Name: Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a modificar geneticamente células precursoras mieloides murinas 32D/G-CSF-R para estudar proliferação e diferenciação neutrofílica. Este método permite investigar o papel de genes específicos no desenvolvimento hematológico.

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Os autores Obrigado Prof Ruud Delwel e Prof Ivo Touw por nos oferecer a linha celular 32G/G-CSF-R e Prof Daniel G. Tenen por fornecer-nos com a linha de celular Bosc23. Este trabalho foi financiado por doações da Agência Grant da República Checa (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, o apoio do Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências a Checa (RVO 68378050) ao MA-J, uma bolsa de GA UK (projeto n. º 341015) da Universidade Charles de Praga para o MK e uma bolsa de GA UK (projeto n. º 1278217) da Universidade Charles de Praga para PD.

Nota: Passos descrevendo a expansão, diferenciação e transdução de 32G/G-CSF-R células são apresentados abaixo.
1. preparação
<ol><li>Preparação de meios de comunicação
	<ol>
<li>Preparar 250 mL de meio de cultura: suplementado com 10% de calor 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) inativada FBS (soro fetal bovino) e IL-3 murino (10 ng/mL).<ol>
<li>Como alternativa, use o caseiro IL-3. Para produzir caseiras IL-3, transduce células HEK293 com vetor expressando IL-3 e IL-3 contendo sobrenadante22de recolher. Nota: Os antibióticos, como a penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), podem ser usados para o cultivo de células em qualquer etapa do protocolo a menos que indicado o contrário.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare-se 50 mL de meio de diferenciação: RPMI 1640 meio suplementado com 10% FBS e G-CSF humano (100 ng/mL). Nota: Nem todos os lotes de soro suportam a diferenciação das células de 32G/G-CSF-R (importante). Antes do início do experimento teste diferentes lotes de soro. É aconselhável testar pelo menos 4 lotes diferentes e selecione o ideal baseado na capacidade das células de 32G/G-CSF-R para diferenciar. Veja o protocolo de diferenciação de 32G/G-CSF-R abaixo.</li>
		<li>Prepare-se 10 mL de meio de congelação: RPMI 1640 meio suplementado com 40% FBS e 10% DMSO (Dimetilsulfóxido).</li>
	</ol></li>
	<li>Produção de retrovírus
	<ol>
<li>Placa de uma suspensão de célula única de células Bosc23 (6 × 10-6) em um prato de Petri de 16 cm e cultivar em 18 mL de DMEM (médio modificado águia de Dulbecco) contendo 10% FBS até a confluência da cultura chega a 80% (24h). Nota: As células devem crescer em uma monocamada e não forma touceiras em cultura. Contagem de células pode ser realizada usando diferentes métodos (válidos para o resto dos protocolos aqui apresentados). Em caso de baixo número de amostras, contagem manual sob o microscópio utilizando câmara de Bürker é recomendado. Nesse caso, use Trypan azul para exclusão de células mortas. Misture pilhas 1:1 com 0,4% Trypan azul em PBS. Para realizar a contagem de grande número de amostras, um contador automático de células pode ser empregado.</li>
		<li>Combine a 40 µ g de construção retroviral (como MSCV), 20 µ g de pCL-Eco (vetor de embalagem)23, 80 µ l de PEI (o polyethylenimine) e 2 mL do meio médio reduzido-soro (por exemplo, Opti-MEM) (sem antibióticos). Incube a mistura por 20 min em temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Cuidadosamente, substituir Bosc23 células medium com 16 mL DMEM suplementado com 2% FBS. Pré-aquecer a médio e a 37 ° C antes do uso. Nota: Não use antibióticos durante a transfeccao, uma vez que pode reduzir a eficiência do transfection.</li>
		<li>Adicione a mistura preparada em 1.2.2. gota a gota e cuidadosamente para o Bosc23 da cultura e incube por 4 h a 37 ° C. Incubação de limite inferior a 6 h devido à toxicidade de PEI.</li>
		<li>Após a incubação, altere Bosc23 médio para 18 mL pré aquecido DMEM contendo 10% FBS e cultivar células por 48 h a 37 ° C. Coloque os pratos em um laboratório de nível 2 de biossegurança, manter aqui desta etapa em e siga os procedimentos de segurança padrão.</li>
		<li>Bosc23 médio (contendo partículas de ecotropic retroviral) usando uma pipeta sorológica de 25 mL para um tubo cónico de 50 mL de coletar e armazenar a 4 ° C. Nota: Eficiência de transfeccao (importante) deve chegar a 90% para produzir um vírus de alta concentração.</li>
