Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

O objetivo geral deste experimento é caracterizar quantitativamente os fenótipos angiogênicos e não angiogênicos de células de osteossarcoma humano de maneira sistemática, combinando análises de morfologia, proliferação e motilidade celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave com relação ao estabelecimento e progressão do câncer humano. Em particular, a fuga da dormência do tumor e a troca endógena.

A principal vantagem dessa técnica é que os parâmetros multicelulares podem ser analisados simultaneamente por esse método integrado e de alta propagação. Isso inclui área celular, espessura celular, volume celular, taxa de proliferação, tempo de duplicação, velocidade de motilidade, migração e motilidade. Para começar, pré-aqueça o meio de cultura a 37 graus Celsius em banho-maria.

Em seguida, remova os frascos criogênicos de células de osteossarcoma humano angiogênico e não angiogênico do tanque de nitrogênio líquido. Mergulhe o fundo dos frascos em banho-maria a 37 graus Celsius e agite suavemente os frascos criogênicos para acelerar o processo de descongelamento. Assim que as células forem descongeladas, borrife o frasco com etanol a 70% e limpe o frasco para esterilizá-lo.

Em seguida, aspire imediatamente a suspensão celular do frasco e suspenda-a suavemente em 10 mililitros de meio de cultura aquecido. Em seguida, centrifugue as suspensões celulares por cinco minutos para pellet as células. De volta ao exaustor, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 10 mililitros de meio de cultura aquecido.

Em seguida, transferir a suspensão celular para um balão T75. Pipete suavemente a suspensão celular várias vezes para dispersar uniformemente as células. Colocar o balão numa incubadora e deixar as células fixarem-se durante pelo menos 12 horas.

Troque o meio de cultura a cada dois ou três dias. Quando as células atingirem 80 a 100 por cento de confluência, remova o meio de cultura do frasco e lave as células com cinco mililitros de PBS estéril sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução de EDTA a 0,25% no frasco e gire brevemente o frasco.

Incubar o frasco durante dois a três minutos e, em seguida, verificar as células ao microscópio para se certificar de que estão arredondadas e separadas. Uma vez que as células estejam separadas, use uma pipeta para adicionar 10 mililitros de meio de cultura e pipete suavemente o meio para cima e para baixo várias vezes para quebrar quaisquer agregados celulares restantes. Depois de contar as células, semeie dois milhões delas em um novo frasco T75.

Coloque o frasco em uma incubadora e cultive as células entre 80 e 100 por cento de confluência antes de semear as células para o experimento de imagem de fase quantitativa. Colher células por digestão tripson e semear células de osteossarcoma humano angiogênico e não angiogênico em seis placas de poços na densidade de 50.000 a 300.000 células por poço. Cubra as células com um total de cinco mililitros de meio de cultura.

Em seguida, incube as placas por pelo menos 12 horas para dar tempo para que as células se fixem. Substitua o meio por mídia nova antes de criar imagens. Limpe uma lamínula enxaguando-a várias vezes com água deionizada corrente.

Em seguida, mergulhe-o em uma solução de etanol a 75% por 15 minutos. Coloque a lamínula esterilizada em uma coifa de fluxo laminar para secar. Em seguida, coloque cuidadosamente a lamínula em uma placa de seis poços, evitando bolhas óbvias.

Coloque a placa na incubadora para equilibrar por pelo menos 15 minutos. Se houver neblina na tampa da placa, use um cotonete estéril para limpá-la antes da imagem. Abra o software de imagem de fase quantitativa e inicialize o sistema.

Certifique-se de que os valores sejam aceitáveis na autocalibração do tempo de exposição, contraste do padrão e ruído do holograma. Em seguida, coloque a placa de seis poços no estágio do microscópio de imagem de fase quantitativa. De volta ao software, clique em captura ao vivo.

Em seguida, vá para o menu de foco do software e selecione manual. Em seguida, vá para o menu de configuração do microscópio e foque grosseiramente as imagens de fase das células, ajustando a distância de trabalho para obter contornos para células em imagens de fase. Quando terminar, volte ao menu de foco do software e altere a configuração de foco para automático.

