Name: Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprenda a caracterizar fenótipos de células de osteossarcoma humano usando imagem quantitativa de fase sem rótulos. Este método integrado analisa morfologia, proliferação e motilidade celular simultaneamente para estudar a progressão do câncer.

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Os autores reconhecem com gratidão o apoio da Fundação de pesquisa do câncer de mama e a Advanced Medical Research Foundation.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Comissão de biossegurança institucional Hospital infantil de Boston.
1. preparação da pilha
<ol><li>
Thawing KHOS-A e células -N
	<ol>
<li>Aquecer o meio de cultura, ou seja, Dulbecco modificado suplementado águia com 10% de soro fetal bezerro (vol/vol) (FBS) e 1% (vol/vol) penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Levar os frascos criogênicos de células do tanque de nitrogênio líquido, o fundo dos frascos o mergulhe em água morna em banho maria a 37 ° C e agite-os frascos criogênicos para acelerar o processo de descongelação. Manter a tampa dos frascos criogênicos de entrar em contato com a água para evitar a contaminação. Assim que as células são descongeladas, esterilize o frasco criogênico pulverizar solução de etanol 70% e limpando o frasco.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo laminar, aspirar imediatamente a suspensão de eritrócitos do frasco criogênico e suspender suavemente em meio de cultura de 10ml aquecido (descrito em 1.1.1). Centrifugue suspensões celulares em aproximadamente 200 x g, durante 5-7 min.</li>
		<li>Ressuspender as células com meio de cultura de 10ml aquecido e transferir para um balão de T75. Pipete suavemente várias vezes para suspender células uniformemente com uma pipeta de 10 mL.</li>
		<li>Coloque o frasco em uma incubadora de 37 ° C com 5% (vol/vol) CO2 e ambiente umidificado. Permitir que as células anexar pelo menos 12 h.</li>
		<li>Incube as células por aproximadamente 3-7 dias até 80-100% de Confluencia. Altere o meio de cultura a cada 2-3 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Divisão KHOS-A e células -N
	<ol>
<li>Retire o balão, os meios de cultura.</li>
		<li>Lavar as células com 5 mL de PBS estéril (1x) sem cálcio e magnésio, para remover as células não aderentes ou fração.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para o balão, e brevemente, agite o frasco para assegurar que a tripsina-EDTA é dispersa uniformemente.</li>
		<li>Incube o frasco para 2-3 min em uma incubadora de 37 ° C ou 3-5 min à temperatura ambiente. Verifique as células sob um microscópio ampliação de aproximadamente 400 x para certificar-se que as células são arredondadas e desanexadas.</li>
		<li>Uma vez que as células são desanexadas, adicionar 10 mL de meio de cultura e pipetar suavemente o meio subindo e descendo várias vezes para quebrar agregados de células em uma suspensão de célula única usando uma pipeta de 10 mL.</li>
		<li>Contar as células usando um contador de célula. As sementes da suspensão celular novo T75 balões em uma densidade de 2 × 106 células ou um rácio de 1:4.</li>
		<li>Permitir que as células a crescer a confluência de 80-100% antes da semeadura para o experimento QPI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Células -N para QPI e semeadura KHOS-A
	<ol>
<li>Sementes KHOS-A e -N células em placas de 6-poços na densidade de 50.000-300.000 células/poço com 5 mL de meio de cultura depois de contar com um contador de célula. Nota: A densidade de semeadura é dependente da taxa de proliferação celular e o período de tempo a imagem para ter < confluência de 100% durante a aquisição de imagem.</li>
		<li>Incube as células pelo menos 12 h permitir a fixação.</li>
		<li>Mude o meio com mídia fresco antes de conduzir QPI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. QPI aquisição
<ol><li>
Lamínula, configurar
	<ol>
<li>Limpe a lamínula enxaguando-se várias vezes com água desionizada e esterilizar com solução de etanol 75% por imersão durante 15 min. colocar a lamínula em uma capa de fluxo de laminar estéril para secar.</li>
		<li>Coloque cuidadosamente o deslizamento da tampa em uma placa de 6-bem para evitar bolhas de óbvias. Certifique-se de que a parte inferior da lamínula está imerso nos meios de cultura (mínimo de 5 mL/poço).</li>
		<li>Coloque a placa em incubadora (37 ° C, 5% de CO2e umidificada atmosfera) para equilibrar pelo menos 15 min. Se formas de nevoeiro na lamínula, use um cotonete estéril para limpar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagem de células com um microscópio
	<ol>
<li>Abra o software para inicializar o sistema, incluindo auto calibração de tempo de exposição e contraste padrão ruído de holograma. Certifique-se que os valores são aceitáveis (mostrado na faixa verde ou amarela).</li>
		<li>Coloque a placa de 6 para o palco do microscópio QPI.</li>
		<li>Clique em "Captura dinâmica" e selecione "Manual" em "Foco Software." Grosseiramente, focar as imagens de fase de células, ajustando a distância de trabalho em "Configuração de microscópio" obter contornos para células em imagens de fase. Mudar para "Automático" em "Foco Software."</li>
