Combinacional tratamento de tricostatina A e a vitamina C melhora a eficiência da clonagem de ratos por transferência Nuclear de células somáticas

O objetivo geral deste experimento é melhorar a eficiência da produção de embriões reconstruídos e camundongos clonados usando transferência nuclear de células somáticas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo básico de biologia, biologia do desenvolvimento e resgate de animais ameaçados de extinção. Como desenvolvimento embrionário, programação nuclear e conservação de pesquisa genética.

A principal vantagem deste método e técnica é que é possível gerar camundongos clonados com um nível prático de eficiência com procedimentos simples. Depois de preparar o meio de cultura de acordo com o protocolo de texto, dissolva 1,2 gramas de BSA em 10 mL de água estéril em temperatura ambiente. Adicione aproximadamente 0,12 gramas de grânulos de resina de troca iônica mista à solução BSA em temperatura ambiente com agitação suave.

Quando as contas mudarem de cor de verde azulado para dourado, use uma pipeta para recuperar a solução sobrenadante e, em seguida, substitua as contas por um novo lote. Depois de confirmar que as contas frescas não mudam de cor, recupere a solução. Em seguida, adicione 250 microlitros de bicarbonato de sódio a 10,5%.

Usando um filtro de 0,45 mícron, esterilize o sobrenadante, rotule-o como solução estoque DBSA e armazene-o a menos 20 graus Celsius. Após realizar a eutanásia em camundongos fêmeas submetidos à superovulação de acordo com o protocolo de texto, utilizou-se técnicas de dissecção padrão para incisar o abdômen para acessar o trato reprodutivo. Usando uma pequena tesoura reta e uma pinça, extirpe os ovidutos e transfira-os para uma folha de papel de filtro para limpar o sangue da superfície.

Em seguida, coloque os ovidutos em óleo mineral, use agulhas de dissecção para cortar a ampola do oviduto e mova os complexos de oócitos do cumulus provenientes da ampola para gotas de 200 microlitros de meio HCZB com 0,1% de hialuronidase. Incube o tecido em uma placa de aquecimento por cinco minutos. Sob um estereomicroscópio, confirme se as células do cumulus são liberadas dos complexos de oócitos do cumulus e, em seguida, transfira os oócitos do segundo estágio meiótico ou M2 metaphase com algumas células do cumulus restantes para o meio MKSOM contendo 0,3% DBSA.

Lave os oócitos do estágio M2 quatro vezes pipetando para cima e para baixo no meio para separar as células restantes do cumulus. Em seguida, incubar os oócitos em meio a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até a enucleação. Para isolar os oócitos desnudos dos complexos de oócitos do cumulus, sob um estereomicroscópio usando uma pipeta, transfira um pequeno número de células do cumulus remanescentes dispersas dos complexos de oócitos do cumulus para o meio HCZB com 6% de DBSA.

Coloque as células do cumulus na placa de aquecimento a 37 graus Celsius até que sejam necessárias para a transferência nuclear de células somáticas ou SCNT. Após preparar o meio PVP e as soluções estoque de CB de acordo com o protocolo de texto, use uma pipeta esterilizada com 20 microlitros de meio HCZB contendo cinco microgramas por mililitro de CB para lavar os oócitos do estágio M2. Depois de repetir a lavagem cinco vezes, incubar os ovócitos em solução de enucleação na placa de aquecimento por 10 minutos.

Em seguida, prepare a câmara de enucleação e, em seguida, use uma pipeta para transferir os oócitos M2 para a câmara. Adicione quatro microlitros de solução de enucleação e cubra a câmara com óleo mineral. Sob um microscópio à temperatura ambiente, identifique os fusos e cromossomos do oócito do estágio M2.

Em seguida, usando uma pipeta de retenção e micropipeta, oriente o oócito com um primeiro corpo polar pronunciado de modo que o posicionamento do fuso e do cromossomo esteja na posição 3:00 ou 9:00. Defina a intensidade do pulso paizo para três a seis e, usando uma pipeta de micromanipulação, perfure a zona pelúcida e abra um orifício nela. Em seguida, com uma quantidade mínima de citoplasma, enuclee completamente os fusos e cromossomos.

Sob luz visível, confirme a ausência de cromossomos no citoplasma e, em seguida, com meio MKSOM contendo 0,3% DBSA sem CB, lave bem os oócitos enucleados. Incube o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até a fusão celular. Para preparar o HBJE, adicione 260 microlitros de solução de suspensão HBJE gelada ao HVJ-E liofilizado e pipete para cima e para baixo até que esteja totalmente suspenso.

Prepare cinco alíquotas de microlitros da solução e armazene-as a 80 graus Celsius negativos até a fusão celular. Para realizar a fusão celular, use 20 microlitros de tampão de fusão celular para diluir cinco microlitros de solução HVJ-E. Coloque a solução diluída de HBJE no gelo até o uso.

Depois de preparar a câmara de fusão celular como mostrado aqui, use uma pipeta para transferir os oócitos enucleados para o meio HCZB na câmara. Adicione quatro microlitros de cada solução, conforme mostrado, e use aproximadamente um mililitro de óleo mineral para cobrir a câmara. Coloque a câmara com os oócitos enucleados à temperatura ambiente sob um microscópio com aumento de 400x.

Em seguida, usando a pipeta de micromanipulação, transfira as células doadoras para a solução de suspensão HVJ-E. Aspire as células do cumulus uma a uma para separá-las igualmente umas das outras, permitindo a fusão celular serial. Em seguida, com uma pipeta de retenção, mantenha os oócitos enucleados em meio HCZB e use o pulso paizo com a pipeta de micromanipulação para perfurar a zona pelúcida.

Depois de abrir o orifício na zona pelúcida, pipetar uma célula cumulus com aproximadamente cinco vezes o volume da solução de HVJ-E e expulsá-la firmemente na membrana do oócito sem passar pela membrana. Após a manipulação da fusão celular, transfira imediatamente os oócitos para o meio MKSOM contendo 0,3% de DBSA e mova-os para uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. As etapas de reposição precisam ser concluídas dentro de 10 minutos desde a colocação dos oócitos enucleados em meio HCVB sob o microscópio até o retorno à incubadora.

Após a fusão celular, sob um microscópio com ampliação de 400x, verifique se há condensação cromossômica prematura nos oócitos reconstruídos. Transfira os oócitos reconstruídos para um meio de ativação contendo tricostatina A, ou TSA, e incuba-os a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no ar por seis horas. Observe a formação de pró-núcleos nos embriões ENVIADOS e, em seguida, aplique mais duas horas de tratamento com TSA em meio MKSOM com 0,3% de TBSA.

Realize o tratamento com vitamina C de acordo com o protocolo de texto. Como visto nesta tabela, o tratamento com TSA e vitamina C em oócitos de camundongos clonados mostrou uma taxa muito alta de formação pró-nuclear e se desenvolveu para o estágio de duas células em todas as condições. Alguns embriões clonados, que foram derivados de células do cumulus e desenvolvidos para o estágio de duas células, foram transferidos para ovidutos de fêmeas pseudo-grávidas.

Esta figura mostra seis descendentes clonados que se desenvolveram a partir de 72 embriões transferidos produzidos a partir de três fêmeas grávidas pelo tratamento seriado de TSA e vitamina C. Finalmente, como demonstrado aqui, o tratamento com TSA e VC melhorou significativamente a eficiência do desenvolvimento embrionário in vitro para o estágio de blastocisto. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todos os meios e reagentes necessários são preparados com antecedência. O procedimento em si é um material simples de seguir e bem preparado garantirá a obtenção dos resultados esperados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir oócitos reconstruídos.