Proliferação e diferenciação de murino Precursor mieloide 32G/G-CSF-R células

O objetivo geral deste experimento é modificar geneticamente as células mieloides murinas 32D-G-CSF-R, superexpressando ou silenciando o gene de interesse e determinando o efeito dessas mudanças na proliferação e diferenciação neutrofílica da linhagem celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hematologia, como como sua proteína de interesse pode estar envolvida no crescimento e diferenciação de células precursoras mieloides. A principal vantagem dessa linhagem celular é que ela possui capacidade de proliferação ilimitada, é suscetível a manipulações genéticas, o custo é relativamente baixo e permite um grau de simplificação biológica necessário em certas abordagens experimentais.

Demonstrando o procedimento hoje estará Petr Danek, um estudante de doutorado em meu laboratório. Prepare 250 mililitros de meio RPMI-1640 suplementado com soro bovino fetal 10% inativado pelo calor e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-3 murina. Em seguida, prepare 50 mililitros de meio de diferenciação.

Em uma placa de Petri de 16 centímetros, semeie a suspensão unicelular de células Bosc23 em 18 mililitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal. Cultura por cerca de 24 horas até que a confluência atinja 80%Em seguida, combine a construção retroviral MSCV, vetor de eco PCL, polietilenonimina e reduza o meio sérico sem antibióticos. Incube esta mistura em uma caixa de fluxo em temperatura ambiente por 20 minutos.

Em seguida, substitua cuidadosamente o meio de cultura de células Bosc23 por 16 mililitros de meio DMEM pré-aquecido suplementado com 2% de soro bovino fetal mantido a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione a mistura retroviral gota a gota nas células Bosc23. Em seguida, incube a cultura a 37 graus Celsius por quatro horas.

Terminada a incubação, aspirar o meio de cultura Bosc23 e adicionar 18 mililitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de soro bovino fetal. Incube as células a 37 graus Celsius por 48 horas. Use uma pipeta sorológica de 25 ml para aspirar o meio contendo o vírus Bosc23 em um tubo cônico de 50 mililitros.

Armazene o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 18 mililitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de soro bovino fetal às células Bosc23 e cultive as células por 24 horas. Centrifugue o sobrenadante viral a 1.500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, alíquota do vírus e congele-o com nitrogênio líquido para armazenar a 80 graus Celsius negativos. Em cada poço de uma placa de seis poços, semeie células NIH / 3T3 em três mililitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal para titular um vírus. Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, diluir o vírus com meio pré-aquecido sem vórtice das partículas virais. Aspire o meio de cultura das células NIH / 3T3 e adicione um mililitro de vírus diluído em cada poço. Incube a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, aspire cuidadosamente o meio viral diluído e substitua por dois mililitros de meio DMEM por soro bovino fetal a 10% e incube novamente a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, aspirar o meio antigo e substituí-lo por dois microgramas por mililitro de meio DMEM contendo puromicina. Continue cultivando as células a cada três dias ou, a menos que o meio fique amarelo e reabasteça com meio fresco contendo puromicina.

Entre o 10º e o 12º dia após a infecção, aspire o meio dos poços e lave suavemente com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, core com um mililitro de solução de cristal violeta em temperatura ambiente por dois minutos. Após a coloração, lave cuidadosamente com solução salina tamponada com fosfato duas vezes.

Conte o número total de colônias azuis presentes em cada poço sob um microscópio. Semeie as células 32D-G-CSF-R em uma placa de seis poços. Adicione vírus em uma multiplicidade de infecção entre 10 e 40.

Em seguida, adicione polibreno a uma concentração final de oito microgramas por mililitro às células e incube a 37 graus Celsius por seis horas. Após a incubação, agrupe as células em um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 450 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. As células 32D podem perder parcialmente sua capacidade de se diferenciar se crescerem em concentrações superiores a um milhão de células por ml.

Portanto, é muito importante dividir essas células a tempo e não crescer demais nas culturas. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num balão de cultura T25 contendo seis mililitros de meio RPMI-1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% inativado pelo calor e 10 nanogramas por mililitro de interleucina-3 murina. Incube as células a 37 graus Celsius por 48 horas.

Lave as células 32D-G-CSF-R duas vezes com meio RPMI-1640 sem citocinas. Em seguida, semeie as células em um mililitro de meio de diferenciação em uma placa de 24 poços no dia zero e incube a 37 graus Celsius durante a noite. As células levarão de sete a nove dias para se diferenciar em granulócitos maduros.

Em seguida, conte o número de células usando azul de tripano para excluir células mortas. Como a IL-3 pode inibir o processo de diferenciação, é absolutamente crítico remover todos os vestígios da citocina antes de cultivar as células no GCSF. Citospin as células em uma lâmina de vidro em uma centrífuga com adaptadores necessários a 20 vezes g por cinco minutos.

Em seguida, fixe as células em metanol por cinco minutos em temperatura ambiente e deixe as células secarem. Pinte as células usando a coloração May-Grunwald Giemsa seguindo o protocolo do fabricante. Uma vez corado, visualize as células que sofreram a coloração usando uma ampliação de 40X.

Com base na morfologia celular, quantifique o número de blastos, células diferenciadas intermediárias e granulócitos maduros nas células coradas. Aqui é mostrada uma representação gráfica demonstrando a proliferação de células 32D-G-CSF-R em meios contendo interleucina-3 e fator estimulador de colônias de granulócitos. O eixo x representa os dias de tratamento.

O eixo y representa a contagem de células em escala logarítmica. O gráfico preto mostra proliferação quando as células são cultivadas em meio contendo interleucina-3. O gráfico azul mostra a diminuição da proliferação celular quando cultivada em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos.

Aqui são mostrados gráficos de pizza representativos e coloração de May-Grunwald Giemsa mostrando a proporção e morfologia de diferenciação de células 32D-G-CSF-R em meio contendo fator estimulador de colônias de granulócitos. Os gráficos de pizza demonstram a proporção de blastos, células diferenciadas intermediárias e neutrófilos no tratamento com fator estimulador de colônias de granulócitos em zero, dois, quatro e seis dias. As células coradas de Giemsa no dia zero têm grandes núcleos característicos e citoplasma escuro.

No sexto dia, o tamanho do núcleo é reduzido e o citoplasma é aumentado, mas não escuro. Aqui são mostrados gráficos de pizza representativos que mostram a maior proporção de células blásticas quando transduzidas com proteínas de fusão BCR-ABL em comparação com o vetor MSCV de controle em meios contendo fator estimulador de colônias de granulócitos. A coloração de Giemsa no painel inferior é representativa das células quando transduzidas com proteínas de controle ou de fusão BCR-ABL.

As células sofreram diferenciação neutrofílica no sexto dia quando transduzidas com o vetor controle MSCV, mas as células transduzidas por BCR-ABL mostraram principalmente células blásticas e nenhum neutrófilo maduro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de cultivar as células receptoras 32D-G-CSF nas concentrações indicadas.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de migração e experimentos de sobrevivência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como lidar com a linha celular receptora 32D-G-CSF cobrindo a manipulação genética por transdução lentiviral e retroviral, expansão, diferenciação e avaliação da proliferação e diferenciação dessas células. Não se esqueça de que trabalhar com vírus pode ser perigoso e precauções como o uso de luvas e vidro protetor devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.