Name: Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a avaliar a permeabilidade vascular cerebral em camundongos usando traçadores fluorescentes por injeção intraperitoneal. Este método quantitativo permite analisar a disfunção da barreira hematoencefálica em doenças neurológicas.

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Os autores gostaria de reconhecer o consórcio Sphingonet, financiado pela Fundação para apoiar este trabalho de Leduq. Este trabalho também foi apoiado pelo centro de pesquisa colaborativa "diferenciação Vascular e remodelação" (CRC / Transregio23, projeto C1) e pela 7. FP, MULTIANUAIS, Goethe internacional Postdoc programa GO-IN, n. º 291776 financiamento. Reconhecemos mais Kathleen Sommer pela sua assistência técnica com ratos, manipulação e genotipagem.

Todos os animais foram tratados com o máximo cuidado, minimizando a dor ou desconforto durante o procedimento. Este procedimento segue as orientações de cuidados com animais de nossa instituição e foi aprovado pelo comitê local (Regierungspraesidium Darmstadt, número de aprovação FK/1044).
Um esquema das etapas de trabalho na vivo o ensaio de permeabilidade em camundongos é mostrado na Figura 1. Os detalhes de cada etapa são descritos abaixo.
1. animal manipulação
<ol><li>
Preparação e administração de traçadores e anestésicos
	<ol>
<li>Prepare tubos etiquetados e moldes para tecido incorporação, pelo menos, um dia antes do ensaio de permeabilidade. Manter condições estéreis em todo o protocolo, trabalhando sob a coifa limpa e usando ferramentas limpadas com 80% de etanol. Use o macho ou fêmea selvagem-tipo (WT) ou os ratos (GOF) CD1 de ganho-de-função angiopoietina-2 (Ang-2) na faixa etária adulta madura de 3-6 meses para o protocolo atual. Realize a genotipagem dos ratos conforme descrito anteriormente, 10. Nota: 80% de álcool não resultará em instrumentos estéreis, mas vai minimizar a contaminação das amostras preparadas.</li>
		<li>Diluir todos os marcadores em PBS estéril em ações de 2mm e armazenar as alíquotas protegidas da luz, a-20 ° C.</li>
		<li>Escolha dos marcadores tais como (tetrametil rodamina) TMR e (isotiocianato de fluoresceína) FITC com espectros de excitação/emissão distintos e que são lisina fixável resultando em interferência mínima entre as tinturas por microscopia de fluorescência (usando o TMR ou FITC filtrar respectivamente) e pelo fluorometry em um leitor de placa para o ensaio de permeabilidade. Nota: Dextran TMR 3 kD e dextrano FITC 3 kD utilizados no estudo são ambos lisina fixável e, portanto, pode também ser usado para fixação de pós análise imuno-histoquímica com aldeídos a fim de investigar as diferenças regionais.</li>
		<li>Lidar com todos os animais com maior cuidado, seguindo as orientações de cuidados institucionais. Injete intraperitonealmente cada rato com solução de rastreamento de 100 µ l que pode ser aumentada até 200 µ l quando um marcador adicional é combinada usando 100 µ l de cada marcador em uma mistura 1:110,13. Injete pelo menos um animal com PBS sozinho em vez dos marcadores para servir como controle de Souza para subtração de fundo de autofluorescência.</li>
		<li>5 min após a injeção do traçador, anestesiar o animal com uma injeção de IP de ketamina e xilazina (100 mg e 5-10 mg em 0,9% soro fisiológico por corpo kg peso respectivamente, 150 µ l do coquetel por rato 25 g). Nota: Pomada Vet não foi aplicada sobre os olhos durante o procedimento como o período entre animal anestesia e perfusão/sacrifício foi breve (10 minutos) onde qualquer secagem dos olhos não foi observada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Perfusão sanguínea de coleção e cardíaca
	<ol>
<li>Prepare os animais para perfusão cardíaca 10 min após a administração anestésica. Verificar a ausência de resposta de contração de pata para garantir que o animal chegou a um plano cirúrgico da anestesia.</li>
		<li>Colocar os animais nas suas costas e aplicar 80% de etanol na pele da área abdominal. Usando tesouras pequenas, abra a parede abdominal com uma pequena incisão (2 cm), logo abaixo da caixa torácica. Separar o fígado do diafragma e então lentamente através do diafragma, expondo a cavidade pleural 15.</li>
		<li>Cortar a caixa torácica bilateralmente e fixar o esterno cortado para expor o ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha de calibre 21 borboleta conectada a um sistema de perfusão peristáltica no posterior do ventrículo esquerdo.</li>