		<li>Clique em "Nova experiência" para criar uma nova experiência. Começa com a seleção das posições de aquisição de imagem usando o mouse ou as teclas de seta no teclado numérico. Clique em "Remember" depois de cada seleção. Normalmente 3-5 locais para cada amostra são selecionados.</li>
		<li>Configurar os intervalos de imagem e o período de tempo na seção "Timelapse". Nota: Para rastrear as células cancerosas, claramente, os intervalos devem ser menores do que 5 min. 48 horas é definido como o período de tempo para a combinação de análise QPI.</li>
		<li>Inicie o experimento, clicando em "Capturar", que automaticamente irá concentrar-se e adquirir as imagens nos pontos de tempo de ajuste.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise de dados
<ol><li>
Análise de morfologia celular
	<ol>
<li>Clique em "Identificar células." Ajuste a configuração numérica para "Limiar de fundo", para que áreas de célula são separadas bem do ruído de fundo. Ajustar o número de configuração para o "Tamanho do objeto" para certificar-se de que cada célula tem um núcleo. Manter parâmetros consistentes para amostras que precisam ser comparados, como estas podem afetar as medidas de área e volume finais. Modificar manualmente os segmentos de pilha usando "Alterações manuais", se necessário.</li>
		<li>Use a função "Analisar os dados" no software para analisar as células. Começar uma nova análise de dados, clicando em "Nova análise". Arraste imagens selecionadas para os "Quadros de fonte" guia e célula morfologia parâmetros incluindo área celular (µm2) espessura ótica (µm) e volume (µm3) para cada célula individual. Escolha dispersão enredo ou histograma modo e exportar dados como tabelas ou figuras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise da proliferação de células
	<ol>
<li>Selecione pelo menos 5 imagens para os tempo diferentes pontos de interesse (por exemplo, inicial, 12h, 24h, 36h e 48 h). Número de células de registro que é fornecido pelo software.</li>
		<li>Para estimar o tempo de duplicação, plotar o número de células após normalizar com os números iniciais e se encaixam com as curvas de crescimento exponencial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de movimento de célula
	<ol>
<li>Use a função "Localizar células" no software. Clique em "Nova análise" para iniciar uma nova análise de dados. Série de arraste de imagens por um período de tempo selecionado (por exemplo, 4 h após incubação de 24h) na guia "Quadros de fonte" escolhe aleatoriamente 10-30 células clicando em células sob o modo de seleção "Adicionar células". Exclua as células com as bordas e os mover-se fora do campo de visão.</li>
		<li>Verifique cuidadosamente o acompanhamento de uma série de imagens. No caso em que o sistema perde o controle de uma célula ou faixas na cela errada, ajuste manualmente a célula de controle clicando em "Identificar" para identificar células ou clicando em "Modificar localização" sob a modalidade "Select" para modificar a localização da célula.</li>
		<li>Escolha rosa trama de trajetórias de célula em "Movimento de trama" ou trama para os outros parâmetros relacionados ao movimento em "Recursos de plotagem," como velocidade de motilidade (µm/h), motilidade (µm), migração (µm) e franqueza de migração. Exporte dados como tabelas ou figuras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%2C+vascular%2C+rheumatoid+and+other+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li>
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<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+dormancy+of+human+liposarcoma+is+associated+with+impaired+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).</li>
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<li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+induced+by+the+tumor+dormancy-associated+microRNA-190%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190.</a> Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).</li>
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<li>Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+prostate+cancer+recurrence+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9976(2015).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+surface+area+and+deformability+of+individual+human+red+blood+cells+over+blood+storage+using+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 6, 34257(2016).</li>
<li>Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-mechanical+signatures+of+cancer+cells+based+on+fluctuation+profiles+measured+by+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry.</a> Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo, descrevemos um em vitro, não-invasivo e sem rótulo método usando QPI para caracterizar quantitativamente os fenótipos angiogênico e não-angiogênico das células humanas de osteossarcoma. Vários parâmetros celulares foram analisados simultaneamente por esse método integrado de alta produtividade, incluindo área de célula, espessura de célula, volume das células, taxa de proliferação, dobrando o tempo, franqueza de migração, velocidade de motilidade, migração e mobilidade.
...