		<li>Adicionar 18ml pré aquecido DMEM 10% FBS para Bosc23 células e cultivar por 24 h.</li>
		<li>Repita a etapa 1.2.6. Nota: Retroviral sobrenadantes de 1.2.6 e 1.2.8 podem ser pool, uma vez que eles atinjam a mesma temperatura (4 ° C) para preservar a integridade viral.</li>
		<li>Para evitar a contaminação de Bosc23 em sobrenadantes virais, girar o vírus coletado em 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Alíquota vírus, snap congelamento com nitrogênio líquido ou gelo seco e armazenar a-80 ° C. No entanto, observe que esse vírus recentemente preparado é de qualidade superior em termos de eficiência de infecção estoques congelados. Nota: Evite (importante) repetitiva de congelamento/descongelamento de vírus, uma vez que leva à degradação viral.</li>
	</ol></li>
	<li>Produção de lentivirus
	<ol>
<li>Placa de uma suspensão de célula única de HEK293T (rim embrionário humano 293T) células (6 × 10-6) em um prato de Petri de 16 cm e cultivar em 18 mL de DMEM contendo 10% FBS até a confluência da cultura chega a 80% (24h). Nota: As células devem crescer em uma monocamada e não forma touceiras em cultura.</li>
		<li>Combinar a 15 µ g de Lentivirus construção (como pGhU6), embalagem pCMVdR8.74 de plasmídeos (codificação para gag/pol, 12 µ g) e pMD2.VSVG (codificação para VSV-G, 1,4 µ g), µ l 85.2 PEI e 2 mL de meio de soro e reduzida (sem antibióticos). Incubar a esta mistura por 20 min no RT</li>
		<li>Cuidadosamente, substituir HEK293T medium com 16 mL de DMEM suplementado com 2% FBS. Pré-aquecer a médio e a 37 ° C antes do uso. Não utilize antibióticos durante a transfeccao, uma vez que pode reduzir a eficiência do transfection.</li>
		<li>Com cuidado solte a mistura preparada em 1.3.2 à cultura de pilha HEK293T e incube por 4 h a 37 ° C. Limitar a duração de incubação para dentro de 6 h para prevenir a toxicidade de PEI.</li>
		<li>Médio e mudança 18ml pré aquecido DMEM 10% FBS e cultivar células por 48 h a 37 ° C. Coloque os pratos em um laboratório de nível 2 de biossegurança, manter aqui desta etapa em e siga os procedimentos de segurança padrão.</li>
		<li>Coletar HEK293T médio (que contém particulas de Lentivirus de amphotropic), usando uma pipeta sorológica de 25 mL para um tubo cónico de 50 mL e armazená-lo em 4 ° C. Nota: Eficiência de transfeccao (importante) deve chegar a 90% para produzir um vírus de alta concentração.</li>
		<li>Adicionar cuidadosamente 18 mL de DMEM pré-aquecido 10% FBS às células HEK293T. Cultivamos por 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Repita a etapa 1.3.6. Nota: Lentivirus sobrenadantes de 1.3.6 e 1.3.8 podem ser agrupados quando atingem a mesma temperatura (4 ° C) para preservar a integridade viral.</li>
		<li>Para evitar a contaminação do sobrenadante viral com células HEK293T, girar o vírus coletado em 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Alíquota vírus, snap congelamento com nitrogênio líquido ou gelo seco e armazená-lo a-80 ° C. No entanto, observe que preparadas de vírus é de qualidade superior em termos de eficiência de infecção estoques congelados. Nota: Evite (importante) repetitiva de congelamento/descongelamento de vírus, uma vez que leva à degradação viral.</li>
	</ol></li>
	<li>Titulação do vírus contendo um repórter GFP
	<ol>
<li>1 × 105 NIH/3T3 células em 300 µ l de DMEM de sementes 10% FBS por alvéolo em uma placa de 24. 7 poços serão empregados para vírus de um título.</li>
		<li>Descongelar o vírus a 37 ° C e adicionar 1, 5, 10, 50, 100 e 500 vírus µ l para culturas de NIH/3T3. Não adicione qualquer vírus no controle negativo bem. Cultivar células na presença do vírus por 48 h a 37 ° C.</li>
		<li>Colher células NIH/3T3 usando 30 µ l de tripsina/EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) (0,25% Trypsin, EDTA 0,01% em PBS) e colocar as células em 250 µ l PBS em um tubo de FACS (classificação de célula de fluorescência ativada).</li>
		<li>Determine a frequência de células GFP+ por citometria de fluxo em cada amostra24. Exclua células mortas pela adição de um corante de viabilidade, tais como a Hoechst 33258.</li>
