Name: Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a engenharia genética de organóides intestinais de camundongo usando nanopartículas magnéticas e vetores virais para transdução eficiente com baixa citotoxicidade. Este método permite estudos funcionais de organoides geneticamente modificados e seccionamento congelado para análise de expressão gênica.

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Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional de saúde (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), a associação americana de pulmão, a rede de saúde Allegheny-Johns Fundo de pesquisa Hopkins e as doenças digestivas Hopkins Centro núcleo de pesquisa básica.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais das instituições médicas Johns Hopkins (IACUC). Este protocolo é modificado a partir de um métodos publicados anteriormente10,11,12,13.
1. preparação de reagentes
<ol><li>Prepare um meio fresco de 293T com várias horas de antecedência e aqueça a 37 ° c em um banho de água por pelo menos 10 min antes da utilização (tabela 1).</li>
	<li>Prepare DNA plasmídeo2,13,14 para embalagens virais. (Tabela 2).</li>
	<li>Adquira todos os outros materiais necessários (tabela de materiais).</li>
</ol>2. Lentivirus ou retrovirus produção de partículas
<ol><li>Propagação de células de rim de embrião humano (HEK) 293T (Dia 1)
	<ol>
<li>Prepare 1 150 mm cultura prato por revestimento com 50 μg/mL poli-D-lisina dissolvido em fosfato tampão salina (PBS; 10 mL/prato) para 1 h à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Retire o tampão fosfato salina (PBS)/poly-D-lysine e lave o prato revestido duas vezes com 5 mL de PBS.</li>
		<li>Sementes de 293T (8 \ u201210 x 106) em meio 293T (tabela 1) a um volume total de 15 ml.</li>
		<li>Cultura 293T células durante a noite em uma incubadora padrão da cultura do tecido (37 ° c, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Transfection da pilha de HEK 293T (dia 2)
	<ol>
<li>Realize o transfection uma vez que as pilhas alcangaram 70-80% confluência (geralmente aproximadamente 24 h após a semeadura 8 \ u201210 x 106 pilhas).</li>
		<li>Preparar a mistura de transfecção utilizando uma abordagem eficiente, como uma formulação comercial de lipoalguns catiônicos (tabelas 1 \ u20122, tabela de materiais)2.<ol>
<li>Diluir o DNA de Lentivirus constrói12 (total ~ 24 ΜG de DNA plasmídeo, tabela 2) em 1,2 ml de meio de transfecção e incubar por 5 min em RT em tubos de 1,5 ml (tabela de materiais).</li>
			<li>Diluir a transfecção regente (36 μL) em 1,2 mL de meio de transfecção (tabela de materiais) e incubar em tubos de 5 ml por 5 min de acordo com as instruções do fabricante.</li>
			<li>Adicione o reagente de Lentivirus (Step 2.2.2.1) ao reagente de transfecção (passo 2.2.2.2) e misture suavemente com pipetagem lenta para cima e para baixo utilizando um Pipet de 5 mL.</li>
			<li>Incubar a mistura durante 20 min em RT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave suavemente as células de 293T com 5 mL de meio de transfecção e substitua por 10 mL de meio de transfecção.</li>
		<li>Adicione os complexos DNA-lipídicos (da etapa 2.2.2.3) gota gota ao meio das células 293T e misture cuidadosamente a mídia nos pratos de cultura movendo-se em direções horizontais e verticais para garantir a distribuição igual dos complexos DNA-lipídicos em cada prato.</li>
		<li>Incubar por 6 h em uma incubadora padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).</li>
		<li>Após a incubação, substitua a mídia por um meio de coleta de vírus fresco de 20 mL (tabela 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de vírus (dias 3 \ u20125)
	<ol>
<li>Colete meios do vírus em 50 tubos de mL, e armazene-os em um refrigerador de 4 ° c para uma concentração mais adicional.</li>
		<li>Substitua 20 mL de meio de coleta de vírus fresco a cada 24 h e cultura durante a noite (~ 24 h). Repita a coleta de mídia nos próximos 2 dias (dias 4 \ u20125).</li>
		<li>Assegure-se de que o volume total de meio coletado após o dia 5 seja ~ 60 mL (20 mL/dia x 3 dias).</li>
	</ol></li>
	<li>Concentração de vírus (dia 5)
	<ol>
<li>Centrifugue a mídia coletada (60 mL) por 5 min a 400 x g. Em seguida, passe o sobrenadante através de um filtro (0,45 μm poros) para remover quaisquer detritos celulares.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentre o vírus adicionando 15 mL de mídia de vírus filtrada em uma unidade de filtro centrífugo (tabela de materiais). Centrifugador a 2.500 x g durante 15 min a 4 ° c. Porque o vírus não pode passar através deste filtro, ele será concentrado na câmara superior do filtro.
