Name: In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a medir a permeabilidade epitelial intestinal in vitro e in vivo usando células Caco-2bbe e camundongos. Este método auxilia no estudo de doenças inflamatórias intestinais e toxicidade de fármacos.

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Agradecemos o Dr. Jerrold R. Turner, do Hospital Brigham e feminino, Harvard Medical School, por sua generosa ajuda na conclusão deste estudo. Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 81470804, 31401229 e 81200620), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (número de concessão BK20180838 e BK20140319), o programa de inovação de pesquisa para Graduados faculdade da província de Jiangsu (número de concessão KYLX16-0116), avançada pesquisa projetos de Soochow University (número de concessão SDY2015_06) e Crohn e colite Foundation Research Fellowship Award (conceder número 310801).

Este estudo foi aprovado pelo cuidado Animal e usar protocolo de Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Universidade de Soochow.
1. chapeamento e manutenção de Caco-2bbe na membrana porosa de policarbonato
<ol><li>Desenvolvem-se células em balão T75 mídia (DMEM contendo 10% FBS). Frascos devem ser alimentados regularmente, dependendo da densidade da célula. Nota: Para o chapeamento ideal, células devem dividir rapidamente e têm uma forma plana "frito-ovo", que indica que as células estão em fase de crescimento.</li>
	<li>Uma vez que as células são 80% de confluencia, pegue o frasco fora da incubadora e remova a mídia. Enxague qualquer mídia residual com 1 a 2 mL de PBS estéril (sem o Ca2 +). Pipetar 1,5 mL do Trypsin-EDTA para o balão e suavemente agitar o frasco; em seguida, coloque o frasco na incubadora 37 ° C por 20 min sem balanço.</li>
	<li>Enquanto as células são trypsinizing, lugar insere contendo membranas porosas policarbonato (tamanho do pore, 0,4 µm; área de superfície, 0,33 cm2; ver Tabela de materiais) em placas de 24 poços. Adicione 1,0 mL de meio de cultura na câmara basal (o espaço inferior da membrana).</li>
	<li>Pipetar 5 mL de mídia para o balão e vigorosamente Pipetar as células contra o lado do balão de 5 - 10 vezes atingir células individuais, soltas ou 2-3 célula agrupa.</li>
	<li>
Placa de 0,166 mL de células (alcançar uma diluição de 1:8) na câmara apical (o espaço superior da membrana). Incube a 37 ° C por até 3 semanas.
	<ol>
<li>Alimente as células três vezes semanalmente aspirando cuidadosamente a mídia do compartimento basal de cada poço usando uma bomba de pressão. Delicadamente, gotejamento 1ml de mídia na câmara apical de cada inserção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. uso de medidor epitelial (volts/ohms) para medir a TER
Nota: Após cerca de 3 semanas de cultura nas membranas de policarbonato, células Caco-2BBe estão prontas para TER medição.
<ol><li>Para estudos de citocina, um dia antes da medição, substitua a mídia basal com mídia contendo 10 ng/mL de relato. No dia do experimento, substitua a mídia com HBSS contendo 2,5 ou 7,5 ng/mL de TNF. Nota: Tratamento de relato aumenta a expressão de receptores TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Para corrigir o medidor, insira o eléctrodo de correção na porta de entrada e escolher o modo "Ohm". Ajuste o parafuso Adj R com uma chave de fenda até que o medidor mostra uma leitura de 1.000 Ω.</li>
	<li>Esterilizar os eléctrodos, colocando-os em etanol a 70% por 15-30 min e depois deixe-os secar ao ar para 15 s. Enxágue o eléctrodo em meios de cultura a célula experimental.</li>
	<li>Ligue a alimentação e escolher o modo "Ohm". Coloque cuidadosamente as extremidades longas das pontes eletrodo na câmara de basal e as extremidades curtas na câmara apical. Certifique-se de que os eléctrodos mais tocarem no fundo do prato, mantendo-se os eléctrodos menores abaixo da superfície da mídia mas acima as inserções de cultura de tecidos. Manter os eletrodos verticais.</li>