		<li>Calcular o número total de células GFP+ (com base no número de células chapeados e percentagem de células GFP+ ) e parcela-las contra o volume de vírus usada para infecção. Nota: (Importante) eficiência de infecção atinge um platô quando grandes doses de virais são aplicadas. Portanto, é importante estimar o título com base na concentração viral no qual infecção eficiência ocorre em uma escala linear (exemplo mostrado na tabela 1). O número de células GFP+ indica o número de partículas virais funcionais (TU - transformando unidades) em um volume determinado vírus. Recalcule o número de TU por mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Titulação do vírus contendo um repórter de puromicina
	<ol>
<li>10% de sementes 5 × 104 células de NIH/3T3 em 3 mL de DMEM FBS por alvéolo em uma placa de 6; emprega 6 poços de vírus de um título. Cultura durante a noite a 37 ° C.</li>
		<li>No dia seguinte diluir vírus conforme indicado na tabela 2. Para diluir o vírus, use DMEM pré-aquecido 10% FBS. Fazer não o vórtice.</li>
		<li>Remover o meio de cultura de células NIH/3T3 e adicionar 1 mL de vírus diluído.</li>
		<li>Incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
		<li>Delicadamente, substituir o meio contendo vírus com 2 mL de DMEM pré-aquecido 10% FBS e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
		<li>Delicadamente, substitua NIH/3T3 médio com 2 mL de pré-aquecido DMEM 10% FBS contendo puromicina (2 µ g/mL).</li>
		<li>Cultura em 37 ° C e cuidadosamente atualização médio com puromicina cada 3 dias ou quando o meio fica amarelo.</li>
		<li>Em 10-12 dias após a infecção, Aspire o meio de cada poço e lave delicadamente com PBS.</li>
		<li>Manchar com 1 mL de solução de cristal violeta (violeta de cristal de 0,5% em 20% de etanol e dH2O), 2 min no RT e Lave cuidadosamente com PBS duas vezes.</li>
		<li>Colônias de contagem azul presentes em cada poço sob um microscópio (ampliação X4). Não devem ser observadas colónias no controle negativo bem.</li>
		<li>Calcule o número total de TU/mL, considerando o factor de diluição.</li>
	</ol></li>
</ol>2. a expansão e manutenção das células de 32G/G-CSF-R
<ol><li>Se as células de 32G/G-CSF-R estão congeladas, tomar uma alíquota e descongelar as células em um banho de água de 37 ° C por 1 min e despeje células do frasco diretamente em 10 mL de pré-aquecido RPMI 1640 suplementado com 10% FBS em um tubo de 15mL. Inverter o tubo 3 vezes e girar as células para baixo a 400 g. × remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura contendo IL-3 em uma concentração de 0,3 × 106 células/mL.</li>
	<li>Concentração de crescimento de célula ideal é 0.25-0.5 × 106 células/mL. Dividir células a cada 2 dias, trazendo-os para uma concentração de 0.1-0.2 × 106 células/mL. Nota: As células de 32G/G-CSF-R (importante) podem parcialmente perdem a capacidade de diferenciar-se crescido para concentrações superiores a 1 × 106 células/mL. Portanto, é muito importante dividir células 32G/G-CSF-R no tempo.</li>
	<li>Conforme necessário, congelar e armazenar alíquotas de célula por longos períodos de tempo a-80 ° C ou em nitrogênio líquido. Spin para baixo 3 × 106 células, remover o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de meio de congelação. Coloque o tubo em um recipiente de congelamento a-80 ° C. Para armazenamento a longo prazo, reposicione as células de nitrogênio líquido.</li>
</ol>3. transdução da células de 32G/G-CSF-R
<ol><li>Células de 32G/G-CSF-R de placa em placa de 6 em uma concentração de 0,3 × 106 células/mL.</li>
	<li>Adicione a quantidade apropriada de vírus para alcançar um MOI (multiplicidade de infecção), entre 10 e 40. Nota: MOI superior resultará em maior percentagem de células GFP+ , bem como maiores níveis de expressão do gene de interesse. Exemplo: Para infectar 0,3 × 106 células com um MOI de 10; 3 × 106 TU precisará ser adicionado às células 32G/G-CSF-R.</li>
	<li>Adicionar polybrene à concentração final 8 µ g/mL e incubar durante 6 h a 37 ° C. Alternativamente, executar um procedimento de inoculação de centrifugação: centrifugar a 1200 × g por 90 min a 30 ° C em uma placa de cultivo utilizando um rotor de balanço-balde e incubar durante 3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Coletamos células, transfira para um tubo de 15 mL e giram em 450 × g por 5 min (4 ° C).</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet de células em 6 mL de meio de cultura, colocar em um frasco de cultura celular T25 e cultura a 37 ° C.</li>