		<li>Perfure o átrio direito e rapidamente (dentro de 10 s) recolher 200-300 µ l de sangue lançado na cavidade do peito usando pontas de pipetas de 1 mL (com corte final) em tubos de colheita de soro e armazená-lo no gelo. Nota: Este procedimento de perfusão é não-sobrevivência.</li>
		<li>Assim que o sangue é colhido, ligue o sistema de perfusão (10-12 rpm, 5 mL/min) e perfundir o animal para 3 min com quente (RT) 1X PBS (livre de Ca2 + /íons de Mg2 + ). Nota: PBS contendo Ca2 +/ mg2 + íons podem ser utilizadas para melhor atividade do coração durante a perfusão. A quantidade total de PBS usado para perfusão é na faixa de 15 a 20 mL.</li>
		<li>Avaliar a qualidade da perfusão, observando a cor de fígado, rins, que aparecem branco/pálido Após a perfusão. Nota: Perfusão hepática ou renais não indicam necessariamente perfusão cerebral como as artérias (carótidas/vertebrais) atingindo o cérebro da aorta pode ser rompido durante a preparação, na etapa 3, particularmente durante a punção atrial.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. processamento do tecido
<ol><li>Armazenamento e coleta de órgãos
	<ol>
<li>Ao final da perfusão, confirme a morte do animal por deslocamento cervical e colheita cérebro e rins. Verificar perfusão cerebral pela cor dos cérebros (sem sangue visível nos vasos das meninges), a fim de excluir os animais da análise de permeabilidade quando perfusão qualidade não é boa. Separe o cérebro em 2 hemibrains usando um bisturi (Figura 1).</li>
		<li>Dissecar com um hemibrain de um bisturi livre de lóbulos olfativo e cerebelo e transferir o hemicerebrum para um tubo de 2 mL. Loja hemi-cerebelo em um tubo adicional, se necessário, para avaliação da permeabilidade cerebelar.</li>
		<li>Transferi um único rim para um outro tubo de 2 mL. Armazene as amostras imediatamente em gelo seco.</li>
		<li>Incorpore nativamente o restante do rim e hemi-cérebro (incluindo o cerebelo e os lobos olfativos) em tecido-tek ideal da temperatura de corte (O.C.T) composto em gelo seco.</li>
		<li>No final, Centrifugar as amostras de sangue armazenadas no gelo em tubos de colheita de soro no 10, 000 g, 10 min a 4 ° C. Sobrenadantes de soro de transferência para tubos de 1,5 mL e colocá-los no recipiente de gelo seco.</li>
		<li>Transferência de todas as amostras coletadas em gelo seco para freezer-80 ° C até posterior processamento. Nota: É importante congelar as amostras antes de prosseguir para as etapas de homogeneização como aumentos de eficiência de homogeneização depois como congelar descongelar.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização e centrifugação
	<ol>
<li>Descongelar no gelo os hemi-cérebro e rim amostras congeladas para baixo a-80 ° C e pesar os tubos que contêm os órgãos. Destes pesos, subtrai o valor médio de vários tubos vazios (cerca de 20) para obter o peso do tecido. Adicionar 300 µ l e 200 µ l de frio 1 X PBS para os tubos contendo o rim e hemi-cérebro, respectivamente. Nota: para a menor quantidade de tecido (como hemi-cerebelo, abaixo de 100 mg) pesar os tubos individuais é recomendado.</li>
		<li>Homogeneizar a amostra no tubo de eppendorf original com um pilão de politetrafluoretileno (PTFE) anexado a um agitador sobrecarga elétrica (1, 000 rpm), através da realização de cerca de 15 cursos (1 curso = 1 e 1 para baixo). Enxágue o pilão com PBS entre as amostras e seque antes de prosseguir para a próxima amostra. Nota: O uso de detergentes durante a homogeneização foi evitado devido a possíveis interferências com fluorometry. No entanto, palpador intracelular também é detectado no presente protocolo como o tecido é completamente homogeneizado, que é mais eficiente depois de uma rodada de congelar descongelar.</li>
		<li>Armazene as amostras homogeneizadas no gelo protegido da luz e centrifugar todos junto no final a 15.000 g, 20 min, 4 ° C em uma centrífuga do tabletop. Transferi sobrenadantes para um novos tubos de 1,5 mL no gelo para fluorometry imediata ou a-80 ° C para ser analisado mais tarde.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação e medição de fluorescência
	<ol>
<li>Se congelado no final da etapa anterior, descongele no gelo, as amostras de tecido sobrenadante e soro armazenadas a-80 ˚ c protegendo-os de luz com a folha.</li>