	<ol>
<li>Aspirar o fluxo através do tubo (câmara inferior) e adicionar mais 15 mL de sobrenadante de mídia de coleta viral restante para a mesma unidade de filtro centrífugo. Centrifugador como acima (2.500 x g para 15 minutos em 4 ° c) para concentrar o vírus adicional do sobrenadante.</li>
		<li>Repita o processo usando o mesmo filtro para 60 mL de mídia de uma única placa transfilada até que a concentração desejada seja atingida (~ 100 vezes). Nota: nós tipicamente concentrar ~ 60 mL de mídia de coleta de vírus para ~ 600 μL.</li>
		<li>Retire o vírus concentrado da câmara superior do filtro utilizando um Pipet de 1 ml, depois alíquota e guarde em tubos de 1,5 ml (50 \ u201260 μl/tubo) a-80 ° c para uso posterior. Armazene partículas concentradas por até 6 \ u201212 meses.</li>
	</ol></li>
</ol>3. isolando criptas
<ol><li>Eutanizar camundongos usando CO2 de acordo com as diretrizes locais da IACUC.</li>
	<li>Coloque o animal eutanasiado nas costas e lave o abdômen pulverizando com 70% de etanol.</li>
	<li>Realize uma incisão longitudinal de linha média do esterno à virilha, incitando a pele primeiro, e depois o tecido subcutâneo.</li>
	<li>Retire o intestino delgado do estômago para o cálio.</li>
	<li>Identificar regiões de interesse dentro do intestino delgado; as criptas podem ser isoladas do duodeno, do jejuno e do íleo.</li>
	<li>Usando uma seringa de 10 mL, lave o intestino delgado isolado com tampão de dissociação de cripta (PBS pré-resfriado contendo 1 mM de ditiothreitol (DTT), 1% de penicilina/estreptomicina (sem CA2 + e mg2 +)) em um prato de cultura de tecido de 10 cm (tabela 1) o</li>
	<li>Retire o tecido adiposo periférico, e abra ou "filé" o tecido intestinal longitudinalmente em uma placa de vidro estéril (15 cm x 15 cm).</li>
	<li>Raspe delicadamente fora dos Villi epithelial intestinais usando um raspador da pilha.</li>
	<li>Corte o intestino delgado em 2 \ u20123 cm de comprimento-sábio seções.</li>
	<li>Transfira o tecido para um tubo de 15 mL contendo PBS pré-resfriado usando pinça plana (116 mm). Lave os fragmentos de tecido agitando vigorosamente à mão por ~ 30 s (movendo o tubo em direções opostas ~ 60 vezes).</li>
	<li>Refresque o PBS e repita a lavagem até que o PBS se torne desobstruído. Nota: nós normalmente lavar os fragmentos 2 \ u20123 vezes.</li>
	<li>Incubar o tecido em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de tampão de dissociação de cripta (tabela 1) por 10 min a 4 ° c em um agitador orbital em velocidade média, uma vez que o PBS é claro.</li>
	<li>Agitar vigorosamente o tubo com a mão para ~ 30 s (direções opostas ≈ 60 vezes) e transferir o tecido usando pinça plana para outro 15 mL tubo cônico contendo 10 mL de cripta dissociação buffer. Incubar esta fração no gelo. Não use a primeira fração para cultura organóide porque ele contém principalmente Villi.</li>
	<li>Repita os passos 3.11 \ u 20123.13 para 3 \ u20124 vezes, coletando cada fração e colocando-os no gelo.</li>
	<li>Selecione a fração que é enriquecida com a maior percentagem de criptas intestinais através da digitalização de 200 μL de amostras de cada fração um microscópio invertido (4x). Identificar as criptas pela morfologia típica descrita anteriormente (Figura 1a)10. Nota: Eles vão aparecer em forma redonda ou oval e contêm células Paneth granuladas. Por outro lado, as vilosidades são estruturas tipo dedo que faltam as células Paneth granulares (Figura 1b).</li>
	<li>Passe a fração selecionada através de um filtro de células de 40 μm para obter criptas de tamanho semelhante, se necessário. Alternativamente, isolar células-tronco Lgr5 + com base na citometria de fluxo para a proteína fluorescente verde (GFP) se os camundongos são cruzados sobre o fundo EGFP-Lgr5 + ou outro modelo adequado que permite a identificação de células Lgr5 +2.</li>
	<li>Conte o número total de criptas na fração selecionada da seguinte maneira.