	<li>48 h depois, colher células e girá-los em 450 × g por 5 min (4 ° C). Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>No caso de um repórter GFP: colocar as células em 500 µ l de PBS e classificar células GFP+ usando um classificador de citometria de fluxo. No caso de um repórter de puromicina contendo vector: colocar as células em meio de cultura contendo 2 µ g/mL de puromicina.</li>
	<li>Expanda as células conforme necessário para experiências e análises posteriores. Nota: Células Transduced (opcional) podem ser congeladas no congelamento de mídia em um recipiente de congelamento a-80 ° C e mais armazenadas em nitrogênio líquido.</li>
</ol>4. 32G/G-CSF-R ensaio de proliferação de células
<ol><li>Para avaliar a proliferação taxa lugar 0.2 × 106 células em 1 mL de meio de cultura e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte contar o número de células e diluí-los de volta para uma concentração de 0.2 × 106 células/mL, utilizando o meio de cultura. Incubar durante uma noite a 37 ° C. Manter registros de célula concentrações e diluições aplicadas às culturas diariamente usando a tabela 3.</li>
	<li>Repita a etapa 4.2 para tantos dias como proliferação deve ser avaliada. Nota: O comprimento dos ensaios proliferação vai depender do efeito do gene de interesse. No caso de um fenótipo forte, 8-9 dias pode ser suficientes para observar um efeito significativo (ver Figura 3A). No entanto, no caso de um fenótipo suave, longos períodos de tempo podem ser necessários.</li>
	<li>Avalie o crescimento celular, fazendo uma curva de proliferação, como indicado na tabela 3.</li>
</ol>5. ensaio de diferenciação de células 32G/G-CSF-R
<ol><li>Lavam-se 0,2 × 106 células de 32G/G-CSF-R duas vezes com meio RPMI sem citocinas. Nota: As etapas de lavagem antes da adição de G-CSF na cultura são importantes, desde que a presença de IL-3 residual pode inibir a diferenciação.</li>
	<li>Colocar as células em meio de diferenciação 1 mL (contendo 100 ng/mL G-CSF) em um poço 24/placa, resultando em uma concentração de célula de 0.2 × 106 células/mL (dia 0). Cultura durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Contar o número de células/mL, como indicado acima (passo 1.2.1).</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 células sobre uma lâmina de vidro (76 X 26 mm) utilizando uma centrífuga com adaptadores necessários em 20 × g.</li>
	<li>Atualize as células de médio e placa de diferenciação na concentração de 0.2 × 105 células/mL em um poço/placa 24 (1 dia). Descartar a placa velha e prosseguir no dia seguinte com passo 5.6 com a placa nova.</li>
	<li>Nos dias 2 a 7, repita as etapas de 5,3 a 5.5. Avalie a proliferação celular na presença de G-CSF, conforme descrito na etapa 4. Nota: (Importante) durante a diferenciação, proliferação celular desacelera, portanto depois de 3 a 4 dias na presença de G-CSF é adequada para as células de cultura em altas concentrações.</li>
	<li>Avalie o estado de diferenciação das células de 32G/G-CSF-R com base na morfologia celular.<ol>
<li>Consertar as células da etapa 5.4 em metanol durante 5 min à RT e deixar slides para secar ao ar livre. Nota: Slides de dia 0 a 7 podem ser armazenadas no RT e fixo ao mesmo tempo. Da mesma forma, eles podem também ser mantidos no RT por longos períodos após a fixação.</li>
		<li>Mancha de células usando maio-Grünwald Giemsa mancha o protocolo seguinte do fabricante.</li>
		<li>Visualize células coradas, usando um microscópio e ampliação X40.</li>
		<li>Quantificar o número de blastos, células intermediària diferenciadas e granulócitos maduros usando Fotos ilustrativas na descrição na tabela 4e Figura 1 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A escolha de um modelo experimental é uma das principais questões em investigação. Apesar de células primárias de animais e humanas são acreditadas para produzir os dados mais biologicamente relevantes, estes modelos podem envolver preocupações éticas e são frequentemente associados com procedimentos caros e/ou sofisticado isolamento/cultivo. As células primárias são limitadas em número e é dificil geneticamente manipulá-los. Além disso, as células primárias representam uma população heterogênea, composta de vários tipos...