		<li>Pipete 50 µ l de soro diluído (30 µ l 1X PBS + 20 µ l de soro) ou sobrenadantes de tecido (como é) para uma placa 384-bem preta. Incluem pelo menos uma amostra de animal de Souza para soro e tecido sobrenadantes garantir a subtração de fundo apropriada, como este pano de fundo de homogeneizado de tecido é normalmente maior que a de PBS, usado como o diluente. Nota: Uma média de 3 animais de Souza pode ser usada para autofluorescência embora observou-se uma variabilidade muito pequena em valores de autofluorescência de Souza (dados não mostrados). A quantidade de soro usada pode ser reduzida por diluir com PBS, que também pode aumentar a relação sinal-ruído para amostras com baixa fluorescência como as amostras de cérebro. Upto 10 µ l de soro foi testado diluir com 40 µ l PBS. Certifique-se de que não há bolhas estão presentes nos poços.</li>
		<li>Insira a placa preta 384-bem o leitor e abra um novo script selecionando medição de fluorescência.</li>
		<li>Definir o ganho para o ideal e usar valores de excitação/emissão (nm) de 550/580 ou 490/520 para TMR ou FITC dyee respectivamente e iniciar a medição para obter as unidades de fluorescência cru (RFUs).</li>
		<li>Use as unidades de fluorescência cru (RFUs) do leitor de placa para calcular o índice de permeabilidade (PI), depois de subtrair os valores correspondentes de Souza.<ol>
<li>
* Índice de permeabilidade (mL/g) = (RFUs/g de tecido tecido peso) / (soro soro RFUs/mL)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Exemplo cálculo para índice de permeabilidade do cérebro (PI) do animal GOF1 (tabela 1):<ol>
<li>GOF1 cérebro RFUs - SHAM cérebro RFUs = 154-22.5 = 131.5</li>
			<li>Soro GOF1 RFUs - soro de Souza RFUs = 38305 / 27 = 38278</li>
			<li>Peso (g) do cérebro = 0,195</li>
			<li>Volume de soro (ml) = 0,02</li>
			<li>Cérebro de índice de permeabilidade (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 Nota: Os cálculos do índice de permeabilidade produzem valores que são absolutos e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. No entanto estes podem ser apresentados como rácios para facilitar a comparação entre os 2 grupos de 12. Isto pode ser conseguido dividindo o PI de cada animal em ambos os grupos, com o PI médio do grupo controle, dirigindo a média do grupo de controle através de 1 ainda mantendo a variação de animais inter no grupo controle. Essa transformação fornece valores para o grupo experimental (ou grupos) em relação ao grupo controle, definido como 1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização de imunofluorescência do tracer
	<ol>
<li>Corte os blocos de rim/hemi-cérebro nativamente no composto de tecido-tek (O.C.T) (passo 2.1) incorporados 10 µm seções em um criostato definido como-20 ° C e transferir as seções de slides colocados à temperatura ambiente. Uma vez que as seções são secas (cerca de 30 min), transferência de slides para congelador-80 ° C até o uso.</li>
		<li>No dia da coloração, descongelar os slides a 37 ° C por 10 min e em seguida fixar as seções com 4% paraformaladehyde (PFA) durante 10 minutos à temperatura ambiente seguida de lavagem rápida em PBS.</li>
		<li>Incube as secções no buffer de permeabilização/bloqueio de PBS estéril contendo 1% de BSA e 0,5% Triton X-100 pH 7,5 por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar por 1,5 h em temperatura ambiente com anticorpo primário CD31 (0,5 mg/ml, clonar o MEC 13.3), diluído em 1: 100 em tampão contendo PBS estéril, BSA de 0,5%, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) seguido de três lavagens de 5 min em PBS.</li>
		<li>Execute a incubação do anticorpo secundário no buffer acima por 1h à temperatura ambiente com espécie fluorescente etiquetado anticorpos diluído 1: 500 (2 mg/mL). Para CD31, anti-rato cabra Alexa 568 ou Alexa 488 pode ser usada em uma diluição de 1: 500. Incluir DAPI (300 µM) no anticorpo secundário mix (1:1, 000 diluição do estoque) para manchar-se para os núcleos.</li>
		<li>Montar as seções manchadas com o aqua polymount e deixá-lo durante a noite para polimerização à temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Adquira imagens usando um laser confocal de imagem espectral microscópio sistema de digitalização. Analise imagens pelo software de elementos de NIS (versão 4.3). Software como o Photoshop pode ser usado para a geração de figuras de montagem.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Disfunção da barreira hemato - encefálica está associada com um número de doenças neurológicas, incluindo tumores cerebrais primários e secundários ou derrame. Repartição BBB é frequentemente associada com edema de CNS fatais. A elucidação dos mecanismos moleculares que acionam a abertura ou encerramento do BBB é, portanto, de importância terapêutica em doenças neurológicas e comumente investigado pelos pesquisadores. No entanto, métodos para investigar BBB permeabilidade na vivo relatados na literatura, são fre...