Agora clique em novo experimento. Comece a selecionar as posições de aquisição de imagem usando o mouse ou as teclas de seta no teclado numérico. Clique em lembrar após cada seleção.

Depois que todas as posições forem selecionadas, vá para a seção de lapso de tempo e configure os intervalos de imagem para que sejam menores que cinco minutos e o período de tempo total seja de 48 horas. Inicie o experimento clicando em capturar. Isso focará e adquirirá automaticamente imagens nas posições selecionadas em cada ponto de tempo de intervalo.

Após a aquisição da imagem, analise a morfologia das células clicando primeiro em identificar células. Ajuste a configuração numérica do limite de fundo para que as áreas das células fiquem bem separadas do ruído de fundo. Em seguida, ajuste o número de configuração do tamanho do objeto para garantir que cada célula tenha apenas um núcleo.

Modifique manualmente todos os segmentos de célula que não correspondam a esse requisito usando alterações manuais. Em seguida, use a função de análise de dados no software para analisar células. Inicie uma nova análise de dados clicando em nova análise.

Arraste as imagens selecionadas para a guia de quadros de origem e registre os parâmetros de morfologia da célula, incluindo área da célula, espessura óptica e volume de cada célula individual. Quando terminar, escolha o modo de gráfico de dispersão ou histograma e exporte os dados como tabelas ou figuras. Selecione pelo menos cinco imagens espaçadas de 12 horas e registre os números de celular fornecidos pelo software.

Estime a taxa de proliferação das células normalizando com os números iniciais das células e, em seguida, plotando os números das células. Por fim, estime o tempo de duplicação ajustando os pontos de dados usando uma curva de crescimento exponencial. Para analisar o movimento da célula, use a função de células de rastreamento no software.

Comece clicando em nova análise para iniciar uma nova análise de dados. Em seguida, arraste uma série de imagens do período de interesse para a guia de quadros de origem. Em seguida, no modo de seleção de adicionar células, escolha aleatoriamente de 10 a 30 células clicando nelas.

Certifique-se de revisar o rastreamento na série de imagens. Caso o sistema perca o controle de uma célula ou rastreie a célula errada, ajuste manualmente a célula de rastreamento clicando em identificar para identificar células ou indo para o modo de seleção e clicando em modificar local para modificar a localização de uma célula. Quando terminar, vá para plotar o movimento e escolha o gráfico de linhas das trajetórias das células ou vá para plotar recursos e plotar para os outros parâmetros relacionados ao movimento, como velocidade de motilidade, motilidade, migração e franqueza da migração.

Exporte os dados como tabelas ou figuras. Neste protocolo, imagens de fase quantitativa são apresentadas como holografias. As células mostradas aqui descrevem a morfologia celular típica para células de osteossarcoma humano angiogênicas e não angiogênicas.

A espessura da célula é calculada pelo índice de refração e comprimento do caminho óptico e é mostrada aqui como um gráfico de dispersão. Os dois diferentes tipos de fenótipos celulares exibiram diferentes padrões de distribuição e indicam que as células angiogênicas têm áreas celulares menores e uma espessura celular maior do que as células não angiogênicas. A taxa de proliferação celular dos dois tipos de células pode ser calculada a partir de imagens 2D como essas, que foram segmentadas e abrangem o curso de dois dias.

Para esses tipos de células específicas, não foram encontradas diferenças significativas. Para determinar as características de movimento celular das células, as células individuais devem ser selecionadas e rastreadas ao longo do tempo. Aqui, as células rastreadas são contornadas com cores diferentes.

Cada célula individual foi rastreada ao longo de quatro horas com sua trajetória total do caminho descrita aqui, onde o ponto zero é sua localização inicial e sua localização final é indicada pelo ponto colorido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar imagens de fase quantitativa para comparar quantitativamente uma série de parâmetros morfológicos e comportamentais celulares. Neste caso, entre fenótipos celulares angiogênicos e não angiogênicos.

Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer explorarem a fuga da dormência do tumor e o papel da angiogenecia nesse processo. Em uma plataforma contínua e sem rotulagem. Não se esqueça de que trabalhar com linhagens de células humanas pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.