	<ol>
<li>Pipete 50 μL da fração selecionada em um hemociômetro e conte o número de criptas usando um microscópio de luz invertido (4x). Coloque ~ 100 criptas por poço ao usar uma placa 48-bem para permitir que os experimentos de transdução em que 3 \ u20126 poços serão dutransados por condição experimental para silenciamento genético ou superexpressão.</li>
		<li>Com base no número de criptas por 50 μL, calcule o volume de buffer de dissociação da cripta necessário e transfira esse volume para um tubo de 1,5 mL. Nota: por exemplo, 10 criptas por 50 μL são contados, 6 x 50 μL ou 300 μL são necessários para as criptas 300.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugue as criptas nos tubos de 1,5-mL a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Elimine cuidadosamente o sobrenadante introduzindo suavemente a camada líquida superior e ressuscitar a pelota em 100 μL de fator de crescimento reduzida matriz de membrana basal no gelo (tabela de materiais).</li>
	<li>Semente a matriz-contendo criptas em um 37 ° c pre-aquecido 48-bem placa (30 μL/bem, ~ 100 criptas/bem). Incubar a placa em uma incubadora padrão da cultura do tecido para o minuto 5 \ u201215 para permitir a geladura da matriz (° c 37, 5% CO2).</li>
	<li>Sobreponha cada gel com 250 μL de cultura organoide (ENR) (tabela 1) e coloque as placas 48-well de volta em uma incubadora de cultura de tecidos padrão (37 ° c, 5% co2). Verific as culturas para a organização da cripta em formas pequenas, redondas, císticas após 24 h; os botões formarão após 2 \ u20125 dias.</li>
	<li>Substitua suavemente a mídia ENR a cada 3 dias. Remova os meios velhos de ENR com sucção delicada, tomando o cuidado para não tocar na matriz ao substituir meios.</li>
	<li>Culturas organoid da passagem cada 4 \ u20127 dias como descrito previamente11.</li>
</ol>4. preparação de fragmentos organóides
<ol><li>Transduce organóides uma vez que eles formam (dentro de 1 \ u20122 semanas) ou depois de ser passaged. Para uma única experiência da transdução, prepare 2 \ u20123 poços de organóides cultivados em uma placa 48-well por a circunstância com ~ 100 \ u2012200 organóides/poço ou ~ 200 \ u2012600 organóides por a condição experimental da transdução.</li>
	<li>Troca de ENR com 250 μL de mídia de transdução (tabela 1) e cultura na mídia de transdução por 3 ou mais dias ou até que os organóides adotem uma morfologia cística. Inclua o inibidor Wnt3a e ROCK (Y27632) no meio de transdução para aumentar o número de células caule e Paneth; A nicotinamida (NIC) melhora a eficiência da cultura (ver meio de transdução na tabela 1).</li>
	<li>Ruptura mecanicamente a estrutura da matriz da membrana do porão-como da abóbada com meios e uma ponta do Pipet usando um 1 mL de Pipet.</li>
	<li>Transfira os organóides e a mídia para um tubo estéril de 1,5 mL.</li>
	<li>Interromper mecanicamente a matriz mais por pipetagem com um 200 μL Pipet ~ 10 \ u201215 vezes.</li>
	<li>Centrifugue os fragmentos organóides em RT a 500 x g durante 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante com cuidado usando uma pipeta e resuma a pelota em 1 mL de meio DMEM/F12 (tabela 1).</li>
	<li>Adicionar Dispase I (6 μL a 10 mg/mL) e DNase I (2,5 μL a 10 mg/mL). Misture bem pipetando suavemente utilizando um Pipet de 1 mL.</li>
	<li>Incubar organóides a 37 ° c durante 20 min no tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de mídia ENR para encerrar a reação de dissociação; o soro no ENR encerra a reação.</li>
	<li>Passe as células organóides através de um filtro de células de 20 μm e centrifugue os fragmentos organoides em 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender fragmentos organoides com meio de transdução de 150 μL (tabela 1).</li>
</ol>5. engenharia genética de organóides ou células cripta por transdução viral
Nota: Consulte a Figura 2.
