Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado
10 de maio de 2019
Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.
Como os organoides recapitulam a organização estrutural nativa, bem como muitas características moleculares do epitélio intestinal in vivo, essa técnica nos permite estudar a biologia normal e os estados da doença em laboratório. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de projetar geneticamente organoides usando uma abordagem de transdução muito eficiente com baixa citotoxicidade, permitindo assim estudos funcionais desses organoides geneticamente manipulados. As implicações dessa técnica se estendem à terapia para doença intestinal porque podemos expor organoides intestinais a drogas e outros agentes ou intervenções.
Esse método pode ser aplicado para estudar processos de desenvolvimento e patológicos em outros sistemas favoráveis a culturas organoides, como tecidos mamários ou para células que crescem sob condições padrão 2D. Geralmente, indivíduos novos neste método terão sucesso com a transdução em organoides difíceis de projetar ou outras células. Primeiro tivemos a ideia desse método quando encontramos dificuldades para transdutorar nossos organoides e células-tronco.
A demonstração visual deste método é fundamental, pois a perda estrutural dos organoides pode ocorrer se as amostras não forem tratadas adequadamente durante o processo de incorporação na matriz do porão para criosectioning. Para cultivar organoides para transdução viral, culturas organoides de sementes com 200 microliters de meio de transdução por poço em uma placa de 48 poços, e incubar em uma incubadora de cultura de tecido padrão. Descongelar frascos de vírus para transdução, permitindo cerca de 50 microlitres de vírus concentrados para a transdução de cada poço em placas de 48 poços.
Em um tubo de 1,5 mililitro, misture o vírus com 12 microlitadores de uma solução de nanopartículas magnéticas e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, adicione a solução de nanopartículas magnéticas e a mistura de vírus às células a serem transduzidas. Coloque a placa de 48 poços em uma placa magnética e incuba em uma incubadora padrão de cultura tecidual por pelo menos duas horas.
Quando a transfecção viral estiver completa, transfira os aglomerados de células organoides infectados e o meio de transdução de cada poço para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante com sucção suave e esfrie os tubos que contêm a pelota no gelo por cinco minutos.
Adicione 120 microliters de matriz de membrana de porão a cada tubo, e resuspense a pelota, tubos lentamente para cima e para baixo. Sementes 30-microliter gotas da mistura matriz-célula em uma nova placa de 48 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos até que a matriz se solidifique.
Adicione o meio de transdução a cada poço e incuba em uma incubadora padrão de cultura tecidual por três a quatro dias. Após três a quatro dias, inspecione as culturas sob um microscópio leve a 10x de ampliação para garantir a organização de aglomerados celulares em estruturas organoides. Substitua suavemente o meio de transdução em cada poço por 250 microliters de cultura organoide enr médio.
Devolva a placa para a incubadora. Inicie este procedimento removendo o meio ENR por sucção suave, tomando cuidado para não perturbar a matriz de membrana do porão. Lave suavemente com 500 microliters de PBS.
Corrija os organoides adicionando um microliter de solução de 4% de paraformaldeído por poço, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos, remova a solução de paraformaldeído por sucção. Adicione suavemente um microliter de PBS por poço e, em seguida, remova o PBS por sucção suave.
Desta forma, lave duas vezes com PBS. Remova o PBS da segunda lavagem e adicione um microliter de 30% de tampão de sacarose a cada amostra. Incubar os organoides fixos em sacarose por uma hora a quatro graus Celsius para desidratar as amostras.
Remova o tampão de sacarose por sucção e adicione o suficiente para cobrir a camada de matriz em cada poço. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras em um congelador Celsius de menos 80 graus por 10 minutos ou até que o composto de incorporação fique sólido e branco.
Coloque a placa com composto de incorporação congelado à temperatura ambiente para permitir o derretimento mínimo do composto ao longo das bordas. Use um bisturi ou espátula para separar o bloco das paredes do poço. Trabalhe rapidamente para evitar o derretimento, usando fórceps para remover o bloco composto de incorporação da matriz e colocá-lo em um bloco de espécimes.
Encha o molde completamente com o composto de incorporação. Congele a menos 80 graus Celsius por 30 minutos antes de usar o bloco para secção. Este protocolo foi otimizado pela primeira transdução de organoides intestinais com vetores lentivirais ligados à GFP.
O GFP foi visualizado em cada estágio no desenvolvimento organoide, inclusive no início, quando as células criptas se organizam em estruturas semelhantes a cistos ou em momentos posteriores quando organoides formam botões. Os organoides intestinais transduzidos com sucesso foram então corrigidos, criosectionados e analisados por imagens de imunofluorescência. Nesta imagem, os núcleos estão manchados em azul, e o verde indica moléculas de adesão de células epiteliais, que demarcam fronteiras celulares.
O vermelho indica coloração lísmófera para identificar células paneth. Uma vez dominados, organoides transdutores podem ser realizados em cerca de três horas, e a incorporação de criseção organoides pode ser feita em cerca de 2 horas e meia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar no gelo ao manusear reagentes de matriz de porão.
Após a conclusão desse procedimento, a análise imunofluorescente e outros métodos para detectar proteínas ou organelas podem ser realizados para avaliar a localização ou abundância relativa. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem estados normais de biologia e doenças in vitro e também para estudos in vivo se os organoides ou células transduzidas podem ser implantados em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar vírus magneticamente rotulados para criar organoides geneticamente para criosectioning.