Um dos primeiros postos de controlo no desenvolvimento e progressão de um tumor sólido é a aquisição do fenótipo angiogênico, marca registrada do câncer. Esta progressão envolve uma variedade de processos bioquímicos e moleculares1,2,3. Um desafio técnico no estudo desta etapa chave na progressão do tumor é a falta de ferramentas de forma contínua e quantitativamente caracterizar e diferenciar entre fenótipos angiogênico e não-angiogênico das células de câncer ao vivo de forma imparcial. Os ensaios tradicionais sendo usados para investigar os comportamentos celulares das células angiogênico e não-angiogênico geralmente exigem instrumentos e reagentes caros, por exemplo, os ensaios de proliferação/migração celular4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 ou complementares na vivo avaliações4,5,6,8,15,16, bem como exigindo intensiva e competências significativas consumo de tempo e mão de obra.
Recentemente, a fase quantitativa de imagem (QPI) surgiu como uma nova técnica que permite a avaliação de lapso de tempo e sem rotulagem de uma variedade de celular morfologia e comportamento parâmetros17,18,19, 20 , 21 , 22. ao contrário de microscopia óptica convencional, QPI quantifica o variações de mudança de fase pixel por pixel depois a luz passa através de um objeto óptico e reconstrói um holograma com espessura ótica convertida e volume, possibilitando assim o direto análise de células vivas e as seguintes características: (1) quantitativa de imagem, imagem (2) não-invasiva e lapso de tempo, (3) livre de etiqueta de imagem e (4) simultânea de imagem multi-parâmetros. Estas características fazem QPI uma ferramenta poderosa para avaliar e compreender os processos patológicos em nível celular.
Em um recente estudo, utilizamos o QPI para quantitativamente caracterizar e diferenciar entre angiogênico KHOS-A e fenótipos de KHOS-N não-angiogênico das células de osteossarcoma humana de forma sistemática e quantitativa, combinando análises da morfologia celular, proliferação e motilidade23. Usando software de análise de imagem, um painel de células morfológica e comportamento parâmetros quantitativamente foram comparados entre as células de osteossarcoma humana angiogênico e não-angiogênico e identificaram-se cinco características diferenças entre estes dois fenótipos. Esta nova abordagem fornece uma plataforma integrada e quantitativa para avaliar uma variedade de características celulares biologicamente relevantes.

<table><tbody><tr><td>Frasco T75</td><td>Corning, NY, EUA</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços&nbsp;</td><td>Corning, NY, EUA</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio de águia modificado (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, MA, EUA</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals, GA, EUA</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, EUA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, MA, EUA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Contador Beckman Z1 Coulter</td><td>Beckman Coulter, IN, EUA</td><td>Z1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HoloMonitor M4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Suécia</td><td>M4</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Hololid</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Suécia</td><td>PHI 8020</td><td></td></tr><tr><td>HStudioM4</td><td>Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Suécia</td><td>HStudioM4</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

A aquisição do fenótipo angiogênico é um componente essencial da fuga da letargia do tumor. Embora vários clássicos em vitro ensaios (por exemplo, proliferação, migração e outros) e na vivo modelos foram desenvolvidos para investigar e caracterizar angiogênico e não-angiogênico fenótipos de célula, estes métodos são tempo trabalho intensivo e muitas vezes requerem reagentes caros e instrumentos, bem como competências significativas. Em um estudo recente, costumávamos uma novela fase quantitativa de imagem técnica (QPI) para realizar caracterizações de lapso de tempo e sem rotulagem de células KHOS humana osteossarcoma angiogênico e não-angiogênico. Um painel de parâmetros celulares, incluindo a morfologia celular, proliferação e motilidade, quantitativamente foram medidos e analisados usando QPI. Este romance e abordagem quantitativa fornece a oportunidade estudar continuamente e de forma não-invasiva relevantes processos celulares, comportamentos e características das células cancerosas e outros tipos de células de uma forma simples e integrada. Este relatório descreve nosso protocolo experimental, incluindo a preparação da pilha, QPI aquisição e análise de dados.

A Figura 1 retrata uma caracterização da morfologia típica célula. Imagens são apresentadas como holografias (figura 1A-B) e imagens 2D (Figura 1-D). Espessuras de célula óptica (calculadas a partir do índice de refração e comprimento do percurso óptico) são quantificadas através do perfil de linha ou uma medição de célula inteira. Dispersão plota da área e espessura...

