Análise cinética de Vasculogenesis quantifica a dinâmica de Vasculogenesis e angiogênese In Vitro

O objetivo geral deste método experimental é visualizar e quantificar o processo dinâmico da vasculogênese ao longo do tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da angiogênese e vasculogênese sobre as taxas de formação de vasos e as diferenças entre os padrões estruturais da rede formada. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação de um grande número de pontos de tempo da vasculogênese, proporcionando uma oportunidade para avaliar a cinética do processo vasculogênico.

Este método pode ser aplicado a qualquer população celular ou estado patológico que afete os processos de vasculogênese ou angiogênese para o estudo de populações celulares individuais ou sistemas de co-cultura. Aproximadamente uma a duas horas antes de iniciar o experimento, pré-aqueça uma incubadora superior de estágio de microscópio a 37 graus Celsius e defina o dióxido de carbono para 5% e a umidade para 85% Encha o reservatório de umidade da incubadora se estiver vazio. Coloque a câmara de células vivas no microscópio e, em seguida, coloque uma lâmina vazia em uma das duas posições abertas dentro da câmara de células vivas.

Encha a lâmina com água destilada e ajuste um soprador secundário para 39 a 42 graus Celsius para aquecer as lâminas por baixo e minimizar a condensação. Manter a temperatura e a umidade adequadas dentro da câmara de imagem de células vivas é fundamental para o sucesso do experimento. Adicione um segundo slide como um espaço em branco até que o slide experimental possa ser adicionado.

Em seguida, adicione água aos reservatórios ao redor dos poços na segunda lâmina para imitar as condições durante o experimento de imagem. Para carregar a lâmina da câmara experimental com matriz de membrana basal, primeiro carregue uma pipeta de 20 microlitros com uma ponta de pipeta fria de 20 microlitros e use uma tesoura para cortar aproximadamente um centímetro da extremidade da ponta. Defina o volume da pipeta para um pouco maior que 10 microlitros e aspire lentamente a matriz na ponta da pipeta modificada.

Coloque imediatamente a ponta da pipeta no centro de um poço de lâmina, tocando suavemente a ponta no fundo do poço e pressione lentamente o êmbolo para empurrar a matriz para fora. Depois de adicionar a matriz a todos os 15 poços, empurre a tampa totalmente para dentro da lâmina. A pipetagem precisa e consistente dos volumes de Matrigel em cada poço é fundamental para a obtenção de imagens de contraste de fase de alta qualidade.

Em seguida, coloque a lâmina a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos ao lado de uma tampa de tubo cônico de 50 mililitros preenchida com dois a três mililitros de PBS para reduzir a desidratação da matriz. Quando a matriz estiver solidificada, remova o sobrenadante de uma cultura de células formadoras de colônias endoteliais cultivada durante a noite e lave as células com sete mililitros de PBS. Aspire a lavagem PBS e retire as células com dois a três mililitros de tripsina a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos.

Em seguida, ressuspenda as células dissociadas em três mililitros de meio de crescimento endotelial-2 para quebrar quaisquer aglomerados de células e transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois que todas as amostras de células formadoras de colônias endoteliais forem ressuspensas, prenda as células por centrifugação e ressuspenda as pastilhas em um a dois mililitros de meio de crescimento endotelial fresco. Conte o número de células viáveis em cada amostra e adicione células formadoras de colônias endoteliais suficientes em um novo tubo de 1,5 mililitro para permitir a diluição das células para 1,4 vezes 10 elevado a quarto células por 175 microlitros de concentração média.

Em seguida, misture cada master mix com pipetagem suave. Remova a tampa da lâmina e ceda 50 microlitros de cada mistura principal por poço em triplicata na lâmina. Para obter imagens das células, substitua a lâmina em branco por uma lâmina experimental e adicione água aos reservatórios ao redor das células na lâmina.

Percorra cada posição do estágio e confirme se o centro do primeiro poço está selecionado. Concentre-se nas células revestidas no poço e defina a posição Z do palco. Quando as configurações forem precisas, apague as luzes para iniciar o experimento de imagem.