A barreira hemato - encefálica (BBB) consiste nas células endoteliais microvasculares (ECs), apoiadas por pericitos intimamente associados (PCs), que são ensheathed na lâmina basal, e astrócitos (ACs) que envolvem a membrana basal com os pés-final1 ,2. ECs interagirem com vários tipos de células que suportam e regulam a função de barreira, principalmente ACs e PCs, e também os neurônios e microglia, que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). O NVU é crítico para a função do BBB, que limita o transporte de sangue toxinas e patógenos de entrar no cérebro. Esta função é um resultado da junção apertada-moléculas como claudin-5, occludin, zonula occludens-1, que estão presentes entre o ECs e também devido à ação de transportadores como p-glicoproteína (P-gp) o efluxo moléculas que entram o endotélio de volta para o navio lúmen1,2,3. O BBB entretanto permite o transporte de moléculas essenciais como nutrientes (glicose, ferro, aminoácidos) por transportadores específicos expressados no CE membranas de plasma1,2,3. A camada de CE é altamente polarizada em relação a distribuição de vários transportadores entre o luminal (sangue-face) e abluminal (membranas voltados para o cérebro) para permitir o transporte específico e vectorial função4,5 . Enquanto o BBB é protetor com relação a regulação firmemente no meio do CNS, é um grande desafio para a entrega de drogas CNS em doenças como a doença de Parkinson com um BBB funcional. Mesmo em doenças neurológicas com disfunção do BBB, ele não pode ser considerado que a entrega de drogas do cérebro é maior, particularmente como a disfunção da barreira poderia incluir danos para as metas de transporte específico por exemplo, como a doença de Alzheimer (AD). No anúncio, vários transportadores de amiloide beta, como o LRP1, raiva, P-gp são conhecidos por ser prejudicado e direcionamento, portanto, estes transportadores pode ser fútil6,7,8. O BBB é prejudicado em várias doenças neurológicas como meningite de acidente vascular cerebral, AD, esclerose múltipla e tumores de cérebro9,10,11. Restaurar a função de barreira é uma parte crucial da estratégia terapêutica e, portanto, sua avaliação é fundamental.
Neste trabalho, descrevemos um objectivo e quantitativo protocolo para ensaio de permeabilidade em roedores que nós aplicada com êxito a várias linhas de rato ambos doença transgénicos e experimental modelos10,12,13 ,14. O método é baseado em uma simples injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes seguido de perfusão dos ratos para remover os marcadores do compartimento vascular. Cérebro e outros órgãos são coletados post perfusão e avaliados por um objectivo de permeabilidade e índice de permeabilidade absoluta com base nas medidas de fluorescência do tecido homogenates em um leitor de placa. Todos os valores de fluorescência crus são corrigidos para o plano de fundo usando o soro de animais de Souza que não recebem qualquer marcador ou tecido homogenates. Amplas normalizações são incluídas para o volume de soro, fluorescência de soro e o peso dos tecidos, produzindo assim o índice de permeabilidade absoluta e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. Para facilitar a comparação entre os grupos, os valores de índice de permeabilidade absoluta podem ser prontamente transformados rácios como tinha anteriormente foram realizadas12. Simultaneamente, armazenado hemi-cérebro e rim poderiam ser utilizados para visualização de traçador por microscopia de fluorescência10. A microscopia de fluorescência clássico pode ser valiosa na obtenção diferença regional na permeabilidade, embora complicado devido à seleção subjetiva de imagens para uma análise semi-quantitativa e seções do tecido. As etapas detalhadas são apresentadas no protocolo e notas são adicionadas quando necessário. Isto fornece as informações necessárias para executar com êxito o ensaio de permeabilidade em vivo nos ratos que podem ser escalados para outros pequenos animais. O ensaio pode ser aplicado a vários tipos de marcadores permitindo a carga e o tamanho com base em avaliação de permeabilidade por uma combinação de marcadores com espectros de fluorescência distintas.