<ol><li>Aglomerados de células organóides com 200 μL de meio de transdução/poço em uma placa de 48 poços e incubar em uma incubadora padrão de cultura tecidual (37 ° c, 5% CO2). Alternativamente, coloc pilhas recentemente isoladas da cripta (~ 1.000 criptas) no meio do transdução de 200 μL/poço em uma placa 48-well e incubar em uma incubadora padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).</li>
	<li>Thaw frascos de vírus para transdução permitindo ~ 50 μL de vírus concentrado para transdução de cada poço em placas de 48 poços ou ~ 100 μL de vírus concentrado por poço em placas de 24 poços.</li>
	<li>Incubar o vírus com 12 μL de solução de nanopartículas magnéticas por 15 min em RT em um tubo de 1,5 mL (tabela 3).</li>
	<li>Adicione a mistura de solução/vírus de nanopartículas magnéticas às células a serem transacadas.</li>
	<li>Coloc a placa da cultura da pilha em uma placa magnética e incubar por pelo menos 2 h (e até ~ 6 h) em uma incubadora padrão da cultura do tecido (° c 37, 5% CO2).</li>
</ol>6. semeadura de fragmentos organóides infectados
<ol><li>Transfira os aglomerados de células organóides e meios de transdução infectados de cada poço em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugador a 500 x g durante 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante com sucção suave e Resfrie o tubo contendo o pellet no gelo por 5 min.</li>
	<li>Adicionar 120 μL de matriz de membrana basal e ressuscitar o pellet pipetando lentamente para cima e para baixo.</li>
	<li>Semente 30 μL de gotas da mistura da matriz-pilha em uma placa 48-well nova.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 ° c durante 5 u201215 min até que a matriz se solidifique.</li>
	<li>Adicione o meio da transdução a cada poço e incubar em uma incubadora padrão da cultura do tecido por 3 \ u20124 dias (37 ° c, 5% CO2).</li>
	<li>Após 3 \ u20124 dias, inspecione culturas um microscópio de luz (10x) para garantir a organização de aglomerados de células em estruturas organóides. Em seguida, substitua suavemente a mídia de transdução com 250 μL de meio ENR.</li>
	<li>Substitua a mídia a cada 3 \ u20124 dias.</li>
</ol>7. seleção (se aplicável)
<ol><li>Após 2 \ u20123 dias, adicione antibióticos ou hormonas relevantes para a seleção ao meio da transdução se apropriado. Nota: Utilizou-se a puromicina (2 μg/ml) para a seleção da transdução lentivrial, pois os plasmívoros abrigaram um gene de resistência à puromicina2,14.</li>
</ol>8. confirmação da transdução bem-sucedida e expressão gênica ou silenciamento
<ol><li>Se usando o Lentivirus fugw2,14, estimamos a eficiência da transdução medindo sinais do GFP através do microscópio fluorescente ou do fluxo cytometry.</li>
	<li>Valide o superexpressão ou o silenciamento do gene usando a reacção em cadeia reversa quantitativa do polymerase do transcriptase (RT-PCR) para a comparação quantitativa de mRNA no controle e em culturas organoid experimentais.</li>
	<li>Confirme os níveis de proteína para a expressão gênica de codificação protéica ou silenciamento por Western blot ou imunocoloração2.</li>
</ol>9. Cryosection organoid na matriz da membrana do porão
Nota: Consulte a Figura 3.