	<li>Medir a resistência da amostra inserções e inserções em branco (ou seja, a cultura insere sem células mas com HBSS) em 0, 1, 2, 3, 4 h após o tratamento de citocina. Registro da resistência.</li>
	<li>Para obter consistência em formatos diferentes de placa, calcule o produto da resistência e da área de membrana eficaz: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Para inserções de 24-bem, a área de membrana eficaz é 0,33 cm2.</li>
</ol>3. modelo murino de dextrano sulfato de sódio (DSS)-induzida colite
<ol><li>Adicione DSS para água esterilizada para uma concentração final de 3,5% (wt/vol).</li>
	<li>Administrar 3,5% DSS para camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas para um total de 7 dias. Dar água potável normal sem DSS aos ratos controle.<ol>
<li>Mude a água contendo DSS para regular de água potável após dia 7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesar de ratos e avaliar resultados clínicos de cada mouse todos os dias. Normalize o peso corporal de cada rato para seu peso corporal inicial. Pontuações são definidas de acordo com a severidade da doença por quatro parâmetros: prolapso retal (0-2), consistência de fezes (0-2), hemorragia (0-2) e atividade (0-2)5. Soma as pontuações desses parâmetros para um escore clínico final.</li>
	<li>Para analisar a condição histopatológica do tecido do cólon, eutanásia em ratos pela injeção intraperitoneal (i.p.), com 1,2% (vol/vol) tratamento do Avertin (0,6 mL/10 g de massa corporal) 7 dias post-DSS. Para preparar um estoque de 100% avertin, misture 10 g de 2, 2,2-tribromoetanol com 10 ml de álcool terc-Amil.  Armazenar no escuro a 4° C. Para usar, dilua o estoque de 100% para 2% em água.</li>
	<li>Isolar o cólon e o ceco e meça o comprimento do cólon5.</li>
	<li>Corte segmentos de 0,5 cm do cólon distal e correção em um tubo falcon de 15 mL contendo 10 mL de formol a 10% durante a noite. Lavar os tecidos fixos com classificados etanol (75, 95 e 100%) e xileno. Incorporar os tecidos em parafina e cortar seções de 6 mm para a hematoxilina &amp; eosina coloração8.</li>
</ol>4. medir a permeabilidade de barreira epitelial em camundongos colite induzida por DSS
<ol><li>Medir a permeabilidade de barreira 7 dias após o início da administração de DSS.</li>
	<li>No dia do ensaio, rápido ratos para 3h.</li>
	<li>Autoclave a gavagem agulha para garantir a esterilidade, então gavage ratos com 150 µ l 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran em água estéril e manter o FITC-dextran não utilizado para medir a curva padrão após a coleta de soro. Pese os ratos para o cálculo da permeabilidade. Nota: A solução de dextran-FITC deve ser feita em água.</li>
	<li>Usando um par de tesouras, cortar um pedaço de 1 cm da cauda e coletar 100 µ l de sangue da cauda em tubos de colheita de soro. Gire o sangue coletado a 10.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Dilua o soro 1:4 em água. Tornar-se um padrão curva, diluir FITC-dextran não utilizada com água a 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 e 1:3, 000, 000. Adicione 100 µ l/poço de soro e as amostras de curva padrão em placas de 96 poços.</li>
	<li>Lê a fluorescência em um leitor de placas com emissão de excitação/528 485. Calcular os valores de permeabilidade com base na curva padrão e multiplicar por 4 para corrigir a diluição.</li>
	<li>Divida a concentração de FITC-dextrano pelo peso para normalizar os valores (isso ajuda a normalizar a diferença na entrega FITC-dextran se ratos estão doentes e tem perdido peso).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Existem vários passos críticos no protocolo. Células caco-2BBe (fronteira de escova-expressando) sempre são utilizadas para medição de TER, seleccionada a partir da linhagem de células Caco-2 para expressão de proteínas de escova-fronteira. Caco-2BBe células têm um fenótipo de absorção das vilosidades quando totalmente diferenciadas (após cerca de 3 semanas de pós-confluência cultura)17. É necessário para evitar a contaminação durante a medição e para esterilizar o eletrodo. Porque o procedimento ...