A população de tronco e progenitoras hematopoiética fornece o organismo com uma grande variedade de células maduras, incluindo as células da linhagem mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos). O processo que conduz à produção de células mieloides das pilhas de haste hematopoietic é conhecido como myelopoiesis, e produção adequada de células mieloides maduras, em resposta às novas demandas é um pré-requisito para o enfrentamento adequado do organismo com o stress condições, tais como infecções e perda de sangue. Produção insuficiente de células mieloides maduras pode levar à incapacidade de eliminar os agentes patogénicos, coagulação sanguínea reduzida e outros fatais condições1,2. Além disso, alterações no desenvolvimento da linhagem mieloide podem também ser associadas com malignidades hematológicas, como a leucemia mieloide aguda (LMA)3. Alterações no myelopoiesis podem ocorrer devido a várias razões, tais como defeitos no celular receptores de superfície4, expressões alterados de fatores de transcrição5, prejudicados de vias de sinalização6, mutações, resultando na formação / ativação de oncogenes7ou inactivação do tumor supressor genes8.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar o desenvolvimento mieloide e avaliar o efeito de alterações genéticas específicas neste processo. Abordagens comuns usadas para estudar myelopoiesis envolvem as células primárias e ratos transgénicos. Embora estes modelos permitem a aquisição de dados biologicamente relevantes, eles têm certas limitações. O uso de células primárias encontra um número limitado de células e um período restrito da cultura, estreitando as possibilidades para alterar a expressão gênica e posterior análise biológica ou bioquímica. Camundongos transgênicos são caros e exigem um grau razoável de justificação biológica. Além disso, trabalho com modelos em vivo adiciona um grau de complexidade em compreender o papel de um gene de interesse em um determinado processo. Portanto, abordagens alternativas para contornar essas limitações são necessários. Linhas celulares têm vantagens indiscutíveis: (1) eles possuem capacidade de proliferação ilimitada que permite gerar material suficiente para estudos bioquímicos e biológicos, (2) eles são suscetíveis a manipulações genéticas (knockdown, nocaute, superexpressão), (3) o custo é relativamente baixo, e (4) permitem um grau de simplificação biológica necessária em certas abordagens experimentais.
A IL-3 parental (interleucina-3) dependente 32G linha celular foi criada em 1983 por Greenberger e colegas por infecção de células de medula óssea de camundongos C3H/HeJ com amigo murino leucemia vírus9. Vários clones 32D foram descritos na literatura: cl-239, cl-310e cl-1011. As células de cl-3 32D foram mostradas para proliferar em IL-3 e se submeter a diferenciação neutrofílica após tratamento com estimulação de colônias de granulócitos-colônia factor (G-CSF)10. Pelo contrário, 32D cl-10 células, enquanto ser dependente de IL-3, originalmente foram não diferenciar na resposta ao tratamento de G-CSF. Em 1995, o grupo do Dr. Ivo Touw retrovirally transfectadas 32D cl-10 pilhas tipo selvagem e formas mutantes do receptor de G-CSF (G-CSF-R), a fim de identificar regiões funcionalmente importantes deste receptor11. Este estudo resultou na geração de células 32G/G-CSF-R, que são da mesma forma dependente da IL-3, mas dentro de 6 a 10 dias após a substituição da IL-3 G-CSF, células param para proliferar e diferenciar irreversivelmente em neutrófilos maduros. Estas propriedades tornam 32D cl-3 e modelos simplificados de 32G/G-CSF-R células de murino neutrofílico diferenciação que pode ser modulada por duas crescimento bem definido e fatores de diferenciação - IL-3 e G-CSF. Durante as últimas décadas vários grupos utilizaram células 32G/G-CSF-R para estudar o papel dos genes específicos em proliferação e diferenciação de células mieloides em cultura12,13,14,15 , 16e estudar o G-CSF sinalização17,18. Importante, os resultados obtidos com esta linha de celular correlacionaram com dados obtidos com as células primárias e ratos transgénicos16,19,20,21. Consequentemente, acreditamos que células de 32G/G-CSF-R, sendo um modelo amplamente utilizado e bem estabelecido, representam um valioso sistema de estudar a diferenciação mieloide, que pode ser usada em paralelo com outras abordagens para tratar esta questão.
Aqui, protocolos detalhados descrevendo a manipulação da linha celular 32G/G-CSF-R, que expansão de cobertura, diferenciação e avaliação da proliferação e diferenciação dessas células é apresentada. Informações detalhadas para modificação genética de células de 32G/G-CSF-R, quer por transdução retroviral ou particulas de Lentivirus, bem como os protocolos para a titulação do vírus são fornecidas. Além disso, vários resultados representativos que demonstram potenciais aplicações das células de 32G/G-CSF-R são fornecidos.