<ol><li>Remova o meio de ENR pela sucção delicada, sendo cuidadoso não perturbe a matriz da membrana do porão e lave delicadamente uma vez com 500 μL de PBS.</li>
	<li>Fixar organóides com 1,0 mL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) (tabela de materiais) em RT por 30 min.</li>
	<li>Retire a PFA por sucção e lave suavemente duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Retire a PBS por sucção e adicione 1,0 mL de tampão de sacarose a 30% a cada amostra. Incubar organóides fixos em sacarose por 1 h a 4 ° c em sala fria, geladeira ou gelo para desidratar amostras.</li>
	<li>Retire o tampão de sacarose por sucção e acrescente apenas o suficiente composto de incorporação (tabela de materiais) para cobrir a camada de matriz (~ 300 μl/poço) em cada poço.</li>
	<li>Incubar em RT por 5 min.</li>
	<li>Coloque as amostras em um freezer de-80 ° c por 10 min, ou até que o composto de incorporação se transforme sólido e branco.</li>
	<li>Coloc o prato com o composto de incorporação congelado em RT para permitir o derretimento mínimo do composto ao longo das bordas. Use um bisturi para separar o bloco das paredes do poço.</li>
	<li>Remova o bloco composto de incorporação de matrizes usando fórceps e coloque-o em um bloco de amostra (por exemplo, crimológicas), trabalhando rapidamente para evitar o derretimento.</li>
	<li>Encha o molde completamente com o composto de incorporação e congele-se em-80 ° c por 30 minutos.</li>
	<li>Use o bloco para o corte ou armazenamento em-80 ° c freezer para uso posterior.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

A cultura preliminar do epitélio intestinal adulto como organóides fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos moleculars envolvidos na função da pilha de haste, na homeostase epithelial intestinal, e na patologia1,2,3, a 4. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 possa ser usada para projetar geneticamente organóides9, ela é limitada pela necessidade de triagem e...

A capacidade de cultura de rato ou células de criptas humanas como tridimensional (3D) organóides do intestino delgado ou cólon durante períodos prolongados de tempo proporcionou um grande avanço, porque estas culturas exibem características definidoras do epitélio intestinal in vivo 1. º , 2. º , 3. organóides derivados de criptas primárias são capazes de autorenovação e autoorganização, exibindo funções celulares semelhantes aos seus tecidos de origem. Na verdade, os organóides recapitulam não só a organização estrutural das criptas in vivo, mas também muitas características moleculares, proporcionando assim ferramentas úteis para estudar a biologia normal e os Estados da doença. Para ilustrar, os estudos organoid revelaram as vias moleculars novas envolvidas na regeneração do tecido1,2,3,4,5 assim como as drogas que poderiam realçar a função em configurações patológicas6,7.
O estudo das células estaminais intestinais é de particular interesse porque o revestimento intestinal está entre os tecidos de mamíferos mais altamente regenerativos, renovando-se a cada 3-5 dias para proteger o organismo de bactérias, toxinas e outros patógenos dentro do lúmens intestinais. As pilhas de haste intestinais (ISCS) são responsáveis para esta capacidade regenerativa notável e fornecem assim um paradigma original para estudar a função adulta da pilha de haste1,2. Experimentos de linhagem-rastreamento em camundongos demonstraram que células-tronco isoladas Lgr5-positivas podem ser cultivadas para gerar organóides 3D ou ' mini-Guts ' in vitro, onde eles espelham de perto suas contrapartes in vivo. Culturas organoides também podem ser derivadas de isolados de células de cripta intestinal, constituídos por progenitores, ISCs e células Paneth, sendo que estes últimos constituem as células de nicho epitelial in vivo. Na verdade, a cultura organóide de células de cripta intestinal primária evoluiu para uma técnica relativamente rotineira que é fácil de implementar na maioria dos laboratórios usando reagentes amplamente disponíveis. Este modelo também é capaz de análise quantitativa da expressão gênica por sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e proteínas por espectrometria de massas, imuno-histoquímica, ou coloração imunofluorescente2,4,8. Além, a genética funcional pode ser estudada usando o ganho--função (superexpressão do gene ou expressão de um gene de activação do mutante) ou perda--função (silenciamento do gene ou expressão de um mutante da perda--função) aproximações2.
