Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células

O objetivo geral deste experimento é modificar geneticamente as células murinas mieloides 32D-G-CSF-R por superexpressão ou silenciamento do gene de interesse e determinar o efeito dessas alterações na proliferação e diferenciação neutrófila da linhagem celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da hematologia, como o envolvimento da proteína de interesse no crescimento e na diferenciação de células precursoras mieloides. A principal vantagem desta linhagem celular é que possui capacidade ilimitada de proliferação, é suscetível a manipulações genéticas, tem custo relativamente baixo e permite um grau de simplificação biológica necessário em certas abordagens experimentais. A demonstração do procedimento hoje será feita por Petr Danek, aluno de doutorado no meu laboratório.

Prepare 250 mililitros de Meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-3 murina. Em seguida, prepare 50 mililitros de meio de diferenciação.

Em uma placa de Petri de 16 centímetros, semeie uma suspensão de células isoladas de células Bosc23 em 18 mililitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal. Incube por aproximadamente 24 horas até que a confluência atinja 80%. Em seguida, combine o construto retroviral MSCV, o vetor de empacotamento PCL-echo, poli-etilenimina e meio com baixo teor de soro sem antibióticos. Incube essa mistura em uma câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente por 20 minutos. Então, substitua cuidadosamente o meio de cultura das células Bosc23 por 16 mililitros de meio DMEM pré-aquecido, suplementado com 2% de soro bovino fetal, mantido a 37 graus Celsius. A seguir, adicione a mistura retroviral gota a gota sobre as células Bosc23. Incube então o cultivo a 37 graus Celsius por quatro horas.

Após a incubação, aspire o meio de cultura Bosc23 e adicione 18 mililitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de soro bovino fetal. Incube as células a 37 graus Celsius por 48 horas. Utilize uma pipeta serológica de 25 mililitros para transferir o meio contendo o vírus Bosc23 para um tubo cônico de 50 mililitros. Armazene o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 18 mililitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de soro bovino fetal às células Bosc23 e cultive as células por 24 horas.

Centrifugue o sobrenatante viral a 1.500 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, alíquota o vírus e congele rapidamente com nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius.

Em cada poço de uma placa de seis poços, semeie células NIH/3T3 em três mililitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal para titular um vírus. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, dilua o vírus com meio pré-aquecido sem vórtex nos partículas virais. Aspire o meio de cultura das células NIH/3T3 e adicione um mililitro de vírus diluído em cada poço. Incube a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspire cuidadosamente o meio viral diluído e substitua por dois mililitros de meio DMEM com 10% de soro bovino fetal e novamente incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, aspire os meios antigos e substitua por meio DMEM contendo dois microgramas por mililitro de puromicina. Continue cultivando as células a cada três dias ou a menos que o meio fique amarelo, repondo com meio fresco contendo puromicina.

Entre o 10º e o 12º dia pós-infecção, aspire o meio dos poços e lave suavemente com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, cora com um mililitro de solução de violeta cristal a temperatura ambiente por dois minutos. Após a coloração, lave cuidadosamente duas vezes com solução salina tamponada com fosfato. Conte o número total de colônias azuis presentes em cada poço ao microscópio.

Plaque as células 32D-G-CSF-R em uma placa de seis poços. Adicione o vírus com uma multiplicidade de infecção entre 10 e 40. Em seguida, adicione polibreno até uma concentração final de oito microgramas por mililitro às células e incube a 37 graus Celsius por seis horas. Após a incubação, reúna as células em um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 450 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. As células 32D podem perder parcialmente sua capacidade de diferenciação se cultivadas em concentrações superiores a um milhão de células por ml; portanto, é muito importante repicar essas células no tempo certo e não deixar as culturas sobrecrescerem.

Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em um frasco de cultura T25 contendo seis mililitros de Meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-3 murina. Incube as células a 37 graus Celsius por 48 horas.

Lave as células 32D-G-CSF-R duas vezes com meio RPMI-1640 sem citocinas. Em seguida, semeie as células em um mililitro de meio de diferenciação em uma placa de 24 poços no dia zero e incube a 37 graus Celsius durante a noite. As células levarão de sete a nove dias para se diferenciarem em granulócitos maduros. Em seguida, conte o número de células utilizando azul de tripano para excluir as células mortas.

Como a IL-3 pode inibir o processo de diferenciação, é absolutamente essencial remover todos os vestígios dessa citocina antes de cultivar as células em GCSF.

Centrifugue as células em uma lâmina de vidro em uma centrífuga com os adaptadores necessários a 20 vezes g por cinco minutos. Em seguida, fixe as células em metanol por cinco minutos à temperatura ambiente e deixe as células secarem. Esmague as células utilizando a coloração de May-Grunwald Giemsa seguindo o protocolo do fabricante. Após a coloração, visualize as células que absorveram o corante utilizando ampliação de 40X.

Com base na morfologia celular, quantifique o número de blastos, células diferenciadas intermediariamente e granulócitos maduros nas células coradas.

É apresentada aqui uma representação gráfica que demonstra a proliferação de células 32D-G-CSF-R em meio contendo interleucina-3 e fator estimulador de colônias de granulócitos. O eixo x representa os dias de tratamento, e o eixo y representa a contagem celular em escala logarítmica. O gráfico em preto mostra a proliferação quando as células são cultivadas em meio contendo interleucina-3. O gráfico em azul mostra a diminuição da proliferação celular quando cultivadas em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos.

Apresentam-se aqui gráficos de setores representativos e coloração com May-Grunwald Giemsa mostrando a proporção e a morfologia da diferenciação de células 32D-G-CSF-R em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos. Os gráficos de setores demonstram a proporção de blastos, células intermediariamente diferenciadas e neutrófilos após tratamento com fator estimulador de colônias de granulócitos em zero, dois, quatro e seis dias. Células coradas com Giemsa no dia zero apresentam núcleos grandes e característicos e citoplasma escuro. No dia seis, o tamanho do núcleo é reduzido e o citoplasma está aumentado, mas não escuro.

Mostrados aqui estão gráficos de setores representativos indicando a maior proporção de células blásticas ao serem transduzidas com proteínas de fusão BCR-ABL em comparação com o vetor controle MSCV em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos. A coloração de Giemsa no painel inferior é representativa das células quando transduzidas com proteínas de fusão controle ou BCR-ABL.

As células sofreram diferenciação neutrófila no sexto dia quando transduzidas com vetor controle MSCV, mas as células transduzidas com BCR-ABL apresentaram predominantemente células blásticas e nenhum neutrófilo maduro.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de cultivar as células do receptor 32D-G-CSF nas concentrações indicadas. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de migração e experimentos de sobrevivência, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular a linhagem celular 32D-G-CSF, abrangendo a manipulação genética por transdução lentiviral e retroviral, expansão, diferenciação e avaliação da proliferação e diferenciação dessas células. Não se esqueça de que trabalhar com vírus pode ser perigoso e precauções, como o uso de luvas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.