<table><tbody><tr><td>Tetrametil Rodamina (TMR) dextrano 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína (FITC) dextrano 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Ketavet)</td> <td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xilazina (Rompun)</td> <td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,9% Salino</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% Solução de formaldeído</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>prepara uma solução a 4%</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>anti anti CD31 de rato, clone MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti rato alexa 568</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti rato alexa 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondas Moleculares</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Agulha borboleta de calibre 21</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>soro tubo de coleta</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>Tubos eppendorf de 2mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Lenços de precisão Kimtech limpadores de tecido</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>Placa preta de 384 poços</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>slides superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>pilão de PTFE</td>Agitador elétrico <td>elétrico 358029</td><td></td> <td>Wheaton</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>leitor de placas</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td><td>Sistema</td> de perfusão peristáltica Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrífuga</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Barreira hemato - encefálica (BBB) é uma barreira especializada que protege o microambiente do cérebro de toxinas e patógenos na circulação e mantém a homeostase do cérebro. Os principais locais da barreira são células endoteliais dos capilares cerebrais cuja função de barreira resulta de junções intercelulares apertadas e transportadores de efluxo expressados na membrana plasmática. Esta função é regulada por pericitos e astrócitos que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). Várias doenças neurológicas, como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD), tumores cerebrais estão associados uma função prejudicada do BBB. Avaliação da permeabilidade do BBB é, portanto, crucial na avaliação da gravidade da doença neurológica e o sucesso das estratégias de tratamento empregado.
Apresentamos aqui um simples ainda ensaio de permeabilidade robusto que foram aplicadas com êxito ao rato vários modelos ambos, genética e experimental. O método é altamente quantitativa e objectiva em comparação com a análise de fluorescência de traçador por microscopia que é comumente aplicada. Neste método, os ratos são injectados intraperitonealmente com uma mistura de aquosas inertes marcadores fluorescentes, seguido por anestesiar os ratos. Perfusão cardíaca dos animais é executada antes da colheita, cérebro, rins ou outros órgãos. Órgãos são homogeneizados e centrifugados seguido por medição de fluorescência de sobrenadante. Sangue da punção cardíaca antes de perfusão tem finalidade de normalização para o compartimento vascular. A fluorescência de tecido é normalizada para a molhado fluorescência peso e soro para obter um quantitativo índice de permeabilidade do traçador. Para confirmação adicional, o contralateral hemi-cérebro preservado para imuno-histoquímica pode ser utilizado para fins de visualização do traçador fluorescência.