<table><tbody><tr><td>Meio em pó RPMI 1640</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, EUA</td><td>T 121-10</td><td>sem NaHCO3, com L-glutamina</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio de soro reduzido</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>31985-047</td><td>L-glutamina, vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Laboratórios PAA (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA)</td><td>MT35011CV</td><td>Para diferenciação de células 32D/G-CSF-R Soro</td></tr><tr><td>bovino fetal (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>10270</td><td>Usado para cultura HEK293T, NIH3T3, células BOSC23</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>S9137</td><td>Pó de sal de sulfato de estreptomicina</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>murino IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>humano G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polietileninina</td><td>Polyscience, Warrington, PA, EUA</td><td>23966</td><td>Linear, MW 25.000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td> <td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, EUA</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td> <td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td> <td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td> <td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, Itália</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

proliferação e diferenciação de murino precursor mieloide 32g/g-csf-r células

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Compreensão da hematopoiética estaminais e progenitor da biologia das células tem implicações importantes para o tratamento de patologias hematológicas e medicina regenerativa. Apesar dos dados mais relevantes que podem ser adquiridos usando modelos na vivo ou culturas primárias, a baixa abundância de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas restringe consideravelmente a piscina de técnicas adequadas para sua investigação. Portanto, o uso de linhas celulares permite produção suficiente de material biológico para o desempenho das seleções ou ensaios que requerem números de células grandes. Aqui apresentamos uma descrição detalhada, leitura e interpretação de ensaios de proliferação e diferenciação, que são utilizados para a investigação dos processos envolvidos na myelopoiesis e diferenciação neutrofílica. Estas experiências empregam a linha de célula mieloide murino dependente de citocinas 32G/G-CSF-R, que possui a habilidade de se proliferam na presença de IL-3 e se diferenciam em G-CSF. Nós fornecemos otimizado de protocolos para a manipulação de células de 32G/G-CSF-R... e discutir as principais armadilhas e inconvenientes que possam comprometer os ensaios descritos e os resultados esperados. Além disso, este artigo contém protocolos para produção de Lentivirus e retroviral, titulação e transdução de células de 32G/G-CSF-R. Demonstramos que manipulação genética destas células pode ser empregada com sucesso realizar estudos moleculares e funcionais, que podem complementar os resultados obtidos com primárias células tronco e progenitoras hematopoiéticas ou modelos na vivo .

Proliferação e diferenciação das células de 32G/G-CSF-R
Para avaliar a proliferação de células de 32G/G-CSF-R condições pro-proliferativa e pro-diferenciação, 32G/G-CSF-R as células foram cultivadas em meios contendo IL-3 e G-CSF, respectivamente. Observou-se que as células cultivadas num meio contendo de IL-3 (10 ng/mL) dividem aproximadamente cada 24 h (Figura 2A). Após substituição da IL-3 com G-CSF...