Células epiteliais intestinais não são apenas responsáveis pela absorção de nutrientes, mas também formam uma barreira importante para a defesa contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Esta função de barreira intestinal é regulada pela junção apertada permeabilidade e células epiteliais integridade1,2,3, e disfunção da função de barreira epitelial está associada com inflamação intestinal doença (IBD). O anel de actomyosin de perijunctional (PAMR) encontra-se dentro da célula que é estreitamente contígua às junções apertadas. A contração da PAMR, que é regulada pela cadeia leve da miosina (MLC), é crucial para a regulação da junção apertada permeabilidade4,5,6,7,8, 9,10. Fator de necrose tumoral (TNF) é fundamental para a perda da barreira intestinal por estrogenos intestinal epitelial MLC quinase (houve) expressão e induzir a interiorização occludin11,12,13.
Íons como Cl– e at+ pode cruzar o espaço de paracellular pelos poros ou vazamento via14. Em um "vazamento" epitélio, alterações em TER principalmente refletem permeabilidade alterada junção apertada. Medição de TER é uma abordagem eletrofisiológica comumente usada para quantificar a permeabilidade de junção apertada, principalmente para at+ e Cl-, baseada-se a impedância de monocamadas de células. Tipos de diversas células, incluindo células epiteliais intestinais, células epiteliais pulmonares e vascular em células endoteliais, foram relatados para TER medições. As vantagens desse método são que TER medições são não-invasivo e podem ser usadas para monitorar as células vivas em tempo real. Além disso, a técnica de medição de TER é útil para de estudos de toxicidade de drogas15.
Caco-2BBe são células de adenocarcinoma colorretal epitelial humana com uma estrutura e função semelhante a pequenas células epiteliais intestinais diferenciadas: por exemplo, estas células têm microvilli e enzimas associadas com pequena escova intestinal fronteira. Portanto, monocamadas de Caco-2BBe cultivadas são utilizadas como um modelo in vitro para testar a função de barreira.
Em camundongos, uma forma de estudar a permeabilidade intestinal paracellular é medindo-se a capacidade do FITC-dextran cruzar do lúmen para o sangue. Assim, a permeabilidade intestinal pode ser avaliada por gavaging FITC-dextrano diretamente em ratos e medir a fluorescência dentro o sangue. O seguinte protocolo descreve dois métodos simples para avaliar a permeabilidade do epitélio intestinal tanto in vitro e in vivo.

<table><tbody><tr><td>Agulha de gavagem de 22 G</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Placas pretas de 96 poços para fluorescência</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57 / B6 camundongos</td><td>Nanjing Biomedical Research Institute da Universidade</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Células Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano de sódio</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED com alto teor de glicose e piruvato de sódio</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Medidor Epitelial (Volt/Ohm)</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm ChemicalReagent</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM de glicose&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Centro de Incorporação de Tecidos Modulares</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de coleta de soro</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>Frasco T75</td><td>corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pressão</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Microtomia rotativa</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sinopharm ChemicalReagent</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial intestinal

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

A barreira intestinal defende contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Sua função é regulada pela célula epitelial integridade e permeabilidade da junção apertada, e perturbações da função de barreira intestinal contribuem para a progressão da doença sistêmica e gastrointestinal. Dois métodos simples são descritos aqui para medir a permeabilidade do epitélio intestinal. In vitro, células Caco-2BBe são banhadas em poços de cultura de tecidos como uma monocamada e resistência elétrica transepitelial (TER) pode ser medida por um medidor de epiteliais (volts/ohms). Este método é convincente devido à sua operação user-friendly e repetibilidade. Os ratos in vivo são gavaged com 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano e as concentrações de FITC-dextrano são medidos em amostras de soro coletadas de ratos para determinar a permeabilidade epitelial. Gavagem oral fornece uma dose exata e, portanto, é o método preferido para medir a permeabilidade intestinal na vivo. Tomados em conjunto, estes dois métodos podem medir a permeabilidade do epitélio intestinal em vitro e em vivoe, portanto, ser usados para estudar a conexão entre as doenças e a função de barreira.

Na cultura, células Caco-2BBe crescem como uma monocamada em lentamente se diferenciar em enterócitos absorção maduros que têm fronteiras de escova. Neste protocolo, células Caco-2BBe foram revestidas com uma alta densidade nas membranas de policarbonato, e células alcançou a confluência de 100% um dia após a semeadura. No entanto, as células são indiferenciadas nesta fase: para diferenciar totalmente as células, a mídia é alterada a cada 2-3 dias por 3 semanas. As células foram coradas c...