Importante, a baixa eficiência e a toxicidade elevada do ADN padrão do plasmídeo ou dos protocolos virais da transdução com Polybrene permanecem um obstáculo principal no campo. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 permita a edição precisa do genoma, essa abordagem requer uma seleção demorada seguida pela validação da sequência9. Aqui, apresentamos um protocolo de transdução viral para organóides intestinais primários que otimiza a entrega de partículas virais por conjugação com nanopartículas magnéticas e aplicação de um campo magnético. Principais modificações aos protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 e recomendações para aumentar a eficiência são fornecidos. Nós igualmente descrevemos uma aproximação para gerar as seções congeladas dos organóides intactos cultivados no matrigel 3D (doravante referido como a matriz ou a matriz da membrana do porão) para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemistry ou Immunofluorescent.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Meio de base para células 293T</td></tr><tr><td>DMEM/F12+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>Meio de base para meio de cultura organoide e tampão de digestão de organoides</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>Vírus plasmídeos meio de transfecção</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td>Componente do meio de coleta de vírus e meio 293T</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Componente do meio de cultura organoide e tampão de dissociação de cripta</td></tr><tr><td>PBS (sem Ca2+, Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Um tampão de lavagem e componente de tampão de dissociação de cripta</td></tr><tr><td>Mem-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>GlutamaxII</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 B</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>R& D</td><td>7150-RS-025/CF</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>Insulina recombinante humana</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278-5ml</td><td>Componente do meio de cultura organoide</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3376-100G</td><td>Componente do meio de transdução</td></tr><tr><td>Wnt3A</td><td>R& D</td><td>5036-WN-010</td><td>Componente do meio de transdução</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Millipore Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td>Componente do meio de transdução</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Componente do tampão de dissociação de criptas</td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Componente do tampão de dissociação de criptas</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4818-2MG</td><td>Componente do tampão de digestão organoide</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>Componente da matriz de tampão de digestão organoide</td></tr><tr><td>(fator de crescimento reduzido)</td> <td>Corning</td><td>356231</td><td>Usado como matriz para incorporar organoides</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Medium para transfecção na produção viral</td></tr><tr><td>ViralMag R / L</td><td>Oz Biosiences</td><td>RL40200</td><td>Partículas magnéticas de transdução viral</td></tr><tr><td>Placa magnética</td><td>Oz Biosiences</td><td>MF10000</td><td>Placa magnética para facilitar a transdução viral</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Agente de transfecção na produção viral</td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A-003-E</td><td>Revestimento para placas antes da semeadura de células 293T</td></tr><tr><td>Solução de Formaldeído a 4%</td><td>Boster</td><td>AR1068</td><td>Solução para fixar organoides</td></tr><tr><td>O.C.T composto de incorporação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4583S</td><td>Para incorporação dos organoides</td></tr><tr><td>5 mL Tubos de poliestireno Falcon</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260250</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Microscop invertido CK30</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td>para escanear e contar criptas</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 fluorescência invertida</td><td>Nikon</td><td>Axiovert 200</td><td>para visualização de fluorescência nas criptas</td></tr><tr><td>Unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana Ultracel-100</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td>Para concentrar vírus</td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &micro; m (Cell Strainer)</td><td>pluriSelect</td><td>SKU 43-50020</td><td>Para preparar fragmentos de organoides</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340</td><td>Para preparar cyrpts de tamanho semelhante após isolamento de cripta</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp; placas de cultura multipoços 48 poços (TC tratado com tampa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8937-100EA</td><td>ForD2:D37+D16:D37g fragmentos organoides Cepa</td></tr><tr><td>animal: C57BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>#000664</td><td>Para cultura organoide</td></tr></tbody></table>

engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

As culturas organoides intestinais proporcionam uma oportunidade única para investigar a biologia intestinal da célula-tronco e da cripta in vitro, embora abordagens eficientes para manipular a expressão gênica em organóides tenham feito progressos limitados nesta arena. Enquanto a tecnologia CRISPR/Cas9 permite a edição precisa do genoma das células para a geração de organoides, essa estratégia requer extensa seleção e triagem por análise de sequência, que é demorada e dispendiosa. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a transdução viral eficiente de organoids intestinais. Essa abordagem é rápida e altamente eficiente, diminuindo assim o tempo e a despesa inerentes à tecnologia CRISPR/Cas9. Nós igualmente apresentamos um protocolo para gerar seções congeladas das culturas organoid intactas para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemical ou Immunofluorescent, que pode ser usada para confirmar a expressão ou o silenciamento do gene. Após a transdução bem-sucedida de vetores virais para expressão gênica ou silenciamento é alcançada, a função de célula-tronco intestinal e cripta pode ser rapidamente avaliada. Embora a maioria dos estudos organoides empreguem ensaios in vitro, os organóides também podem ser entregues em camundongos para análises funcionais in vivo. Além disso, nossas abordagens são vantajosas para prever respostas terapêuticas às drogas porque as terapias atualmente disponíveis geralmente funcionam modulando a expressão gênica ou a função protéica em vez de alterar o genoma.