Nós recentemente demonstraram que camundongos de (GOF) angiopoietina-2 (Ang-2) ganho-de-função maior permeabilidade vascular do cérebro do que os ratos controle em condições saudáveis10. Em camundongos induzida por acidente vascular cerebral, foi também mostra que os ratos GOF tinham maiores tamanhos de infarto e permeabilidade maior do que o littermates de controle. Esses resultados mostram um papel crítico de Ang-2 na permeabilidade no BBB. O protocolo, portanto,...

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a permeabilidade da vasculatura cerebral em camundongos usando marcadores marcados com fluorescência para avaliar a disfunção da barreira hematoencefálica em modelos animais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da barreira hematoencefálica relativas à permeabilidade neurovascular em doenças e sua recuperação após a terapia. A principal vantagem deste método é que ele é simples e quantitativo.Dá a possibilidade de avaliação concorrente da permeabilidade por fluorometria, que é quantitativa, e também microscopia de fluorescência para defesas regionais. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e terapia de vários distúrbios neurológicos, incluindo tumores cerebrais, acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer, porque essas doenças estão associadas a edema cerebral com risco de vida e melhora da função BBD como um alvo terapêutico chave. Demonstrando parte do procedimento estará a Srta. Jadranka Macas, oficial de tecnologia científica do instituto.Injete intraperitonealmente camundongos com 100 microlitros de solução traçadora de dois milimolares. Escolha traçadores fixáveis em lisina, como dextranas marcadas com FITC e TMR com espectros de emissão de excitação distintos para interferência mínima entre os corantes. Se combinar traçadores, injete 200 microlitros de solução traçadora combinada por via intraperitoneal.Inclua injeções somente de veículo para servir como controles simulados para subtração de fundo de autofluorescência. Após cada injeção, aguarde cinco minutos antes de anestesiar profundamente os camundongos de acordo com os protocolos institucionais aprovados. Preparar os animais para a perfusão cardíaca 10 minutos após a administração do anestésico.Verifique a ausência de resposta de contração da pata para garantir que o camundongo tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia. Coloque o mouse para ser perfundido de costas e aplique 80% de etanol na pele da região abdominal. Depois de usar uma tesoura pequena para criar uma incisão de dois centímetros na parede abdominal, separe o fígado do diafragma e, em seguida, corte lentamente o diafragma, expondo a cavidade plural.Corte a caixa torácica bilateralmente e fixe o esterno cortado para expor o ventrículo esquerdo. Insira uma agulha borboleta de calibre 21 conectada a um sistema de perfusão peristáltica na parte posterior do ventrículo esquerdo. Perfure o átrio direito e, em seguida, use uma ponta de pipeta de um mililitro com a extremidade cortada para coletar rapidamente os 200 a 300 microlitros de sangue liberado e transfira para um tubo de coleta de soro.Armazene o sangue coletado no gelo. Assim que o sangue for coletado, ligue o sistema de perfusão e perfunda o animal por três minutos com PBS livre de íons de cálcio e magnésio em temperatura ambiente. Avalie a qualidade da perfusão observando a cor do fígado e dos rins, que parecem pálidos após a perfusão.Após a colheita do cérebro, verifique se não há sangue visível nos vasos das meninges. A amostra deve ser excluída da análise de permeabilidade se a qualidade da perfusão for ruim. Use um bisturi para separar o cérebro em dois hemicérebros.Em seguida, disseque o cerebelo e o lobo olfatório de um hemicérebro e transfira o hemicérebro para um tubo de dois mililitros. Coloque um rim colhido em outro tubo de dois mililitros. Coloque imediatamente as amostras em gelo seco.Incorpore nativamente o rim e o hemicérebro restantes com o cerebelo e os lobos olfativos intactos no composto de temperatura de corte ideal da TissueTech e coloque-o em gelo seco. Por fim, depois de centrifugar as amostras de sangue a 10.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius, transferir os sobrenadantes de soro para tubos de 1,5 mililitro e colocá-los no recipiente de gelo seco. Transfira as amostras para o freezer de 80 graus Celsius negativos à medida que a eficiência de homogeneização aumenta após o congelamento e descongelamento.Coloque as amostras de hemicérebro e rim no gelo para descongelar e, em seguida, pese os tubos contendo os órgãos. Desses pesos, subtraia o valor médio de aproximadamente 20 tubos vazios para obter o peso do tecido. Adicione 300 microlitros de PBS frio ao tubo contendo rim e 200 microlitros aos tubos contendo hemicérebro.Homogeneizar cada amostra no tubo de microcentrífuga original com um pilão de PTFE conectado a um agitador elétrico suspenso, usando cerca de 15 golpes. Armazenar as amostras homogeneizadas no gelo, ao abrigo da luz. Enxágue o pilão com PBS entre as amostras e seque antes de prosseguir para a próxima amostra.Quando todas as amostras tiverem sido homogeneizadas, centrifugue durante 20 minutos a 15 000 g e a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mililitro em gelo antes de prosseguir com a medição e quantificação de fluorescência. Transfira o sobrenadante para uma placa de 384 poços e insira a placa no leitor de fluorescência.Certifique-se de que os comprimentos de onda corretos de excitação e emissão estejam incluídos para o traçador e defina o ganho como Ideal. Inicie a medição e exporte os dados como uma planilha para realizar os cálculos conforme descrito no protocolo. No dia da coloração, descongele as seções de criostato de 10 mícrons montadas em lâminas a 37 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, fixe as seções com 4% de paraformaldeído por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de lavagem rápida em PBS. Permeabilize e bloqueie a ligação não específica nas seções incubando em PBS estéril contendo 1% de PSA e 0,5% de Triton X-100 por uma hora em temperatura ambiente. Após o bloqueio, incube as lâminas com uma diluição de um para 100 de anticorpo primário CD31 por 1,5 horas em temperatura ambiente.Depois de lavar com PBS três vezes por cinco minutos cada, execute a incubação secundária de anticorpos por uma hora em temperatura ambiente com anticorpos marcados com fluorescência específicos da espécie. Monte as seções manchadas com Aqua-Poly/Mount e deixe durante a noite para polimerização em temperatura ambiente no escuro. Finalmente, adquira imagens usando um sistema de microscópio de varredura a laser confocal de imagem espectral.Para estabelecer o tempo de circulação do traçador para o ensaio de permeabilidade, um longo tempo de circulação de duas horas é comparado a um curto tempo de circulação de 15 minutos após a injeção do traçador. O tempo de circulação mais longo de duas horas leva a baixas quantidades de acúmulo de traçadores no rim em comparação com um curto tempo de circulação de 15 minutos, potencialmente devido a um dextrano FITC de alta depuração mostrado em verde do compartimento vascular. Este efeito é ainda mais dramático no cérebro devido à barreira hematoencefálica apertada.A coloração de CD31 observada no canal vermelho confirmou a presença de vasos no rim em ambos os momentos examinados e no cérebro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada dentro de cinco a seis horas para 10 camundongos com dois cientistas trabalhando em conjunto. Ao tentar esta técnica, é importante lembrar de usar traçadores de peso molecular correto, gráfico e características de fluorescência para responder às perguntas sobre a permeabilidade da barreira hematoencefálica.Após este procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica para BBD e fatores de preenchimento da doença, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como gravidade e localização do local da doença.