Fenótipos de célula dormente e ativo câncer foram caracterizados utilizando imagens de fase quantitativa. Ensaios de proliferação, migração e morfologia celular foram integrados e analisados em um método simples.

Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar quantitativamente os fenótipos angiogênicos e não angiogênicos de células de osteossarcoma humano de maneira sistemática, combinando análises de morfologia, proliferação e motilidade celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave com relação ao estabelecimento e progressão do câncer humano. Em particular, a fuga da dormência do tumor e a troca endógena.A principal vantagem dessa técnica é que os parâmetros multicelulares podem ser analisados simultaneamente por esse método integrado e de alta propagação. Isso inclui área celular, espessura celular, volume celular, taxa de proliferação, tempo de duplicação, velocidade de motilidade, migração e motilidade. Para começar, pré-aqueça o meio de cultura a 37 graus Celsius em banho-maria.Em seguida, remova os frascos criogênicos de células de osteossarcoma humano angiogênico e não angiogênico do tanque de nitrogênio líquido. Mergulhe o fundo dos frascos em banho-maria a 37 graus Celsius e agite suavemente os frascos criogênicos para acelerar o processo de descongelamento. Assim que as células forem descongeladas, borrife o frasco com etanol a 70% e limpe o frasco para esteril

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra a identificação sem rótulos da morfologia e bioquímica dos linfócitos por meio de imagens quantitativas de fase 3D. Essa técnica permite uma análise minuciosa dos linfócitos, descobrindo suas estruturas e propriedades internas sem a necessidade de procedimentos de marcação.

Imagem de fase quantitativa tridimensional para caracterização de subtipos de linfócitos

Fonte: Parker, J. J., et al. Um modelo de cultura de fatias organotípicas de glioblastoma humano para estudo da migração de células tumorais e efeitos específicos do paciente de medicamentos anti-invasivos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra a imagem de fatias de tecido de glioblastoma expressando proteína fluorescente verde (GFP) por meio de microscopia confocal. Imagens de alta resolução são capturadas em intervalos consistentes para rastrear o movimento e a direção das células tumorais.

Imagem da migração de células tumorais em tecido de glioblastoma usando microscopia confocal de varredura com lapso de tempo

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Aqui, descrevemos um método de microscopia de lapso de tempo de longo prazo para rastrear longitudinalmente células individuais em resposta à terapêutica anticâncer.

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Descreveremos um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medições de índice de refração 3D tomograms de linfócitos apresentam 3D informações morfológicas e bioquímicas para células individuais, que é, então, analisadas com um algoritmo de aprendizado de máquina para identificação dos tipos de células.

Livre etiqueta de identificação dos subtipos de linfócito utilizando imagens tridimensionais fase quantitativa e aprendizagem de máquina

A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a taxa de iniciação de morte celular programada por imagens contínuas de folhas inoculadas após indução de morte celular.

Estudando a iniciação da morte celular usando um microscópio digital

Aqui, fornecemos um método para análise de imagem de células vivas que pode ser usado para rastrear manualmente as linhagens de queratinócitos de passagem 0 e que permite a coleta de métricas de proliferação, incluindo o destino da divisão celular e a duração do ciclo celular.

Imagens de células vivas com fotografia de lapso de tempo para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos epidérmicos

Este protocolo apresenta uma abordagem multimodal que combina espectroscopia Raman e microscopia de fase tomográfica para fenotipagem não invasiva e sem marcação de células vivas de câncer de mama humano. Ele inclui um pipeline de análise fácil de usar e livre de viés humano para análise morfoquímica rápida e quantitativa, fornecendo insights moleculares e estruturais detalhados com aplicações em pesquisa de câncer e biologia celular.

Uma estrutura de imagem multimodal para avançar a fenotipagem de células vivas de câncer de mama sem rótulos

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho baseado em tomografia por difração óptica sem marcadores para imagens em tempo real e análise quantitativa da morfodinâmica dos macrófagos. O método permite o acompanhamento contínuo da morfologia e migração de células individuais, fornecendo medições resolvidas no tempo da área projetada, perímetro e velocidade média de migração durante imagens de células vivas de longo prazo.

Imagem em tempo real sem marcação e análise quantitativa da morfodinâmica de macrófagos usando tomografia por difração óptica

Aprenda a caracterizar fenótipos de células de osteossarcoma humano usando imagem quantitativa de fase sem rótulos. Este método integrado analisa morfologia, proliferação e motilidade celular simultaneamente para estudar a progressão do câncer.

Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

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