Apresentam-se aqui detalhados protocolos para a linha de celular de 32G/G-CSF-R precursor mieloide murino de cultivo, realizando a infecções virais e realizar ensaios de proliferação e diferenciação. Esta linha de celular é adequada para estudar o desenvolvimento de células mieloides e o papel dos genes de interesse no crescimento de células mieloides e diferenciação neutrofílica.

Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

O objetivo geral deste experimento é modificar geneticamente as células murinas mieloides 32D-G-CSF-R por superexpressão ou silenciamento do gene de interesse e determinar o efeito dessas alterações na proliferação e diferenciação neutrófila da linhagem celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da hematologia, como o envolvimento da proteína de interesse no crescimento e na diferenciação de células precursoras mieloides. A principal vantagem desta linhagem celular é que possui capacidade ilimitada de proliferação, é suscetível a manipulações genéticas, tem custo relativamente baixo e permite um grau de simplificação biológica necessário em certas abordagens experimentais. A demonstração do procedimento hoje será feita por Petr Danek, aluno de doutorado no meu laboratório.Prepare 250 mililitros de Meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-3 murina. Em seguida, prepare 50 mililitros de meio de diferenciação.Em uma placa de Petri de 16 centímetros, semeie uma suspensão de células isoladas de células Bosc23 em 18 mililitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal. Incube por aproximadamente 24 horas até que a confluência atinja 80%. Em seguida, combine o construto retroviral MSCV, o vetor de empacotamento PCL-echo, poli-etilenimina e meio com baixo teor de soro sem antibióticos. Incube essa mistura em uma câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente por 20 minutos. Então, substitua cuidadosamente o meio de cultura das células Bosc23 por 16 mililitros de meio DMEM pré-aquecido, suplementado com 2% de soro bovino fetal, mantido a 37 graus Celsius. A seguir, adicione a mistura retroviral gota a gota sobre as células Bosc23. Incube então o cultivo a 37 graus Celsius por quatro horas.Após a incubação, aspire o meio de cultura Bosc23 e adicione 18 mililitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de soro bovino fetal. Incube as células a 37 graus Celsius por 48 horas. Utilize uma pipeta serológica de 25 mililitros para transferir o meio contendo o vírus Bosc23 para um tubo cônico de 50 mililitros. Armazene o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 18 mililitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de soro bovino fetal às células Bosc23 e cultive as células por 24 horas. Centrifugue o sobrenatante viral a 1.500 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, alíquota o vírus e congele rapidamente com nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Em cada poço de uma placa de seis poços, semeie células NIH/3T3 em três mililitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal para titular um vírus. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, dilua o vírus com meio pré-aquecido sem vórtex nos partículas virais. Aspire o meio de cultura das células NIH/3T3 e adicione um mililitro de vírus diluído em cada poço. Incube a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspire cuidadosamente o meio viral diluído e substitua por dois mililitros de meio DMEM com 10% de soro bovino fetal e novamente incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, aspire os meios antigos e substitua por meio DMEM contendo dois microgramas por mililitro de puromicina. Continue cultivando as células a cada três dias ou a menos que o meio fique amarelo, repondo com meio fresco contendo puromicina.Entre o 10º e o 12º dia pós-infecção, aspire o meio dos poços e lave suavemente com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, cora com um mililitro de solução de violeta cristal a temperatura ambiente por dois minutos. Após a coloração, lave cuidadosamente duas vezes com solução salina tamponada com fosfato. Conte o número total de colônias azuis presentes em cada poço ao microscópio.Plaque as células 32D-G-CSF-R em uma placa de seis poços. Adicione o vírus com uma multiplicidade de infecção entre 10 e 40. Em seguida, adicione polibreno até uma concentração final de oito microgramas por mililitro às células e incube a 37 graus Celsius por seis horas. Após a incubação, reúna as células em um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 450 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. As células 32D podem perder parcialmente sua capacidade de diferenciação se cultivadas em concentrações superiores a um milhão de células por ml; portanto, é muito importante repicar essas células no tempo certo e não deixar as culturas sobrecrescerem. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em um frasco de cultura T25 contendo seis mililitros de Meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-3 murina. Incube as células a 37 graus Celsius por 48 horas.Lave as células 32D-G-CSF-R duas vezes com meio RPMI-1640 sem citocinas. Em seguida, semeie as células em um mililitro de meio de diferenciação em uma placa de 24 poços no dia zero e incube a 37 graus Celsius durante a noite. As células levarão de sete a nove dias para se diferenciarem em granulócitos maduros. Em seguida, conte o número de células utilizando azul de tripano para excluir as células mortas. Como a IL-3 pode inibir o processo de diferenciação, é absolutamente essencial remover todos os vestígios dessa citocina antes de cultivar as células em GCSF. Centrifugue as células em uma lâmina de vidro em uma centrífuga com os adaptadores necessários a 20 vezes g por cinco minutos. Em seguida, fixe as células em metanol por cinco minutos à temperatura ambiente e deixe as células secarem. Esmague as células utilizando a coloração de May-Grunwald Giemsa seguindo o protocolo do fabricante. Após a coloração, visualize as células que absorveram o corante utilizando ampliação de 40X.Com base na morfologia celular, quantifique o número de blastos, células diferenciadas intermediariamente e granulócitos maduros nas células coradas. É apresentada aqui uma representação gráfica que demonstra a proliferação de células 32D-G-CSF-R em meio contendo interleucina-3 e fator estimulador de colônias de granulócitos. O eixo x representa os dias de tratamento, e o eixo y representa a contagem celular em escala logarítmica. O gráfico em preto mostra a proliferação quando as células são cultivadas em meio contendo interleucina-3. O gráfico em azul mostra a diminuição da proliferação celular quando cultivadas em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos.Apresentam-se aqui gráficos de setores representativos e coloração com May-Grunwald Giemsa mostrando a proporção e a morfologia da diferenciação de células 32D-G-CSF-R em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos. Os gráficos de setores demonstram a proporção de blastos, células intermediariamente diferenciadas e neutrófilos após tratamento com fator estimulador de colônias de granulócitos em zero, dois, quatro e seis dias. Células coradas com Giemsa no dia zero apresentam núcleos grandes e característicos e citoplasma escuro. No dia seis, o tamanho do núcleo é reduzido e o citoplasma está aumentado, mas não escuro.Mostrados aqui estão gráficos de setores representativos indicando a maior proporção de células blásticas ao serem transduzidas com proteínas de fusão BCR-ABL em comparação com o vetor controle MSCV em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos. A coloração de Giemsa no painel inferior é representativa das células quando transduzidas com proteínas de fusão controle ou BCR-ABL.As células sofreram diferenciação neutrófila no sexto dia quando transduzidas com vetor controle MSCV, mas as células transduzidas com BCR-ABL apresentaram predominantemente células blásticas e nenhum neutrófilo maduro. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de cultivar as células do receptor 32D-G-CSF nas concentrações indicadas. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de migração e experimentos de sobrevivência, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular a linhagem celular 32D-G-CSF, abrangendo a manipulação genética por transdução lentiviral e retroviral, expansão, diferenciação e avaliação da proliferação e diferenciação dessas células. Não se esqueça de que trabalhar com vírus pode ser perigoso e precauções, como o uso de luvas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

Este vídeo demonstra um método para obter células semelhantes a células de Schwann a partir de células estromais da medula óssea (BMSCs) multipotentes. Inicialmente, as BMSCs passam por tratamento de hipóxia, seguido de diferenciação direcionada em células progenitoras neuronais. Posteriormente, condições específicas de meio e cultura são empregadas para induzir a transformação dessas células progenitoras em células semelhantes a células de Schwann.

Geração de células semelhantes a células de Schwann a partir de células estromais da medula óssea

Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

As células do estroma da marrow (MSCs) com potencial neural existem dentro da medula óssea. Nosso protocolo enriquece essa população de células por meio de pré-condicionamento hipóxico e, posteriormente, as direciona para se tornar células maduras de Schwann.

Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Aprenda a modificar geneticamente células precursoras mieloides murinas 32D/G-CSF-R para estudar proliferação e diferenciação neutrofílica. Este método permite investigar o papel de genes específicos no desenvolvimento hematológico.

Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células

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