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve um ensaio de permeabilidade para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro usando moléculas de fluoresceína de sódio.

Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

Este vídeo demonstra um procedimento para avaliar a ruptura da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo EAE. Corantes fluorescentes de diferentes tamanhos são injetados retroorbitalmente e circulam pelos vasos sanguíneos do cérebro. O corante menor vaza através de lacunas no tecido cerebral, enquanto o corante maior entra apenas se a ruptura for grave, correlacionando-se com a extensão do dano da barreira.

Determinando a ruptura da barreira hematoencefálica usando corantes fluorescentes em um modelo de camundongo EAE

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica baseado em uma co-cultura de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato e astrócitos é descrito e validado. Este sistema mostrou-se uma ferramenta válida para estudar o efeito da nanoformulação na permeação transbarreira de moléculas fluorescentes.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Neste estudo, apresentamos um procedimento fácil e eficiente para avaliar o rompimento da barreira hemato - encefálica em condições neurodegenerativas. Para alcançar nosso objetivo, nós infundida de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína rotulado (FITC)-albumina na jugular do mouse veia e avaliada a sua fuga para o parênquima cerebral por microscopia de fluorescência.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Direcionamento de drogas para tumores do sistema nervoso central é um grande desafio. Aqui descrevemos um protocolo para produzir um mímico in-vitro do tumor-barreira sangue-cérebro usando células murino e/ou humanas e discutir sua relevância para a previsibilidade do sistema nervoso central tumor direcionamento em vivo.

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

No presente estudo, o dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC) é administrado a camundongos via gavagem oral para avaliar a permeabilidade intestinal tanto in vivo quanto em amostras plasmáticas e fecais. Como a função de barreira intestinal é afetada em muitos processos de doenças, este ensaio direto e quantitativo pode ser usado em diversas áreas de pesquisa.

Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato

Um método foi desenvolvido para visualizar o extravasamento de corante devido à quebra da barreira hematoencefálica (BBB), administrando dois corantes fluorescentes a camundongos em diferentes momentos. O uso do glicerol como crioprotetor facilitou a imuno-histoquímica na mesma amostra.

Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Este protocolo apresenta um método confiável para avaliar a integridade da barreira hematoencefálica (BHE) em modelo de peixe-zebra adulto (Danio rerio) usando a avaliação baseada em corante azul de Evan, permitindo a análise qualitativa e quantitativa da desregulação neurovascular.

Visualizando o Gatekeeper: Avaliação Baseada em Corante Azul de Evan da Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica em Peixe-Zebra Adulto

Aprenda a avaliar a permeabilidade vascular cerebral em camundongos usando traçadores fluorescentes por injeção intraperitoneal. Este método quantitativo permite analisar a disfunção da barreira hematoencefálica em doenças neurológicas.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

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