Aqui, nós descrevemos uma técnica rápida e altamente eficiente da transdução que chicotes nanopartículas magnéticas expor a um campo magnético para entregar o Lentivirus às pilhas do interesse. Com ferramentas prontamente disponíveis, aplicamos esta abordagem não só para transduce células criptárias recém-isoladas (Figura 1a), mas também para organóides (Figura 2) e outras células refratárias a abordagens de transdução mais rotin...

Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Como os organoides recapitulam a organização estrutural nativa, bem como muitas características moleculares do epitélio intestinal in vivo, essa técnica nos permite estudar a biologia normal e os estados da doença em laboratório. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de projetar geneticamente organoides usando uma abordagem de transdução muito eficiente com baixa citotoxicidade, permitindo assim estudos funcionais desses organoides geneticamente manipulados. As implicações dessa técnica se estendem à terapia para doença intestinal porque podemos expor organoides intestinais a drogas e outros agentes ou intervenções.Esse método pode ser aplicado para estudar processos de desenvolvimento e patológicos em outros sistemas favoráveis a culturas organoides, como tecidos mamários ou para células que crescem sob condições padrão 2D. Geralmente, indivíduos novos neste método terão sucesso com a transdução em organoides difíceis de projetar ou outras células. Primeiro tivemos a ideia desse método quando encontramos dificuldades para transdutorar nossos organoides e células-tronco.A demonstração visual deste método é fundamental, pois a perda estrutural dos organoides pode ocorrer se as amostras não forem tratadas adequadamente durante o processo de incorporação na matriz do porão para criosectioning. Para cultivar organoides para transdução viral, culturas organoides de sementes com 200 microliters de meio de transdução por poço em uma placa de 48 poços, e incubar em uma incubadora de cultura de tecido padrão. Descongelar frascos de vírus para transdução, permitindo cerca de 50 microlitres de vírus concentrados para a transdução de cada poço em placas de 48 poços.Em um tubo de 1,5 mililitro, misture o vírus com 12 microlitadores de uma solução de nanopartículas magnéticas e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, adicione a solução de nanopartículas magnéticas e a mistura de vírus às células a serem transduzidas. Coloque a placa de 48 poços em uma placa magnética e incuba em uma incubadora padrão de cultura tecidual por pelo menos duas horas.Quando a transfecção viral estiver completa, transfira os aglomerados de células organoides infectados e o meio de transdução de cada poço para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante com sucção suave e esfrie os tubos que contêm a pelota no gelo por cinco minutos.Adicione 120 microliters de matriz de membrana de porão a cada tubo, e resuspense a pelota, tubos lentamente para cima e para baixo. Sementes 30-microliter gotas da mistura matriz-célula em uma nova placa de 48 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos até que a matriz se solidifique.Adicione o meio de transdução a cada poço e incuba em uma incubadora padrão de cultura tecidual por três a quatro dias. Após três a quatro dias, inspecione as culturas sob um microscópio leve a 10x de ampliação para garantir a organização de aglomerados celulares em estruturas organoides. Substitua suavemente o meio de transdução em cada poço por 250 microliters de cultura organoide enr médio.Devolva a placa para a incubadora. Inicie este procedimento removendo o meio ENR por sucção suave, tomando cuidado para não perturbar a matriz de membrana do porão. Lave suavemente com 500 microliters de PBS.Corrija os organoides adicionando um microliter de solução de 4% de paraformaldeído por poço, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos, remova a solução de paraformaldeído por sucção. Adicione suavemente um microliter de PBS por poço e, em seguida, remova o PBS por sucção suave.Desta forma, lave duas vezes com PBS. Remova o PBS da segunda lavagem e adicione um microliter de 30% de tampão de sacarose a cada amostra. Incubar os organoides fixos em sacarose por uma hora a quatro graus Celsius para desidratar as amostras.Remova o tampão de sacarose por sucção e adicione o suficiente para cobrir a camada de matriz em cada poço. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras em um congelador Celsius de menos 80 graus por 10 minutos ou até que o composto de incorporação fique sólido e branco.Coloque a placa com composto de incorporação congelado à temperatura ambiente para permitir o derretimento mínimo do composto ao longo das bordas. Use um bisturi ou espátula para separar o bloco das paredes do poço. Trabalhe rapidamente para evitar o derretimento, usando fórceps para remover o bloco composto de incorporação da matriz e colocá-lo em um bloco de espécimes.Encha o molde completamente com o composto de incorporação. Congele a menos 80 graus Celsius por 30 minutos antes de usar o bloco para secção. Este protocolo foi otimizado pela primeira transdução de organoides intestinais com vetores lentivirais ligados à GFP.O GFP foi visualizado em cada estágio no desenvolvimento organoide, inclusive no início, quando as células criptas se organizam em estruturas semelhantes a cistos ou em momentos posteriores quando organoides formam botões. Os organoides intestinais transduzidos com sucesso foram então corrigidos, criosectionados e analisados por imagens de imunofluorescência. Nesta imagem, os núcleos estão manchados em azul, e o verde indica moléculas de adesão de células epiteliais, que demarcam fronteiras celulares.O vermelho indica coloração lísmófera para identificar células paneth. Uma vez dominados, organoides transdutores podem ser realizados em cerca de três horas, e a incorporação de criseção organoides pode ser feita em cerca de 2 horas e meia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar no gelo ao manusear reagentes de matriz de porão.Após a conclusão desse procedimento, a análise imunofluorescente e outros métodos para detectar proteínas ou organelas podem ser realizados para avaliar a localização ou abundância relativa. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem estados normais de biologia e doenças in vitro e também para estudos in vivo se os organoides ou células transduzidas podem ser implantados em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar vírus magneticamente rotulados para criar organoides geneticamente para criosectioning.Por favor, não se esqueça que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar equipamentos de proteção apropriados devem ser sempre realizadas ao realizar este procedimento.

genetic-engineering-primary-mouse-intestinal-organoids-using-magnetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Um método simples para determinar murino organóide tumor de cólon primário é descrito. Este método utiliza o recurso de que as células tumorais de cólon sobreviver e crescer em Organóides em meios contendo fatores de crescimento limitadas, enquanto cólon normais do epitélio não.

Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro   sistema modelo.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Este protocolo descreve as etapas para a clonagem de vários RNAs de guia único em um vetor de guia de RNA concatemer, que é de uso particular na criação de knockouts multi-genes usando a tecnologia CRISPR / Cas9. A geração de knockouts duplos em organoides intestinais é mostrada como uma possível aplicação deste método.

Um protocolo para múltiplo knockout de genes em ratos Organoids Intestinal Pequeno Usando um CRISPR-concatemer

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

Aprenda a engenharia genética de organóides intestinais de camundongo usando nanopartículas magnéticas e vetores virais para transdução eficiente com baixa citotoxicidade. Este método permite estudos funcionais de organoides geneticamente modificados e seccionamento congelado para análise de expressão gênica.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado (Vídeo) | JoVE Journal

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

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