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

O objetivo geral deste experimento é estudar as doenças causadas pela disfunção da barreira epitelial medindo a permeabilidade das células epiteliais intestinais in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de função da barreira intestinal, como as relacionadas à doença inflamatória intestinal. A principal vantagem dessa técnica é que a permeabilidade das células epiteliais intestinais pode ser avaliada tanto in vitro quanto in vivo.As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de doenças gastrointestinais, pois a disfunção da barreira epitelial intestinal contribui para essas doenças. Embora este método possa fornecer uma visão da função da barreira intestinal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como estudos de toxicidade de drogas e integridade de barreiras de outros tipos de células. A demonstração visual deste método é crítica, pois alguns passos são difíceis de aprender.Uma operação precisa deste método pode agora ser entendida pela descrição textual. Para começar, cresça células Caco-2bbe em um frasco T75 com meio. Alimente os frascos regularmente, dependendo da densidade celular.Quando as células estiverem 80% confluentes, remova o meio e use 1-2 mililitros de PBS estéril sem cálcio para enxágüe. Adicione 1,5 mililitros de Trypsin-EDTA, e balance suavemente o frasco. Em seguida, coloque-o na incubadora Celsius de 37 graus por 20 minutos, sem balançar.Enquanto as células estão experimentando, coloque inserções contendo membranas porosas de policarbonato em 24 placas de poço. Em seguida, adicione 1 mililitro de cultura média na câmara basal que é o espaço inferior da membrana. Adicione 5 mililitros de médio ao frasco, e pipete vigorosamente as células contra o interior do frasco de 5 a 10 vezes, para separar a cultura em células individuais soltas, ou duas a três células.Placa 0,166 mililitros das células na câmara apical que é o espaço superior da membrana. Em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius por até três semanas. Alimente as células três vezes por semana, usando uma bomba de pressão para aspirar cuidadosamente o meio do compartimento basal de cada poço.Em seguida, gotejar suavemente um mililitro de meio na câmara apical de cada inserção. Para estudos de citocina, um dia antes da resistência elétrica transepitelial ou medidas ter, substitua o meio basal por médio, contendo 10 nanogramas por mililitro de interferon gama. No dia do experimento, substitua o meio por HBSS contendo 2,5 ou 7,5 nanogramas por mililitro de TNF.Para corrigir o medidor, insira o eletrodo de correção na porta de entrada e escolha o modo Ohm. Em seguida, use uma chave de fenda para ajustar o parafuso de ajuste R até que o medidor exiba uma leitura de 1.000 ohms. Esterilize os eletrodos em 70% de etanol por 15 a 30 minutos e deixe-os secar por 15 segundos.Em seguida, enxágue os eletrodos em meio de cultura celular experimental. Em seguida, ligue a potência e escolha o modo Ohm. Mantendo os eletrodos verticais, coloque cuidadosamente as longas extremidades das pontes de eletrodos na câmara basal, garantindo que toquem o prato.Em seguida, coloque as extremidades curtas na câmara apical, garantindo que fiquem abaixo da superfície do meio, mas acima das inserções da cultura tecidual. Meça a resistência da amostra e as pastilhas em branco em 0, 1, 2, 3 e 4 horas após o tratamento da citocina. Então regissão a resistência.Para obter consistência em diferentes formatos de placa, calcule o produto da resistência e a área de membrana eficaz, como mostrado aqui. Para 24 inserções de poços, a área de membrana eficaz é de 0,33 centímetros quadrados. Para induzir colite, adicione DSS à água autoclavada a uma concentração final de 3,5% de peso por volume.Em seguida, use a solução DSS para substituir a água potável nas gaiolas de 8 semanas de idade c57 preto seis ratos por um total de sete dias. Dê água potável regular sem DSS para controlar ratos. Após o sétimo dia, troque a água do DSS para água potável regular.Todos os dias, pese os camundongos e avalie os escores clínicos definidos de acordo com a gravidade da doença por quatro parâmetros: prolapso retal, consistência das fezes, sangramento e atividade. Soma os escores desses parâmetros para um escore clínico final. Para analisar a condição histopatológica dos tecidos de cólon sete dias após o tratamento de DSS, após eutanásia de camundongos de acordo com o protocolo de texto, isolar o cólon e ceco, e medir o comprimento do cólon.Corte segmentos de 0,5 centímetros do cólon distal e fixe o tecido em um tubo falcão de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 10% de formalina durante a noite. Lave os tecidos fixos com etanol e xileno. Em seguida, incorpore os tecidos em parafina e corte