar a utilidade dessa técnica de fotoconversão, uma população de células no lado ventral da medula espinhal foi exposta à luz ultravioleta, usando uma linha.Em seguida, foram tiradas imagens mostrando a proteína eos fotoconvertida na região da linhagem. A proteína eos não fotoconvertida foi visível em todas as outras áreas. Várias horas após a fotoconversão, foram tiradas imagens idênticas que mostraram células eos positivas fotoconvertidas espalhadas por toda a região da medula espinhal, tanto na região dorsal quanto na ventral.Esse achado é consistente com a hipótese de que as células espinhais ventrais se mudaram para locais dorsais. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 a 45 minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tirar uma imagem pós-conversão, para confirmar se sua região de interesse experimentou a fotoconversão.Após este procedimento, outros métodos como a imagem em timelapse podem ser realizados para observar a migração e a dinâmica celular ao longo do tempo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como distinguir células individuais dentro de uma população de células fluorescentes. Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso e os cuidados necessários devem sempre ser tomados ao realizar este procedimento.Por exemplo, nunca olhe diretamente para a luz.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Aqui, apresentamos um método para a comutação fotoativada de proteínas fluorescentes fotoconvertíveis (PCFPs) em embriões vivos de peixe-zebra e o rastreamento posterior da proteína fotoconvertida em pontos temporais específicos durante o desenvolvimento. Esta metodologia permite o monitoramento de eventos de biologia celular subjacentes a diferentes processos de desenvolvimento em um organismo vertebrado vivo.

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Este vídeo demonstra o rastreamento do recrutamento de leucócitos usando larvas de peixe-zebra transgênicas que expressam proteína fluorescente verde fotoconversível. A pré-injeção de bactérias marcadas com corante fluorescente vermelho na vesícula ótica e a indução da fotoconversão permitem a observação da migração, fagocitose e dispersão dos leucócitos por todo o corpo, fornecendo informações valiosas sobre a dinâmica da resposta imune.

Rastreamento de leucócitos baseado em fotoconversão em peixe-zebra transgênico infectado por bactérias

Estudar os primeiros eventos de progressão de células pré-neoplásicas e interação célula imune inato é fundamental para compreender e tratar o câncer. Aqui nós descrevemos um método para induzir condicionalmente transformações de células epiteliais e do subsequente imagens ao vivo de interação célula imune inato com HRAS G12V expressando células da pele em larvas do peixe.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Estabelecemos o sistema PSmOrange fotoconversível como uma ferramenta poderosa, direta e barata para rastreamento de células in vivo em fundos transgênicos GFP. Este protocolo descreve sua aplicação no sistema modelo de peixe-zebra.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Aprenda fotoconversão de célula única em peixe-zebra intacto para biologia do desenvolvimento usando proteína Eos. Este método minimamente invasivo permite visualizar migração celular em tempo real.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

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