Por favor, não se esqueça que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar equipamentos de proteção apropriados devem ser sempre realizadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para a engenharia de organoides intestinais utilizando nanopartículas magnéticas para transdução gênica eficiente. Também detalha a geração de cortes congelados a partir desses organoides modificados, facilitando o estudo da expressão gênica e seus efeitos downstream.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Tecnologia de Organoides
Antecedentes
- Os organoides mimetizam as características estruturais e moleculares do epitélio intestinal in vivo.
- Essa técnica permite o estudo da biologia normal e de estados patológicos.
- A engenharia genética de organoides pode ser realizada com baixa citotoxicidade.
- As aplicações estendem-se à exposição a fármacos e intervenções para doenças intestinais.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para transduzir organoides.
- Permitir estudos funcionais de organoides geneticamente manipulados.
- Facilitar o estudo de processos desenvolvimentais e patológicos.
Métodos Utilizados
- Engenharia de organoides intestinais com nanopartículas magnéticas.
- Transdução com lentivírus ou retrovírus para alteração da expressão gênica.
- Geração de cortes congelados a partir de organoides modificados.
- Estudos funcionais utilizando organoides geneticamente modificados.
Resultados Principais
- Demonstrou alta eficiência na transdução de organoides difíceis de manipular geneticamente.
- Apresentou baixa citotoxicidade associada ao método de transdução.
- Forneceram informações sobre os efeitos das modificações genéticas na função dos organoides.
- Destacaram potenciais aplicações terapêuticas para doenças intestinais.
Conclusões
- O método oferece uma ferramenta poderosa para estudos de expressão gênica em organoides.
- Pode ser aplicado a diversas culturas de organoides além dos tecidos intestinais.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esta técnica para intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A engenharia genética eficiente de organoides intestinais permite a avaliação funcional rápida de alvos gênicos em um sistema fisiologicamente relevante, reduzindo a dependência de protocolos CRISPR demorados e onerosos. Esta abordagem favorece a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas ao associar modulação genética a leituras fenotípicas em estruturas epiteliais relevantes para doenças. O método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao preservar a arquitetura nativa do tecido, ao mesmo tempo que possibilita a transdução escalonável e reprodutível para estudos downstream de resposta a fármacos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação rápida de hipóteses terapêuticas por meio da transdução viral eficiente de organoides intestinais com citotoxicidade mínima.
- Valor Operacional: Reduz o tempo e o custo associados à seleção e triagem com CRISPR/Cas9, acelerando os prazos de validação de alvos.
- Valor Estratégico: Apoia a avaliação funcional da expressão ou silenciamento gênico em compartimentos de células-tronco e criptas, aumentando a confiança nos alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera organoides com capacidade de transdução adequados para análise imuno-histoquímica ou imunofluorescente de alterações na expressão gênica.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho padronizado para corte em criostato que preserva a morfologia tecidual para estudos posteriores de localização proteica.
- Valor Estratégico: Permite avaliação confiável de compostos ao possibilitar estudos de exposição a fármacos em organoides geneticamente modificados que mimetizam a organização epitelial in vivo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a avaliação da função de células-tronco intestinais e de criptas após manipulação genética, apoiando leituras funcionais relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite que organoides transduzidos sejam implantados em camundongos para análise funcional in vivo, conectando achados in vitro à validação fisiológica.
- Valor Estratégico: Apoia a previsão de respostas terapêuticas ao modelar os efeitos de fármacos sobre a expressão gênica ou a função proteica, em vez de alterações genômicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a modulação gênica rápida em organoides, apoiando a progressão da hipótese do alvo até a validação funcional antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da transdução eficiente de organoides intestinais para estudos de expressão ou silenciamento gênico.
- Triagem: Fornece organoides geneticamente modificados prontos para ensaios, com morfologia preservada, para imageamento quantitativo e leituras funcionais.
- Análises: Permite a quantificação baseada em imunofluorescência de moléculas de adesão epitelial, marcadores de lisossomos e coloração nuclear para avaliar a eficiência de transdução e fenótipos celulares.
- Pesquisa Translacional: Conecta a engenharia de organoides in vitro a estudos in vivo por meio do implante de organoides transduzidos em camundongos para análise funcional.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para manipulação genética de organoides intestinais e de outros epitélios ao longo de múltiplos alvos e campanhas de triagem de fármacos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao associar modificações genéticas a resultados funcionais em um sistema epitelial relevante para doenças.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio da transdução assistida por nanopartículas magnéticas e crioseccionamento padronizado.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não avançar ao reduzir a ambiguidade mecanicista na validação de alvos por meio de avaliação fenotípica rápida.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base nas respostas funcionais de organoides a perturbações genéticas e farmacológicas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de organoides, manipulação de vírus e preparação de nanopartículas magnéticas.
- Requer acesso a placas magnéticas, equipamentos de criostato e infraestrutura de imagem de imunofluorescência.
- Exige treinamento padronizado para evitar perda estrutural durante os passos de inclusão e seccionamento.
- Requer otimização entre diferentes tipos de organoides e sorotipos virais para obter eficiência consistente de transdução.
- Envolve precauções de biossegurança devido ao uso de vetores virais, incluindo EPI e protocolos de contenção.