seções de seis milímetros para a hematoxilina e a coloração de eosina.Para medir a permeabilidade da barreira epitelial em camundongos induzidos pelo DSS, sete dias após o início da administração do DSS, acelere os camundongos por três horas. Autoclave uma agulha de gavage para garantir a esterilidade, em seguida, use 150 microliters de 80 mililitros por mililitro quatro kilodalton FITC dextran em água estéril para gavage os ratos, e manter o dextran FITC não utilizado para medir a curva padrão após a coleta de soro. Em seguida, peso os ratos para o cálculo de permeabilidade.Quatro horas depois, após anestesiar os camundongos por injeção ip, confirme a anestesia adequada pela falta de reflexos e movimento do bigode. Em seguida, coloque os ratos em um bloco de calor por cinco minutos. Usando uma tesoura, corte um pedaço de um centímetro da cauda e colete 100 microliters de sangue da cauda em um tubo de coleta de soro.Gire o sangue coletado a 10.000 vezes g e temperatura ambiente por dez minutos. Com água, dilui o soro de um a quatro. Em seguida, para fazer uma curva padrão, use água para preparar as diluições do dextran FITC não utilizado.Adicione 100 microliters por poço do soro e as amostras de curva padrão em 96 placas de poço. Usando um leitor de placas, leia a fluorescência em uma excitação de 485 e uma emissão de 528. Calcule os valores de permeabilidade com base na curva padrão e multiplique por quatro para corrigir a diluição.Divida a concentração do FITC dextran pelo peso para normalizar os valores. Isso ajuda a normalizar a diferença na entrega do FITC dextran se os ratos estiverem doentes e tiverem perdido peso. As células Caco-2bbe mostradas aqui foram rotuladas com núcleos e manchas de f-actin para mostrar a diferença entre células indiferenciadas e diferenciadas.Fibras de estresse são claramente vistas em células indiferenciadas. Células diferenciadas têm um volume menor, núcleos maiores e menos fibras de estresse do que células indiferenciadas. A TNF é central para a perda de barreira intestinal através da regulação de junção apertada dependente de MLCK.Como visto neste número, o TNF diminui significativamente o TER da monocamada Caco-2bbe de forma dependente de dose, sugerindo que o TNF aumenta a permeabilidade epitelial. Em comparação com seu peso corporal inicial, os camundongos tratados com DSS perdem uma quantidade significativa de peso. A gravidade da colite é pontuada por prolapso retal, consistência das fezes, sangramento e atividade.Seções transversais de tecidos coloniais manchados com hematoxilina e eosina mostram danos mucosas colonicos em camundongos tratados com DSS. Além disso, o comprimento da cripta de cólon, bem como o próprio cólon, é diminuído em camundongos tratados com DSS. Finalmente, há um aumento de aproximadamente duas vezes nos níveis de coloração do FITC dextran em camundongos tratados com DSS, em comparação com ratos de controle.Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar para minimizar erros, padronizando procedimentos operacionais e utilizando métodos estatísticos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da função de barreira intestinal explorar doenças gastrointestinais tanto em organismos modelo quanto em linhas celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a permeabilidade epitelial intestinal medindo o TER, gavaging FITC dextran, e observando alterações morfológicas e histoquímicas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Os tratamentos actuais de doenças inflamatórias do intestino (IBD) destinam-se a atenuar os sintomas da doença, mas pode causar efeitos laterais graves. Assim, estratégias alternativas estão a ser investigados em modelos de colite em animais. Aqui, vamos explicar como os efeitos benéficos da dieta suplementos em sinais clínicos IBD são analisados ​​de tal modelo de colite.

Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

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O acesso de nutrientes, metabólitos da microbiota e medicamentos para a circulação é controlado pela barreira sangue-intestino (GBB). Nós descrevemos um método direto para medir a GBB permeabilidade na vivo, que, em contraste com comumente usados métodos indirectos, praticamente não é afetado pelas funções de fígado e rim.

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Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

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Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

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Aprenda a medir a permeabilidade epitelial intestinal in vitro e in vivo usando células Caco-2bbe e camundongos. Este método auxilia no estudo de doenças inflamatórias intestinais e toxicidade de fármacos.

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