Quando a imagem estiver concluída, dimensione e exporte arquivos de pilha de imagens no software Image Capture, salvando as imagens como arquivos TIFF para análise. Para analisar as imagens, arraste o arquivo Análise cinética da vasculogênese de sua pasta para a barra cinza na parte inferior da janela do software para abrir o software e clique em Salvar para adicionar o software à lista. Clique em Arquivo e Abrir para selecionar o arquivo de imagem a ser aberto ou arraste o arquivo de imagem para a barra cinza dentro do software.

Clique em Imagem, Ajustar e Brilho/Contraste para abrir a janela Brilho/Contraste. Clique em Redefinir na janela Brilho/Contraste para visualizar a imagem. Em seguida, clique em Imagem, Tipo e 8 bits para converter as imagens em 8 bits.

Selecione Ferramentas e Gerenciador de região de interesse e use uma ferramenta de seleção de formato apropriado para criar uma nova região de interesse. Clique em Adicionar para adicionar a forma de região de interesse à janela Gerenciador de Região de Interesse e clique no rótulo Região de Interesse no Gerenciador de Região de Interesse para exibir a região na imagem. Ajuste a região de interesse conforme necessário.

Quando a região estiver no lugar, clique em Imagem e, em seguida, em Cortar para cortar a imagem. Em seguida, abra o menu Editar e selecione Limpar fora para excluir os dados da imagem fora da região de interesse para cada imagem na pilha. Em seguida, abra o menu Plugins e selecione o plugin Analyze Network.

Use a seta suspensa na janela pop-up para alterar o Método de Limite e clique em OK para iniciar o processamento do software. No final da análise, uma tabela de dados e uma pilha de imagens fundidas representando representações de esqueleto e máscara serão abertas. Clique em Arquivo e Salvar como para transferir os valores numéricos para uma planilha e salve a planilha que contém os valores de dados brutos.

Clique na imagem fundida do esqueleto e da máscara e salve a pilha de imagens da máscara do esqueleto fundida e a pilha de imagens de contraste de fase cortada como arquivos TIFF. Em seguida, clique na janela Gerenciador de Região de Interesse, selecione a região de interesse usada para cortar as imagens e clique em Mais e Salvar para salvar a região de interesse para uso futuro. As redes celulares formadoras de colônias endoteliais, identificadas pela Análise Cinética da Vasculogênese, são representadas pictoricamente como representações de esqueleto e máscara para ilustrar as estruturas usadas pelo software para quantificação.

Quando a qualidade das imagens de contraste de fase é alta e o contraste suficiente é alcançado, a Análise Cinética da Vasculogênese identificará com precisão as redes celulares formadoras de colônias endoteliais, conforme indicado pelas semelhanças observadas entre a imagem de contraste de fase e as representações de Esqueleto e Máscara geradas pela Análise Cinética da Vasculogênese. Se as imagens de contraste de fase não tiverem alto contraste ou se ocorrerem artefatos de imagem, como grades, a precisão da detecção de rede será reduzida e os resultados se tornarão ambíguos. No entanto, diferentes métodos de limiar, como Média e Otsu, mostrados aqui, podem ser selecionados antes da análise no menu suspenso do software para acomodar as diferenças na qualidade da imagem.

O uso da Análise Cinética da Vasculogênese para determinar se as células formadoras de colônias endoteliais expostas ao diabetes mellitus gestacional exibem cinética alterada de formação de rede revela a formação de estrutura de rede heterogeneamente alterada em culturas de diabetes mellitus gestacional em comparação com culturas de células formadoras de colônias endoteliais de uma gravidez não complicada. De fato, as amostras de gravidez não complicada normalmente formam um número maior de redes fechadas em comparação com as amostras de diabetes mellitus gestacional. Todas as amostras de células formadoras de colônias endoteliais, no entanto, exibem um padrão bifásico de formação de redes em geral, embora as taxas de formação e o número máximo de redes alcançadas variem entre as amostras.

Seguindo este procedimento, os valores dos dados gerados pela Análise Cinética da Vasculogênese podem ser representados graficamente e analisados para determinar se as estruturas de rede formadas pelas diferentes amostras são estatisticamente diferentes e, em caso afirmativo, em quais momentos. A Análise Cinética da Vasculogênese permite o processamento eficiente de experimentos de lapso de tempo envolvendo um grande número de imagens. Uma vez dominado, a aquisição, pós-processamento e análise da imagem podem ser concluídos em dois dias se todos os sistemas estiverem funcionando corretamente.